Name: An Introduction to Worm Lab: von Kultivierung Worms zu Mutagenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von Pristionchus pacificus und zwei Mutagenese-Methoden (EMS und TMP/UV) zur Generierung von Mutanten. Diese Techniken ermöglichen die Identifizierung von Genfunktionen durch phänotypisches Screening.

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Diese Arbeit wurde von NSF gewähren IOB # 0615996 gefördert.

Teil 1: Vorbereiten Nematoden Nährmedien (NGM) Petrischalen Experimentelle Nematoden wie C. elegans und P. pacificus sind in der Regel im Labor auf 6 cm Petrischalen mit Nematode Growth Medium (NGM) 1 kultiviert. Würmer sind bei 20 ° C gehalten, können aber bei unterschiedlichen Temperaturen (zwischen 4 ° C - 25 ° C) bebrütet werden, abhängig von der Nematoden und experimentelles Design. Zur Vorbereitung Platten mit NGM haben Standard sterile Techniken verwendet werden, um Pilz-und Bakterienbefall zu verhindern. Es folgt das Protokoll zur NGM Platten vorbereiten: <ol><li> Wiegen Sie 15 g Agar, 2,4 g NaCl, 2 g Trypton, und 2,72 g KH 2 PO 4 in 2 L-Erlenmeyerkolben, machen Volumen bis zu 1 L mit Wasser, Autoklaven und lassen Sie es bis 60 ° C abkühlen in ein Wasserbad. </li><li> Fügen Sie 0,8 ml je 1 M CaCl 2, Cholesterin (5 mg / ml in Ethanol) und 1 M MgSO 4. Um zu verhindern, Pilz-und Bakterienbefall, 1 ml Streptomycin (100 mg / ml) und 1 ml Nystatin (10 mg / ml) kann auf jeden Liter zugesetzt werden. </li><li> Mit einem Unispense Maschine und Pflege sterilen Bedingungen, gießen Sie die Medien in die gewünschte Platten. Die Platten sollten auf ca. 2 / 3 rd gefüllt sein. Ein Standard-Durchmesser von 60 mm Platte benötigt etwa 10 ml des Mediums. Bewegen Sie sich nicht die Platten, bis der Agar vollständig gelified ist, andernfalls wird es eine unebene Oberfläche von Agar werden, was es schwierig macht Würmer auf dem Stereomikroskop konzentrieren. </li><li> Einmal getrocknet, können die Platten sofort ausgesät werden oder bei 4 ° C gelagert, bis Impfen mit Bakterien. </li></ol> Teil 2: Vorbereiten OP50 Bakterien und Aussaat NGM Petrischalen P. pacificus wird im Labor durch die Fütterung auf der E.coli-Stamm OP50 kultiviert. OP50 verfügt über eine begrenzte Wachstum auf NGM-Platten, wodurch eine dünne Rasen, der die Visualisierung der Würmer 1 erleichtert. Um zu wachsen eine Kultur des OP50 verwenden LB-Brühe: <ol><li> Add 5 g bactotryptone, 2,5 g Hefeextrakt und 2,5 g NaCl in einem 500 ml Schraubverschluss Flasche, dass das Volumen auf 500 ml mit destilliertem Wasser und Autoklaven. </li><li> Inoculate die Brühe mit einer einzigen Kolonie von OP50 von der Kultur Platte unter sterilen Bedingungen und ließ es über Nacht wachsen bei 37 ° C. </li><li> LB-OP50 ist bereit, verwendet werden können und bei 4 ° C für mehrere Monate gelagert werden, wenn die Sterilität eingehalten wird. Wenn Platten ausgesät werden müssen, eine kleine Menge der Brühe in eine kleine sterile Becher und dies wird dazu beitragen, eine Verunreinigung der Stammkultur. </li><li> Um Samen Platten, verzichten 100-120 ul des OP50 auf das 60 mm Durchmesser NGM Petrischale und wirbeln um sie zu verbreiten. </li><li> Inkubieren diese ausgesät Platten über Nacht bei Raumtemperatur für den Rasen zu wachsen. Diese ausgesät Platten können nun bei 4 ° C gelagert werden für bis zu 3 Wochen. Wenn Sie sie