Name: Ein 96-well Mikrotiterplatte-basierten Methode zur Überwachung der Formation und antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Candida albicans Biofilme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Lernen Sie eine 96-Well-Mikrotiterplatten-Methode zur Bildung von Candida albicans-Biofilmen und antimykotischer Empfindlichkeitsprüfung. Diese Technik ermöglicht reproduzierbare Hochdurchsatz-Screenings.

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Biofilm-bezogenen Arbeit im Labor wird durch Zuschüsse finanziert nummeriert R21DE017294 und R21AI080930 vom National Institute of Dental &amp; Craniofacial Forschung und dem Nationalen Institut für Allergien und Infektionskrankheiten (zum JLL-R.). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der NIDCR, die NIAID oder die NIH.

1. Vorbereitung von C. albicans C. albicans ist ein Risk Group 1/BSL1 Mikroorganismus. Denken Sie daran, gute aseptische / sterile Techniken für die Arbeit die Verwendung mit diesem Mikroorganismus und folgen institutionellen Verfahren für die ordnungsgemäße Entsorgung von biologischem Risikomaterial. <ol><li> Bereiten Sie eine Übernachtkultur von C. albicans in YPD (Yeast Peptone Dextrose) flüssigen Medium durch Animpfen einer Einzelkolonie von C. albicans in 25 ml YPD. </li><li> Inkubieren Kultur in einem Schüttler (ca. 180 rpm) bei 30 ° C über Nacht. Die meisten C. albicans Stämme werden als Hefezellen unter diesen Bedingungen wachsen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Nacht-Kulturen (etwa 3.000 rpm, 5-10 Minuten), waschen Sie die Zellen zweimal mit sterilem PBS und Resuspendieren die endgültige Pellet in ca. 20-25 ml RPMI 1640-Medium mit 165 mM morpholinepropanesulfonic Säure auf pH 7,0 und vorgewärmte gepuffert bei 37 ° C (von nun an dieses Medium einfach als "RPMI 1640" genannt). </li><li> Zählen von Zellen mit Hilfe eines Hämazytometer. Nach dem Zählen Herstellung einer Suspension von Zellen zu einer endgültigen Dichte von 1,0 x 10 6 Zellen / ml in RPMI 1640. Hinweis: Da Zellen eine Tendenz zur Aggregation haben, ist es wichtig, kräftig vortexen zwischen Waschen und vor dem Pipettieren. </li></ol> 2. Einrichten des 96-well Mikrotiterplatten für die Bildung des Biofilms <ol><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette 100 l von C. albicans Suspension in ausgewählten Wells der 96-well Mikrotiterplatten (-s). Fügen Sie keine Zellen in die Vertiefungen in Spalte 12, da diese als negative Kontrollen dienen wird. </li><li> Decken die gesamte Mikrotiterplatte mit seiner ursprünglichen Deckel, Dichtung mit Parafilm, statt in einen Inkubator und inkubieren für 24 h bei 37 ° C. Die Länge der Inkubation kann auf die spezifischen experimentellen Design angepasst werden. Zum Beispiel ist es möglich, die Kinetik der Bildung von Biofilmen über einen Zeitraum von 24 zu untersuchen - 48 Stunden durch Impfen mehrere Platten und-verarbeitung jede Platte zu verschiedenen Zeitpunkten (dh 2, 4, 8, 12, 24 und 48 h) </li><li> Nach Bildung von Biofilmen, mit einer Mehrkanalpipette Saugen Sie das Medium sorgfältig wie nicht zu berühren und zu stören den Biofilmen, die in jede der Vertiefungen gebildet haben. