Ein 96-well Mikrotiterplatte-basierten Methode zur Überwachung der Formation und antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Candida albicans Biofilme

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Candida albicans-Biofilme zu bilden und ihre Empfindlichkeit gegenüber Antimykotika zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem diese Pilzbiofilme zunächst auf den Vertiefungen von 96 gebildet werden. Nun, Mikrotiterplatten und dann Antimykotika werden zu den vorgeformten Biofilmen hinzugefügt und nach dieser Inkubation 24 bis 48 Stunden lang inkubiert.

Eine cholemetrische Methode, die die metabolische Aktivität von Zellen innerhalb der Biofilme misst, wird verwendet, um die Aktivität dieser Antimykotika zu messen, um die minimale inhibitorische Konzentration von Antimykotika gegen Biofilme zu ermitteln. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Fähigkeit zur Bildung von Biofilmen und Antimykotika-Empfindlichkeitstests durch eine einfache und leicht zugängliche Methode auf Basis von 96-Well-Mikrotiterplatten in Verbindung mit einem farbmetrischen Messwert zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach, relativ kostengünstig und hochgradig reproduzierbar ist und die Bildung mehrerer äquivalenter Biofilme ermöglicht.

Darüber hinaus ist es mit der 96-Well-Plattformtechnologie kompatibel, die in den meisten Forschungs- und klinischen Labors üblich ist. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie von Caniden. Denn sehr oft sind diese Infektionen mit der Biofilmbildung verbunden.

Unter Verwendung geeigneter mikrobiologischer Handhabungstechniken wird eine Schleife voller Zellen aus einer frischen Subkultur von Albianen auf einem SAU-Dextrose-Kupferstich Alan entnommen und in einen 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit 25 Millilitern Hefe-Pepan-Dextrose-Brühe geimpft, die Kultur in einen Orbitalschüttler gegeben, auf 180 RRP M und 30 Grad Celsius eingestellt und nach der Inkubation über Nacht inkubiert. Gießen Sie die Hefekulturen in konische 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf bis 10 Minuten lang bei 3000 RBM. Entsorge den überstehenden Wirbel.

Das Pellet kräftig zur Entmischung der Zellen. Fügen Sie dann steriles PBS zum Waschen hinzu, bevor Sie die Kulturen erneut zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal, bevor Sie die Zellen erneut biegen.

In etwa 20 Millilitern RPMI 1640 wird das Medium auf pH 7,0 gepuffert. Unter Verwendung einer Lösung von 165 millimolaren Mopps und vorgewärmt auf 37 Grad Celsius aus dieser Suspension wird eine Verdünnung von eins bis 100 unter Verwendung eines Standard-Hämozytometers und eines Hellfeldmikroskops hergestellt. Zählen Sie die Zellen.

Bereiten Sie dann eine endgültige Suspension von Zellen vor, die einmal 10 der sechs pro Milliliter in warm gepuffertem RPMI 1640 verwenden. Mit einer Mehrkanalpipette werden 100 Mikroliter Seealbican-Suspension in ausgewählte Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden gegeben. Lassen Sie die Vertiefungen in Spalte 12 leer, da sie als Negativkontrollen dienen.

Nachdem Sie die Platte mit Paraform abgedeckt und versiegelt haben, inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Biofilme bilden können. Saugen Sie nach der Inkubation das Medium vorsichtig an und entsorgen Sie es aus jeder Vertiefung. Achten Sie darauf, die am Boden gebildeten Biofilme nicht zu stören.

Bei 200 Mikrolitern PBS in jede Vertiefung geben und abtropfen lassen, indem Sie die Platte vorsichtig umdrehen und auf einem Stapel Papiertücher abtupfen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Zu diesem Zeitpunkt sind Biofilme mit dem Auge erkennbar und können mit einem inversen Mikroskop unter Verwendung von REM sichtbar gemacht werden.