in umgekehrter Stellung verhindert eine schnelle Trocknung. </li></ol> Teil 3: Making a holen In diesem Abschnitt werden wir beschreiben, wie ein Pick für Würmer machen. Die Abholung wird verwendet, um Würmer von einem Ort zum anderen zu übertragen. Die Abholung ist von 30 Gauge 90% Platin 10% Iridium-Draht gemacht, obwohl einige Forscher etwas andere Metal-Kompositionen bevorzugen: <ol><li> Cut ca. 3-4 cm aus Draht, Ort, 0,5 cm davon in der Spitze einer Pasteurpipette (dessen Spitze war es, eine geringere Länge gebrochen), und dann verschließen Sie diese in das Glas über einem Bunsenbrenner. Die Länge des Drahtes ragt aus dem Glas ist ca. 3-3,5 cm, kann aber je nach individuellen Vorlieben variieren. </li><li> Glätten Sie das Ende des Drahtes, die vorstehende mit einem Hammer oder Zange. Dann biegen Sie die Abflachung nach oben, um eine Kugel zu bilden. </li><li> Glätten der scharfen Kanten der Pick mit einem Schleifpapier um eine Beschädigung des Wurms oder Agar. </li></ol> Teil 4: Picking Würmer <ol><li> Um Würmer holen, sterilisieren Platindraht auf einer Flamme und ziehen Sie die abgeflachte Spitze des Pick entlang der Bakterienrasen zur Beschichtung der Spitze mit dicken klebrigen Bakterien, dabei nicht zu durchstechen oder Beschädigung der Agar-Oberfläche. </li><li> Mit dem Stereomikroskop, sehr leicht Pinsel der klebrigen Spitze gegen den Wurm / Würmer abgeholt, bis der Wurm-Sticks an die Bakterien auf der Pick werden. </li><li> Sobald der Wurm an der Spitze des Pick, übertragen sie sofort auf die neue Platte durch Berühren oder Gleiten der Spitze des Pick gegen den Bakterienrasen der neuen Platte, und der Wurm sollte kriechen. Es ist darauf zu achten, dass die Oberfläche des Agar auf der Platte beschädigt werden, da sonst die Würmer in die Löcher so dass es schwierig ist, sie abzurufen, zu kriechen. Wenn der Wurm bleibt auf dem Pick zu lange, kann es austrocknen. </li></ol> Teil 5: EMS Mutagenese Ethylmethansulfonat (EMS) induziert ein breites Spektrum von Mutationen in dem in das Genom 2. Mutanten können durch Defekte wie Eiablage, Muskel-Defekt identifiziert werdens, Geschlechtsbestimmung, dauer Bildung, Verhalten und Gonade Bildung. Das Protokoll für EMS-Mutagenese ist ähnlich wie bei C beschrieben elegans 1. <ol><li> Bereiten Sie 500 ml (oder mehr) 1 N NaOH. </li><li> Nehmen Sie 4-5, 6 cm Durchmesser Petrischalen voller Würmer, mit ein paar hundert Würmer auf dem dritten Larvenstadium juvenile (J3) Bühne und waschen Sie die Würmer weg mit 2-3 ml sterilem M9 pro Platte. </li><li> Sammeln Sie alle Würmer in einer sterilen Einweg-15 ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 1500 xg für 5-7 Minuten oder bis die Würmer ein Pellet bilden. </li><li> Saugen Sie die Flüssigkeit und die Verwendung von 2 ml M9 zu resuspendieren die Würmer. Fügen Sie 20 ul EMS in ein Röhrchen mit 2 ml M9 und schütteln, um es aufzulösen. Dann stell 'das EMS-Lösung, die 2 ml-Wurm Federung und vorsichtig schwenken. Die Endkonzentration der EMS wird 47 mm sein. Achtung: EMS ist ein sehr starkes Mutagen und sollte in einem Abzug gehandhabt werden. Alle Materialien (Handschuhe, Pipetten, Spitzen), die in Kontakt mit diesem mutagen zu kommen, sollte mit 1N NaOH zur Inaktivierung des EMS behandelt werden. Tragen Sie doppelte Handschuhe während des gesamten EMS-Mutagenese Prozedur. Entsorgen Sie den