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette Platten dreimal in sterilem PBS (200 ul pro Well). Alternativ können Sie eine automatisierte Mikrotiterplatte Unterlegscheibe. Zwischen wäscht, und besonders nach dem letzten waschen, abtropfen lassen die Platten in einer umgekehrten Position durch Abtupfen mit Papiertüchern, um restliche PBS zu entfernen. An dieser Stelle Biofilme bilden auf dem Boden der Vertiefungen muss deutlich sichtbar sein, auch mit dem bloßen Auge und kann auch visualisiert werden mit einem inversen Mikroskop (Abbildung 1). Biofilme sind nun bereit, für antimykotische Empfindlichkeitsprüfung Assays verarbeitet werden. (Wenn der Hauptzweck des Experiments auf das Ausmaß der Bildung von Biofilmen zu beurteilen, werden die Platten bereit, verarbeitet mit der kolorimetrischen Methode. Dazu wird der XTT / Menadion-Reagenz (siehe Schritt 3 unten) hinzugefügt werden können und die resultierende Farbe Lesen mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät). </li></ol> 3. Antifungal Empfindlichkeitsprüfung von Biofilmen <ol><li> Ab Lager-Lösungen oder Pulver, bereiten eine funktionierende Lösung in RPMI 1640-Medium der einzelnen Antimykotika getestet werden. Typische hohen Konzentrationen sind 1.024 pg / mL für Fluconazol und 16 pg / mL für Amphotericin B und Caspofungin. Andere Konzentrationen können für unterschiedliche Mittel eingesetzt werden. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette 200 ul des hohen Arbeitsdruck Konzentration von Antimykotika in die entsprechenden Wells in Spalte 1 jeder Mikrotiterplatte mit Pilz-Biofilmen. </li><li> 100 l RPMI 1640 in jede Vertiefung in den Spalten 2 bis 10. </li><li> 100 l RPMI 1640 in die Vertiefungen in Spalte 11. </li><li> Nehmen Sie 100 ul Antimykotikum aus den Vertiefungen der Säule 1 und ergänzen die benachbarten Vertiefungen in Spalte 2 (bereits mit 100 ul Medium). </li><li> Mischen Sie den Inhalt gut durch Auf-und Abpipettieren mit einer seriellen Verdoppelung Verdünnung durchführen, und entfernen Sie die Tipps. </li><li> Wiederholen Sie die Bewegung nach rechts, bis die Vertiefungen der Spalte 10, nach dem die letzten 100 ul-Volumen aus den Vertiefungen der Säule 10 nach dem Mischen wird verworfen. Auf diese Weise haben eine Reihe von Verdoppelung Verdünnungen von Ihrem Agenten (-s) von Interesse geschaffen worden, von den meisten in Vertiefungen der Spalte 1 bis mindestens konzentriert in Vertiefungen der Spalte 10 konzentriert. Unangefochten Biofilmen in Spalte 11 wird als positive Kontrollen dienen und leere Brunnen in Spalte 12 wird als negative Kontrollen dienen. </li><li> Bedecken Sie den Teller mit den Lidern, Dichtung mit Parafilm und inkubieren für 24 -48 h bei 37 ° C. </li><li> Nach der Inkubationszeit waschen die Platten wie in Schritt 2.4 vor (3 x PBS). </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette werden 100 ul des XTT / Menadion Lösung in jede Vertiefung mit einem Pre-washed Biofilm sowie negativen Kontroll-Wells für die Messung der Hintergrund XTT-kolorimetrischen Ebenen. <ol><li> Der XTT ist eine gesättigte Lösung bei 0,5 g / L in steriler Ringer-Laktat, PBS oder Kochsalzlösung, die sich als Filter-sterilisiert mit einem 0,22 um-Filter mit einer Porengröße Bedürfnisse vorbereitet. Der XTT-Lösung ist lichtempfindlich, daher sollte es mit Alu-Folie während der Vorbereitung abgedeckt werden. Nach der Vorbereitung und Filter-sterilisiert, Aliquot in 10 mL Arbeitsvolumen und bei -70 ° C. Schützen Sie die Rohre von Licht mit Aluminiumfolie. Thaw nur so viele Röhren als für ein bestimmtes Experiment kurz vor dem Gebrauch notwendig. </li><li> Menadion als 10 mM Stammlösung in 100% Aceton, in kleineren Mengen (ca. 50 mL) aliquotiert und bei -70 ° C hergestellt Bereiten Sie die XTT / Menadion Lösung kurz vor Gebrauch durch Zugabe von 1 ul der Stammlösung von Menadion in ein Röhrchen mit 10 ml des aufgetauten XTT-Lösung. </li></ol></li><li> Decken Sie die Platten in Alufolie und im Dunkeln inkubieren für 2 h bei 37 ° C. </li><li> Entdecken Sie die Platten. Mit einer Mehrkanal-Pipette abnehmen 80 ul der resultierenden gefärbten Überstand aus jeder