Wir können erkennen, dass die Biofilme aus einer miteinander verflochtenen Mischung aus Filamenten und Hefezellen bestehen. Sobald die Biofilmbildung verifiziert wurde, kann mit der Prüfung von Antimykotika mit gepuffertem RPMI 1640 Medium begonnen werden, um hochkonzentrierte Arbeitslösungen der zu testenden Antimykotika herzustellen. Typische hohe Konzentrationen sind 1024 Mikrogramm pro Milliliter für Fluconazol und 16 Mikrogramm pro Milliliter für Amphotericin B und CASPO-Pilze beri.

Geben Sie anschließend 200 Mikroliter Antimykotika in die Vertiefungen in Spalte eins und 100 Mikroliter gepuffertes RPMI 1640. Mittel bis Vertiefungen in den Spalten zwei bis 11. Führen Sie eine Reihe von seriellen Verdünnungsverdünnungen durch, indem Sie 100 Mikroliter der hochkonzentrierten Antimykotikalösungen aus den Vertiefungen der ersten Säule in die Vertiefungen der zweiten Säule überführen.

Nachdem Sie vorsichtig auf und ab pipettiert haben, pipettieren Sie 100 Mikroliter aus den Vertiefungen der zweiten Säule in die Vertiefungen der dritten Säule und so weiter bis zur 10. Spalte. Geben Sie keine antimykotische Lösung in Spalte 11, da dies als Positivkontrolle dient, und verwerfen Sie die letzten 100 Mikroliter aus den Vertiefungen der Säule 10. Alle Vertiefungen, mit Ausnahme der in Spalte 12 genannten Vertiefungen.

Sollte nun ein Endvolumen von 100 Mikrolitern haben. Decken Sie die Platte ab, verschließen Sie sie mit Parfum und inkubieren Sie sie 24 bis 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die Antimykotika nach der Inkubation wirken können. Und nachdem Sie die Platte wie zuvor beschrieben dreimal in PBS gewaschen haben, fügen Sie 100 Mikroliter XTT Medion-Lösung pro Vertiefung zu allen Vertiefungen hinzu, einschließlich der Vertiefungen der negativen Kontrollen.

In Spalte 12. Decken Sie die Platte ab, wickeln Sie sie zum Schutz vor dem Licht in Alufolie ein und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Um die Farbentwicklung nach der Inkubation zu ermöglichen, packen Sie die Platte aus.

Die anfänglich klare XTT-Lösung hat sich nach der Verarbeitung durch stoffwechselaktive Zellen orange verfärbt. 80 Mikroliter der farbigen Überstände werden auf eine frische, flache Mikrotiterplatte gegeben. Verwenden Sie ein farbmetrisches Mikrotiterplatten-Lesegerät, das auf eine Wellenlänge von 490 Nanometern eingestellt ist, um die Platte wie hier gezeigt abzulesen In Abwesenheit von Antimykotika wurden die farbmetrischen Messwerte nicht behandelt.

Die Biofilme des SEA-Antragstellers in verschiedenen Reihen sind gleichwertig. Um die Wirkung der getesteten Antimykotika zu bewerten, ist zunächst ein durchschnittlicher Hintergrundwert aus den negativen Kontrollvertiefungen in Spalte 12 von allen anderen Werten abzuziehen. Berechnen Sie als Nächstes die prozentuale Hemmung mit den Positivkontrollen in Zeile 11.

Als Maximalwerte werden die Antimykotika-Konzentrationen, bei denen eine Abnahme der farbmetrischen Messwerte um 50 % oder 80 % festgestellt wird, als minimale inhibitorische Cecil-Konzentrationen bezeichnet. Diese Werte werden typischerweise als Referenzmaß für die Wirksamkeit einer Verbindung verwendet. Mit dieser einfachen Hochdurchsatzmethode können Pilzbiofilme in vitro innerhalb von 24 Stunden gebildet werden, und ausgewählte Verbindungen können nach ihrer anfänglichen Entwicklung auf antimykotische Aktivität untersucht werden.

Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der medizinischen Mykologie den Weg, die Biofilmbildung zu erforschen und die Aktivität der Antimykotika zu untersuchen. Auch hier handelt es sich um die Zellen in Biofilmen.