gefährlichen Abfällen gemäß Ihrer Institution Richtlinien. </li><li> Legen Sie die Zentrifugenröhrchen und decken Sie die Kappe mit Parafilm, legen Sie es waagerecht in den Dunstabzug und lassen die Würmer für 3,5 Stunden inkubiert. Der Schlauch kann auch bei niedriger Geschwindigkeit Wippe platziert werden. </li><li> Drehen Sie den Schlauch und Mantel der Kappe mit Parafilm, in vertikaler Position und inkubieren, bis die Würmer zu versenken. </li><li> Den Überstand aspirieren und verwerfen sie in ein Becherglas / Kolben mit 1N NaOH. Dies wird Inaktivierung der EMS. </li><li> 5 ml M9, die Würmer, das Röhrchen 25-30 mal die Würmer, Zentrifuge bei 1500 xg waschen für 5-7 Minuten oder bis die Würmer ein Pellet bilden. Den Überstand aspirieren und verwerfen in die 1N NaOH Becher. </li><li> Wiederholen Sie den Waschvorgang mindestens 3-mal. </li><li> Nach dem letzten Waschen, resuspendieren der Wurm Pellet in minimaler Menge (~ 500 ul) M9 und Pipette sie hinaus auf NGM-Platten mit einem Rasen von OP50 Bakterien. An dieser Stelle müssen Sie nicht mehr in der chemischen Haube arbeiten. </li><li> Lassen Sie die Flüssigkeit trocknen für ein paar Minuten und dann abholen und Transfer gesund aussehende J4 Larven an die frische ausgesät Platten. Entsorgen Sie die Original-Platte nach Ihrer Institution gefährlicher Abfall-Richtlinien. </li><li> Lassen Sie die mutagenisierten Würmer selbst zu befruchten. Mit einem Stereomikroskop, Bildschirm der F2-Generation Phänotypen für rezessive Mutanten von Interesse. </li></ol> Teil 6: Psoralen Mutagenese In diesem Abschnitt beschreiben wir das Verfahren für die Mutagenese mit TMP in Verbindung mit langwelligem ultravioletten (UV). TMP / UV-Methode der Mutagenese wird häufig verwendet, um Deletionsmutationen innerhalb eines Genoms 3 induzieren. <ol><li> Sammeln von Würmern 4-5, 6 cm Durchmesser Petrischalen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, wie im vorherigen Verfahren beschrieben. </li><li> 10 ml M9, 20 Mal kippen, um die Würmer und Zentrifuge bei 1500 xg waschen für 5 Minuten. Überstand verwerfen und wiederholen Sie die Wäsche für insgesamt 3-mal. Absaugen der Flüssigkeit und resuspendieren die Würmer in ca. 10-fache ihres Volumens der M9 mit 30 ug / ml TMP. Je 20 ul von TMP (3 mg / ml) in 2 ml M9. Wie EMS, ist TMP ein starkes Karzinogen und muss behandelt unter richtigen Sicherheitsmaßnahmen werden. Um zu verhindern, vor möglichen Risiken des UV-Lichts richtige Auge trägt verwendet werden sollte. Das Verbrauchsmaterial muss in der richtigen biohazard Säcke entsorgt werden. </li><li> Inkubieren Sie die Röhrchen im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem niedrigen Drehzahlen Wippe (40 UPM). Setzen Sie den überdachten vertikal für 10 Minuten bis alle Würmer sinken lassen. </li><li> Entfernen Sie die Würmer aus dem Boden des Röhrchens mit einer Pasteurpipette und übertragen Sie sie auf eine ungesetzte NGM Platte. Verwerfen Sie den Überstand nach Ihrer Institution gefährlichen chemischen Richtlinien. </li><li> Halten Sie die Platte in dunklen, bis das überschüssige TMP in die Platte absorbiert wird. </li><li> Mit Hilfe eines UV-Intensität Meter, stellen Sie den Abstand zwischen den langwelligen UV-Quelle und die Platte so, dass die Intensität auf der Platte 500 mW / cm 2 4 ist. Entfernen Sie die Aluminium-Deckel und Deckel und