Vertiefung und Transfer in die entsprechenden Vertiefungen einer neuen Mikrotiterplatte. </li><li> Lesen Sie die Platte (-s) in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 490 nm. </li><li> Berechnen Sie die sessile minimalen Hemmkonzentrationen SMIC50 und SMIC80, die antimykotische Konzentrationen, bei denen eine 50% bzw. 80% Rückgang in kolorimetrischen Messungen im Vergleich zu den Kontrollbiofilmen in der Abwesenheit von Antimykotikum gebildet (in diesem Fall Werte für Spalte 11 erfasst werden, , auch nicht vergessen, um Werte aus negativen Kontrollen subtrahieren aus Brunnen in Spalte 12 mit XTT only). SMIC Ergebnisse können als Tabelle (dh mehrere Stämme gegen mehrere Antimykotika) oder alternativ für jeden einzelnen Pilz zu isolieren gegeneinander Antimykotika können als Diagramm durch Auftragen prozentuale Hemmung gegenüber antimykotische Konzentration präsentiert wird. </li></ol> Beispiel: Nach Abzug der Werte in der negativen Kontrolle, ist die durchschnittliche OD der Kontrolle Biofilmen in Spalte 11 gebildet 1,32. Die SMIC50 ist die niedrigste antimykotische Konzentration führt zu&gt; 50% ige Reduktion der kolorimetrischen Lesungen, in diesem Fall weniger als 1,32 x 50/100 = 0,66. Ebenso ist die SMIC80 den niedrigsten antimykotische Konzentration führt zu&gt; 80% ige Reduktion der kolorimetrischen Lesungen, in diesem Fall weniger als 1,32 x 20/100 = 0,264. 4. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt eine Mikrophotographie einer C. albicans Biofilm gebildet auf dem Grund eines Brunnens in einer 96-well Mikrotiterplatten aufgenommen mit einem inversen Mikroskop. Abbildung 2 zeigt XTT-kolorimetrische Messungen (OD 490-Werte) für je 11 Biofilme der C. albicans Wildtyp-Stammes in jedem der 8 verschiedenen Zeilen der gleichen 96-well Mikrotiterplatte gebildet. Abbildung 3 zeigt die Aktivität von Amphotericin B bei unterschiedlichen Konzentrationen gegen C. albicans Biofilmen; Pfeile zeigen SMIC50 und SMIC80 Werte. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. (A) Panel A zeigt eine Mikrophotographie aufgenommen mit einer Kamera an einem inversen Mikroskop eines C. albicans Biofilm auf der Unterseite des Brunnens nach Aspiration von RPMI-Medium und anschließende Waschen mit PBS gebildet. (B) A-Aufnahme eines typischen C. albicans Biofilm visualisiert mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie. Bars sind 100 um und 10 um für Platten A und B jeweils. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Die Bildung von mehreren gleichwertigen C. albicans Biofilmen in 96-well Mikrotiterplatten. Colorimetric Lesungen (OD 490 Werte) aus XTT-Assays Reduzierung von Biofilmen durch eine C gebildet albicans-Wildtyp in Vertiefungen von Mikrotiterplatten. Die Werte sind für 11 unabhängige Biofilmen in jedem der 8 verschiedenen Zeilen der gleichen 96-well Mikrotiterplatte gebildet. Ergebnisse für die verschiedenen Zeilen von one-way Varianzanalyse und mit dem Bartlett-Test auf Homogenität der Varianzen und die Bonferroni-multiple Vergleich post-Test verglichen. Keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt wurden beim Vergleich aller Paare von Zeilen einander (P&gt; 0,05). <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Typische Ergebnisse von Antimykotika Empfindlichkeitsprüfung gegen C. albicans Biofilmen. Graph typische Ergebnisse der Wirksamkeit verschiedener Amphotericin B-Konzentrationen gegen Biofilme aus einem C albicans Wildtyp-Stamm. Die Werte sind als durchschnittliche prozentuale farbmetrischen Messwerte für XTT-Assays Reduzierung im Vergleich zum Brunnen Kontrolle ausgedrückt. SMIC50 und SMIC80 Werte sind durch Pfeile angedeutet.

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</ol>

JLL-R besitzt Aktien in MicrobeHTS Technologies, Inc., die Entwicklung von Antimykotika ist. MicrobeHTS Technologies, Inc. keine finanzielle Unterstützung für diese Studien.

Hier beschreiben wir eine einfache, schnelle, kostengünstige und hoch reproduzierbare 96-well Mikrotiterplatte Modell für die Bildung von Candida Biofilmen mit einer kolorimetrischen Methode, die die Stoffwechselaktivität der Zellen Maßnahmen innerhalb des Biofilms mit XTT gekoppelt. Diese 96-well Mikrotiterplatte Modell für die Bildung von Biofilmen wurde ursprünglich für C entwickelt albicans, aber auch für andere Candida spp verwendet werden. und einfach für andere pilzliche Organi...

<table><tbody><tr><td>Sabouraud-Dextrose-Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td>Zur Herstellung von Platten für frische Subkulturen von Pilzisolaten</td></tr><tr><td>YPD: Hefe-Pepton-Dextrose</td><td>US Biological</td><td>Y2076</td><td>Medium zur Vermehrung von Übernachtkulturen in Flüssigkeit</td></tr><tr><td>RPMI-1640 ohne Natriumbicarbonat, ergänzt mit L-Glutamin</td><td>Cellgro</td><td>50-020-PB</td><td>Flüssigmedium für die Biofilmbildung</td></tr><tr><td>Morpholinpropanesulfonsäure (MOPS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td>Zur Pufferung von RPMI 1640</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Puffer für Waschschritte</td></tr><tr><td>XTT-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4251</td><td>Siehe oben für Herstellungsanweisungen</td></tr><tr><td>Ringer&amp;rsquo;s Laktat</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC0409-7953-09</td><td>Zur Herstellung der XTT-Lösung</td></tr><tr><td>Menadion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5625</td><td>Vorsicht: gefährlich bei Hautkontakt, Einatmen oder Verschlucken</td></tr><tr><td>Petri-Schalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Kegelförmige Zentrifugenröhrchen, 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Kegelförmige Zentrifugenröhrchen, 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen: Polystyrol, flachbodig, zellkulturgeeignet</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette und Pipettenspitzen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brutschrank</td><td>Jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplattenreader</td><td>Jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein 96-well mikrotiterplatte-basierten methode zur Überwachung der formation und antimykotische empfindlichkeitsprüfung von candida albicans biofilme

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans bleibt die häufigste Ursache von Pilzinfektionen in einem expandierenden Bevölkerung gefährdet Patienten und Candidiasis ist jetzt das dritte häufigste Infektion in US-Krankenhäusern. Unterschiedliche Erscheinungsformen von Candidiasis sind mit Biofilmbildung, sowohl auf dem Host-Gewebe und / oder medizinische Geräte (zB Katheter) verbunden. Biofilmbildung führt negativen klinischen Folgen, wie Zellen innerhalb des Biofilms von der Host-Immunantwort und durch die Einwirkung von Antimykotika sind geschützt. Wir haben eine einfache, schnelle und robuste In-vitro-Modell für die Bildung von C entwickelt albicans Biofilmen mit 96 well Mikrotiterplatten, die auch für Biofilm antimykotische Antibiogramm eingesetzt werden können. Die Anzeige dieses Tests kolorimetrisch, basierend auf der Reduktion von XTT (a Tetrazoliumsalz) durch metabolisch aktive Pilz Biofilm-Zellen. Ein typisches Experiment dauert ca. 24 h für die Bildung von Biofilmen, mit einer zusätzlichen 24 h für antimykotische Empfindlichkeitsprüfung. Aufgrund seiner Einfachheit und die Verwendung von allgemein verfügbaren Labor-Materialien und Geräte, demokratisiert diese Technik Biofilm-Forschung und stellt einen wichtigen Schritt in Richtung Standardisierung der antimykotischen Empfindlichkeitstestung von Pilzen Biofilmen.

Wir beschreiben eine einfache, schnelle und robuste Methode für die Bildung von<em&gt; Candida albicans</em&gt; Biofilmen mit 96 well Mikrotiterplatten und seinen Nutzen in antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Zellen in Biofilmen.