Abdeckung und setzen die Platte mit den TMP behandelt Würmer, die langwellige UV-Strahlung für 50 Sekunden. </li><li> Zugedeckt die Würmer in der Dunkelheit für 5 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Pick and Transfer gesund aussehende J4 Larven an die frische ausgesät Platten. Entsorgen Sie die Original-Platte nach Ihrer Institution gefährlichen chemischen Richtlinien. </li><li> Mit einem Stereomikroskop, Bildschirm der F2-Generation Phänotypen für die Mutation von Interesse. </li></ol> Teil 7: Repräsentative Ergebnisse Einige der P. pacificus mutanten Phänotypen, die aus der Mutagenese (entweder durch EMS oder TMP / UV) sind in Abbildung 1 dargestellt. Jede Mutante besitzt einen charakteristischen Phänotyp, die leicht zu unterscheiden von der Wildtyp-Tier ist. Von den Würmerndass waren mit dem Mutagen, 30 J3/J4 Larven aus der elterlichen Generation (P0) wurden in getrennten Platten gelegt und dürfen Eier, die der F1-Generation sind Laien behandelt. Von den Platten, die gesunde F1-Nachkommen zeigten, wurden insgesamt 1000 F1 auf die einzelnen Platten übertragen und die F2-Nachkommen wurde Phänotypen gescreent. Tiere mit Dumpy 5,6, unkoordinierte 6 und Transformator 7 Phänotypen gefunden. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Pristionchus pacificus Wildtyp und Mutante Tiere. A. wt Hermaphrodit B. wt männlichen C dpy mutierten D. unc mutierten E. tra-Mutante. Top zwei Tafeln zeigen Wildtyp Hermaphrodit (links) und Männchen (rechts) Tiere mit den verschiedenen Mutanten in den restlichen Platten zu vergleichen.

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Mutagenese ist eine weithin angewandte Technik für genetische Studien in verschiedenen experimentellen Modell-Organismen. Mutagenese-Experimente werden häufig verwendet, um die Funktion eines Gens 2 zu identifizieren. Die Mutagenese hier beschriebenen Verfahren können nicht nur für P. verwendet werden pacificus, sondern auch für C. elegans und anderen verwandten Nematoden. Hier beschreiben wir zwei Methoden, EMS und TMP / UV-Mutagenese. EMS ist eine Chem...

an introduction to worm lab: von kultivierung worms zu mutagenese

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren, die Nematoden im Labor und wie man sie mutagenisieren mit zwei alternative Methoden zu halten: Ethylmethansulfonat (EMS) und 4, 5 &#39;, 8-Trimethylpsoralen mit ultraviolettem Licht (TMP / UV) kombiniert. Nematoden sind leistungsfähige biologische Systeme für genetische Studien wegen ihrer einfachen Körperbau und der Paarung, das aus sich selbst befruchtende Zwitter und Männchen, die hunderte von Nachkommen pro Tier erzeugen kann zusammengesetzt ist. Nematoden sind in Agarplatten mit einem Rasen von Bakterien erhalten und kann leicht von einer Platte zur anderen mit einem Pick übertragen werden. EMS ist ein Alkylierungsmittel häufig verwendet, um Punktmutationen und kleine Deletionen induzieren, während TMP / UV hauptsächlich induziert Löschungen. Je nach Art der Nematoden eingesetzt werden Konzentrationen von EMS und TMP müssen optimiert werden. Zur Isolierung rezessive Mutationen des Nematoden Pristionchus pacificus wurden die Tiere der F2-Generation visuell auf Phänotypen gescreent. Zur Veranschaulichung dieser Methoden, mutagenisierten wir Würmer und suchte Unkoordinierte (UNC), Dumpy (dpy) und Trafo (Tra) Mutanten.