Ein 96-well Mikrotiterplatte-basierten Methode zur Überwachung der Formation und antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Candida albicans Biofilme

Candida albicans bleibt die häufigste Ursache für Pilzinfektionen in einer wachsenden Population von immungeschwächten Patienten, und die Candidose ist mittlerweile die dritthäufigste ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Biofilme von Candida albicans zu erzeugen und deren Empfindlichkeit gegenüber antimykotischen Wirkstoffen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst diese Pilz-Biofilme in den Vertiefungen von 96-Well-Mikrotiterplatten gebildet werden; anschließend werden Antimykotika zu den vorab gebildeten Biofilmen hinzugefügt und für 24 bis 48 Stunden inkubiert, gefolgt von dieser Inkubationsphase.Eine cholemetrische Methode, die die metabolische Aktivität von Zellen innerhalb der Biofilme misst, wird verwendet, um die Wirkung dieser Antimykotika zu bestimmen und die minimale Hemmkonzentration von Antimykotika gegenüber Biofilmen zu ermitteln. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Fähigkeit zur Biofilmbildung sowie die Antimykotikasuszeptibilitätsprüfung mittels einer einfachen und unkomplizierten, auf einer 96-Well-Mikrotiterplatte basierenden Methode in Kombination mit einer farbmetrischen Auslesung zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie einfach, relativ kostengünstig, hochgradig reproduzierbar ist und die Bildung mehrerer äquivalenter Biofilme ermöglicht.Außerdem ist es mit der in den meisten Forschungs- und klinischen Laboren üblichen 96-Well-Plattformtechnologie kompatibel. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von Caniden, da diese Infektionen sehr häufig mit der Biofilmbildung assoziiert sind.Unter Verwendung geeigneter mikrobiologischer Handhabungstechniken eine Schleife voller Zellen aus einer frischen Subkultur von albicans auf einer SAU-Dextrose-Kupferplatte entnehmen und in einen 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit 25 Milliliter Hefe-Pepton-Dextrose-Bouillon impfen. Die Kultur in einen Rüttelinkubator mit 180 RRM und 30 Grad Celsius stellen und über Nacht inkubieren. Nach der Übernachtkultivierung die Hefekulturen in 50-Milliliter-Konische Reagenzgläser gießen und fünf bis zehn Minuten bei 3000 RRM zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und den Pellet vortexen.Wirbeln Sie das Pellet kräftig, um die Zellen zu dispergieren. Geben Sie dann steriles PBS zum Waschen hinzu, bevor Sie die Kulturen erneut zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal, bevor Sie die Zellen erneut resuspendieren.In etwa 20 Milliliter RPMI 1640, ein Medium, das auf pH 7,0 gepuffert ist. Aus einer Lösung von 165 Millimolar Mops, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde, stellen Sie mit dieser Suspension eine Verdünnung von eins zu 100 mithilfe eines standardmäßigen Hämozytometers und eines Hellfeldmikroskops her. Zählen Sie die Zellen. Dann bereiten Sie eine endgültige Zellsuspension mit einer Konzentration von 1 × 10⁶ pro Milliliter in warmem gepuffertem RPMI 1640-Medium vor. Geben Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette jeweils 100 µL der C. albicans-Suspension in ausgewählte Vertiefungen einer sterilen 96-Loch-Flachboden-Mikrotiterplatte. Lassen Sie die Vertiefungen in Spalte 12 leer, da sie als negative Kontrollen dienen. Nachdem die Platte mit Parafilm abgedeckt und versiegelt wurde, inkubieren Sie sie 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, damit sich die Biofilme bilden können. Nach der Inkubation vorsichtig das Medium aus jedem Well aspirieren und verwerfen, wobei darauf geachtet werden muss, die am Boden entstandenen Biofilme nicht zu stören.Spülen Sie 200 Mikroliter PBS in jedes Loch und lassen Sie die Flüssigkeit ab, indem Sie die Platte vorsichtig umdrehen und auf einen Stapel Papiertücher abtupfen. Wiederholen Sie diesen Spülschritt dreimal. Zu diesem Zeitpunkt sind Biofilme mit bloßem Auge erkennbar und können mit einem invertierten Mikroskop unter Verwendung von REM visualisiert werden.Wir können erkennen, dass die Biofilme aus einem verwobenen Gemisch von Filamenten und Hefe-Zellen bestehen. Sobald die Biofilmbildung bestätigt wurde, kann die Prüfung von antimykotischen Wirkstoffen mit gepuffertem RPMI 1640-Medium beginnen; bereiten Sie Arbeitslösungen der zu testenden antimykotischen Wirkstoffe in hoher Konzentration vor. Typische hohe Konzentrationen betragen 1024 Mikrogramm pro Milliliter für Fluconazol sowie 16 Mikrogramm pro Milliliter für Amphotericin B und CASPO fungi beri.Fügen Sie anschließend 200 Mikroliter Antimykotika-Lösungen in die Vertiefungen der Spalte eins und 100 Mikroliter gepuffertes RPMI 1640-Medium in die Vertiefungen der Spalten zwei bis elf hinzu. Führen Sie eine Reihe serieller Verdoppelungsverdünnungen durch, indem Sie 100 Mikroliter der hochkonzentrierten Antimykotika-Lösungen aus den Vertiefungen der Spalte eins in die Vertiefungen der Spalte zwei übertragen.Nachdem man vorsichtig auf- und abpipettiert hat, um die Lösung zu mischen, pipettieren Sie 100 Mikroliter aus den Vertiefungen der Spalte zwei in diejenigen der Spalte drei und so weiter bis zur Spalte 10. Geben Sie keine antimykotische Lösung in die Spalte 11, da diese als positive Kontrolle dient, und entsorgen Sie die letzten 100 Mikroliter aus den Vertiefungen der Spalte 10. Alle Vertiefungen, außer diejenigen in Spalte 12.Es sollte nun ein Endvolumen von 100 Mikrolitern vorliegen. Decken Sie die Platte ab, versiegeln Sie sie mit Parafilm und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden, um die Wirkung der Antimykotika nach der Inkubation zu ermöglichen. Nachdem die Platte dreimal wie zuvor beschrieben mit PBS gewaschen wurde, geben Sie 100 Mikroliter XTT-Medion-Lösung pro Vertiefung in alle Vertiefungen, einschließlich der Negativkontrollvertiefungen.In Spalte 12. Decken Sie die Platte ab, wickeln Sie sie in Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Um die Farbentwicklung nach der Inkubation zu ermöglichen, nehmen Sie die Folie von der Platte ab.Die anfangs klare XTT-Lösung wird sich nach der Verarbeitung durch metabolisch aktive Zellen orange verfärbt haben. Übertragen Sie 80 Mikroliter der gefärbten Überstände in eine neue Mikrotiterplatte mit flachem Boden. Verwenden Sie einen kolorimetrischen Mikrotiterplattenreader, der auf eine Wellenlänge von 490 Nanometern eingestellt ist, um die Platte wie hier gezeigt auszulesen. In Abwesenheit von Antimykotika blieben die kolorimetrischen Messwerte unbehandelt.Die Biofilme des SEA-Antragstellers in verschiedenen Reihen sind äquivalent. Um zuerst die Wirkung der getesteten antimykotischen Verbindungen auszuwerten, subtrahieren Sie einen durchschnittlichen Hintergrundwert, der aus den Negativkontrollbrunnen in Spalte 12 erhalten wurde, von allen anderen Werten. Berechnen Sie anschließend die prozentuale Hemmung unter Verwendung der Positivkontrollen in Reihe 11.Da die Maximalwerte, bei denen eine 50 % oder 80 %ige Abnahme der farbmetrischen Messwerte festgestellt wird, als Cecil-Mindesthemmungskonzentrationen bekannt sind, dienen diese Werte typischerweise als Referenzmaß für die Wirksamkeit einer Verbindung. Mithilfe dieser einfachen Hochdurchsatzmethode können pilzliche Biofilme in vitro innerhalb von 24 Stunden gebildet und ausgewählte Verbindungen nach der ersten Entwicklung auf ihre antimykotische Aktivität untersucht werden.Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der medizinischen Mykologie den Weg, um die Biofilmbildung zu untersuchen und die Wirkung von antimykotischen Wirkstoffen zu prüfen. Auch die Zellen in Biofilmen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Der Test beschreibt ein schnelles Mittel zur frühen Bildung von Biofilmen in Bakterien und Pilzen zu messen. Diese Methode verwendet eine Mikrotiterplatte als Substrat für die mikrobielle Bildung von Biofilmen und der Biofilm wird visualisiert Kristallviolett Belastung. Der Test liefert entweder eine qualitative oder quantitative Assay für die frühe Bildung von Biofilmen.