Das Screening nach Mutanten mit phänotypischen Defekte ist eine einfache Methode zur Identifizierung von Genen, die in einem bestimmten biologischen Prozess funktionieren. In diesem Artikel beschreiben wir, wie die Kultur frei lebenden Würmer (z. B.<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) Im Labor und zeigen zwei verschiedene Mutagenese-Verfahren, EMS und TMP / UV.

An Introduction to Worm Lab: von Kultivierung Worms zu Mutagenese

Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Haltung von Nematoden im Labor sowie die Mutagenese mittels zweier alternativer Methoden: Ethylmethansulfonat...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zwei verschiedene Mutageneseprotokolle durchzuführen, die häufig zur Erzeugung von Mutanten und Nematoden wie ceno, hepatitis elegans und prisca verwendet werden. Die Pacificus-Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Funktion von Genen aufzuklären. Dies wird erreicht, indem zunächst Kulturen mit einer großen Anzahl von Würmern im letzten Larvenstadium vor der Vollreife hergestellt werden, an denen die Mutagenese durchgeführt wird.Der nächste Schritt besteht darin, die Würmer mittels zweier alternativer Verfahren zu mutagen: durch Behandlung mit Ethylmethansulfonat oder durch Sore- und Mutagenese in Kombination mit ultravioletter Strahlung. Der dritte Schritt des Verfahrens ist das Übertragen von gesund aussehenden Würmern auf Agarplatten, die frisch mit Bakterien besiedelt wurden und als Nahrungsquelle dienen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, in der ersten, zweiten oder dritten Generation nach mutierten Phänotypen von Interesse zu screenen.Hallo, ich bin Jore aus dem Labor von Dr. Andre Perez, der Silva, an der Fakultät für Biologie an der University of Texas in Arlington. Die T-M-P-U-V- und die EMS-Mutageneseverfahren helfen dabei, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Genetik zu beantworten, beispielsweise welche Gene an biologischen Prozessen beteiligt sind, die während der Entwicklung eine wichtige Rolle spielen. Hallo, mein Name ist Manish Phar. Obwohl die hier demonstrierten Mutagenesemethoden für Pristi Onca S Pacificus gelten, können sie sehr häufig auch bei anderen experimentellen Modellen wie dem Fadenwurm C. elegans sowie bei Wirbeltieren wie dem Zebrafisch angewendet werden.Beginnen wir also. Unsere Auswahl zum Übertragen von Würmern von einem Ort zum anderen besteht aus einem 30er-Gauge-Draht mit einer Zusammensetzung aus 90 % Platin und 10 % Iridium. Obwohl einige Forscher leicht abweichende Metallzusammensetzungen bevorzugen mögen, wird zum Halten des Picks ebenfalls eine Pasteur-Pipette verwendet.Beginnen Sie damit, die verlängerte Spitze der Pasteur-Pipette auf die erforderliche Länge abzubrechen. Schneiden Sie etwa drei bis vier Zentimeter Draht ab und geben Sie 0,5 Zentimeter davon in die Spitze der Pasteur-Pipette. Versiegeln Sie den Draht über einer Bunsenbrennerflamme im Glas.Die Länge des aus dem Glas herausragenden Drahtes beträgt etwa drei bis dreieinhalb Zentimeter, kann jedoch je nach individuellen Vorlieben variieren. Flachen Sie das Ende des herausragenden Drahtes mit einer Zange ab. Biegen Sie danach den abgeflachten Teil nach oben, um eine Schaufel zu bilden.Schließlich glätten Sie die scharfen Kanten des Picks mit Schleifpapier, um zu verhindern, dass der Wurm oder das Agar beschädigt wird. Um Würmer aufzunehmen, sterilisieren Sie den Draht des Picks in der Flamme und ziehen dann die abgeflachte Spitze vorsichtig über einen bakteriellen Rasen auf einer NGMP-Bauchplatte, um die Spitze mit dickflüssigen, klebrigen Bakterien zu überziehen. Achten Sie darauf, die Agaroberfläche unter Verwendung eines Stereomikroskops nur sehr leicht zu berühren, um sie nicht zu durchstechen oder zu beschädigen.Streichen Sie die klebrige Spitze gegen den Wurm, der aufgenommen werden soll, bis der Wurm an den Bakterien auf dem Pick haftet. Sobald der Wurm an der Spitze des Picks klebt, übertragen Sie ihn unverz&uuml;glich auf die neue Platte, indem Sie die Spitze des Picks gegen den bakteriellen Rasen der neuen Platte dr&uuml;cken oder entlang ihm gleiten lassen. Es ist darauf zu achten, dass die Agaroberfl&auml;che der Platte nicht besch&auml;digt wird, da die W&uuml;rmer sonst in die L&ouml;cher kriechen und schwer wiederzufinden w&auml;ren.Der Wurm sollte von der Nadel herunterkriechen, wenn Sie die Spitze der Nadel an den Bakterienrasen anlegen oder entlangführen. Der Wurm sollte nicht zu lange auf der Nadel verbleiben, da er sonst austrocknen könnte. Wir werden die EMS-Mutagenese an vier bis fünf Petrischalen mit einem Durchmesser von sechs Zentimetern demonstrieren, die Pristionchus pacificus-Würmer im dritten larvalen Jugendstadium enthalten.Spülen Sie die Würmer von jedem Plättchen mit zwei bis drei Milliliter sterilen M-neun pro Plättchen ab. Es sollten einige hundert Würmer sein. Sammeln Sie die Würmer in einem sterilen, wegwerfbaren 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie bei 1500 Gs für fünf bis sieben Minuten oder bis die Würmer ein Pellet bilden. Aspirieren Sie die Flüssigkeit und verwenden Sie zwei Milliliter M-neun, um die Würmer erneut in Suspension zu bringen, wobei Sie doppelte Handschuhe tragen und in einer Abzugshaube arbeiten. Geben Sie 20 Mikroliter EMS zu einem Gefäß mit zwei Millilitern M-neun und schütteln Sie, um es aufzulösen. Anschließend geben Sie diese Lösung zu zwei Millilitern der Wurmsuspension und wirbeln vorsichtig.Die endgültige Konzentration von EMS beträgt 47 Millimolar. Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen mit Paraform auf einen langsam schwingenden Rüttler in der Abzugshaube und lassen Sie die Würmer dreieinhalb Stunden inkubieren. Am Ende der dreieinhalbstündigen Inkubation stellen Sie das Röhrchen senkrecht und inkubieren, bis die Würmer absinken. Danach pipettieren Sie den Überstand ab und entsorgen ihn in einen Becher, der eine normale Natriumhydroxidlösung enthält, um das EMS im Überstand zu inaktivieren.Jedes Mal, bevor Sie die Hände aus dem Abzug nehmen, spülen Sie diese gründlich mit einer normalen Natriumhydroxidlösung ab. Um EMS zu inaktivieren, geben Sie fünf Milliliter M-neun zu den Würmern hinzu. Drehen Sie das Reagenzglas 25 bis 30 Mal um, um die Würmer zu waschen, und zentrifugieren Sie fünf bis sieben Minuten bei 1500 G, oder bis sich die Würmer nach der Zentrifugation zu einem Pellet zusammenlagern. Anschließend wird der Überstand abgesaugt und in den Becher mit einer normalen Natriumhydroxidlösung entsorgt.Wiederholen Sie diesen Waschschritt, bei dem M9-Centrifugation hinzugefügt und der Überstand entfernt wird, mindestens dreimal. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie das Wurmpellet in einer geringen Menge M9, pipettieren die Wurmsuspension auf NGM-Platten, die einen Rasen aus OP50-Bakterien enthalten. Nachdem die Flüssigkeit einige Minuten lang getrocknet ist, isolieren und übertragen Sie gesund aussehende J4-Larven auf frische, beimpfte Platten.Lassen Sie die mutagenen Würmer etwa acht bis zehn Tage später sich selbst befruchten und untersuchen Sie mithilfe eines Stereomikroskops die Phänotypen der F2-Generation auf übermäßige interessierende Mutanten. Dieses Verfahren zur Mutagenese wird an ppac pacificus-Würmern demonstriert, die von vier bis fünf sechs Zentimeter durchmessenden Petrischalen gesammelt und in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt wurden. Geben Sie 10 Milliliter M9 zum Wurmpellet