Mikrotiterschale Biofilmbildung Assay

Wir haben eine hohe Dichte Microarray-Plattform bestehend aus 3D-Nano-Biofilme von...

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) für das Hochdurchsatz-Screening-Antimykotikum

Dieses Video zeigt einen In-vitro-Assay zum Screening von Antimykotika mit einem Bouillon-Mikrodilutions-Assay. Die Testverbindungen werden seriell in einer Mikrotiterplatte verdünnt und mit einem Pilzinokulum inkubiert. Nach der Inkubation wird die Platte auf Vertiefungen ohne sichtbares Pilzwachstum untersucht, um das antimykotische Potenzial der Testverbindungen und ihre minimale inhibitorische Konzentration (MIC) zu beurteilen.

Ein in vitro Bouillon-Mikrodilutionsassay für das Screening von antimykotischen Verbindungen

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik, um die Wirkung von Antikörpern auf Pilzbiofilme zu untersuchen. Der pathogene Pilz Candida tropicalis sezerniert einen Virulenzfaktor, der als Partylproteinase 2 (Sap2) sezerniert wird und die Bildung von Biofilmen erleichtert. Nach der Einführung eines hitzeinaktivierten Serums mit Sap2-spezifischen Antikörpern, die die Biofilmreifung hemmen, wird die Lebensfähigkeit der Pilzzellen mit einem chromogenen Assay bewertet.

Ein In-vitro-Assay zur Bewertung der Wirkung von Antikörpern auf den Biofilm von Candida tropicalis

Wir präsentieren ein experimentelles Verfahren zur Entwicklung von Candida albicans-Biofilmen in einem subkutanen Mausmodell. Die Quantifizierung der Pilzbiofilme erfolgte durch Bestimmung der Anzahl der koloniebildenden Einheiten und durch eine nicht-invasive Biolumineszenzbildgebung, bei der die Menge des erzeugten Lichts der Anzahl der lebensfähigen Zellen entspricht.

Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Geräts anpassbare automatisierte mikrofluidischen Biofilmbildung in Candida Albicans unter physiologischen Bedingungen Host zu visualisieren.

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Eine einfach und anpassungsfähig Brühe Microdilution Methode für das screening von Antimykotika Verbindungen und Extrakte.

Brühe Microdilution In Vitro Screening: eine einfache und schnelle Methode, um neue Antimykotika Verbindungen erkennen

Hier präsentieren wir eine schrittweise Protokoll um die mitochondriale Atmung und glykolytische Funktion in Candida Albicans untersuchen mit ein zusätzliches Flussmittel-Analyzer.

Bio-Energetik-Untersuchung von Candida Albicans mittels Real-Time extrazelluläre Flux Analyse

Um die internen Merkmale von Candida albicans Biofilmen zu sehen und zu quantifizieren, bereiten wir feste intakte Proben vor, die durch Brechungsindex-Matching geklärt werden. Dann kann die optische Schnittmikroskopie verwendet werden, um dreidimensionale Bilddaten durch die volle Dicke des Biofilms zu erhalten.

Klärende und Bildgebung Candida albicans Biofilme

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung quantitativer Daten über die antimykotische Aktivität von Peptiden und anderen Verbindungen, wie z. B. niedermolekularen Antimykotika, gegen Candida albicans. Die Verwendung der optischen Dichte anstelle der Zählung koloniebildender Einheiten zur Quantifizierung der Wachstumshemmung spart Zeit und Ressourcen.

Quantifizierung der antimykotischen Aktivität von Peptiden gegen Candida albicans

Ein 96-Well-Mikrotiterplatten-basiertes Protokoll unter Verwendung eines 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT)-Reduktionstests wird hierin beschrieben, um die Auswirkungen von Antikörpern auf Biofilme zu untersuchen, die von C. tropicalis gebildet werden. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen.

Ein löslicher Tetrazolium-basierter Reduktionstest zur Bewertung der Wirkung von Antikörpern auf Candida tropicalis-Biofilme

Lernen Sie eine 96-Well-Mikrotiterplatten-Methode zur Bildung von Candida albicans-Biofilmen und antimykotischer Empfindlichkeitsprüfung. Diese Technik ermöglicht reproduzierbare Hochdurchsatz-Screenings.

Ein 96-well Mikrotiterplatte-basierten Methode zur Überwachung der Formation und antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Candida albicans Biofilme (Video) | JoVE Journal

Ein 96-well Mikrotiterplatte-basierten Methode zur Überwachung der Formation und antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Candida albicans Biofilme

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