hinzu.20-mal umkehren, um die Würmer zu waschen, und fünf Minuten bei 1500 G zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen. Die Wäsche der Würmer mit M-neun insgesamt dreimal wiederholen; nach der letzten Wäsche die Flüssigkeit abpipettieren und die Würmer in etwa dem 10-fachen Volumen an M-neun resuspendieren.Dann 4 5 8 Trimethyl SOREIN oder TMP aus einer Stammlösung mit drei Milligramm pro Milliliter hinzufügen, um eine Endkonzentration von 30 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Das Gefäß mit TMP 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur auf einem schwach schwingenden Rüttler inkubieren. Nach der Inkubation das Gefäß 10 Minuten senkrecht stellen, damit alle Würmer absinken können. Für dieses Video ist das Gefäß offen dargestellt, aber die TMP-Lösung sollte nicht dem Licht ausgesetzt werden.Da diese Chemikalie lichtempfindlich ist, verwenden Sie eine Pasteurpipette, um die Würmer vom Boden des Reaktionsgefäßes zu entnehmen und sie auf eine nicht beschichtete NGM-Platte zu überführen. Bewahren Sie die Platte im Dunkeln auf, bis das überschüssige TMP in die Platte absorbiert wurde. Sobald das TMP in die Platte absorbiert ist, können die Würmer mit ultraviolettem Licht behandelt werden.Einer der kritischsten Schritte beim TMP-UV-Neurogenese-Verfahren ist der richtige Abstand zwischen der UV-Langwellenquelle und der Platte. Daher müssen wir den Abstand mehrmals anpassen, um die richtige Intensität des auf die Platte treffenden UV-Lichts zu erreichen. Die Intensität sollte mit einem Intensitätsmessgerät aufgezeichnet werden und 500 Mikrowatt pro Quadratzentimeter betragen.Während dieses Schritts sollte eine geeignete Augenbekleidung verwendet werden, da eine potenzielle Gefahr durch die UV-Strahlung besteht. Mithilfe eines UV-Intensitätsmessgeräts bestimmen Sie den Abstand zur Langwellen-UV-Quelle, der eine Intensität von 500 Mikrowatt pro Quadratzentimeter ergibt.Als Nächstes entfernen Sie die Aluminiumfolie und den Deckel und stellen die Platte mit den mit TMP behandelten Würmern in einem Abstand von der Lampe auf, sodass die Intensität auf der Platte 500 Mikrowatt pro Quadratzentimeter beträgt. Belichten Sie die Platte 50 Sekunden lang mit Langwellen-UV-Strahlung, decken Sie sie ab und lassen Sie die Würmer anschließend fünf Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach fünf Stunden übertragen Sie gesund aussehende J4-Larven auf frische, beimpfte Platten.Untersuchen Sie abschließend die F1-, F2- oder F3-Generation auf interessierende Phänotypen mithilfe eines Stereomikroskops. Dargestellt sind hier einige der bei der F2-Generation nach EMS- oder T-M-P-U-V-Mutagenese identifizierten ppac pacificus-Mutantenphänotypen. Die beiden oberen Felder in diesen Abbildungen zeigen Beispiele eines wildtypischen Hermaphroditen und eines wildtypischen Männchens.Jeder Mutant weist ein charakteristisches Phänotyp auf, das leicht vom Wildtyp-Tier zu unterscheiden ist. Panel C zeigt ein Beispiel für einen Dumpy-Mutanten. Panel D zeigt einen unkoordinierten Mutanten und Panel E einen Transformer-Mutanten. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die EMS-Mutagenese in vier einhalb Stunden durchgeführt werden, und die TMP-UV-Mutagenese kann bei korrekter Durchführung in fünfeinhalb Stunden abgeschlossen werden.Diese Zeitspanne umfasst auch die Inkubationszeit. Vergessen Sie nicht, dass EMS und TMP äußerst gefährlich sind und bei der Arbeit mit diesen Stoffen stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Laborschürze, doppelter Handschuhe, die Nutzung einer Abzugshaube und von Schutzbrillen getroffen werden müssen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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