Real-time Imaging von Leukotrien B ₄ Vermittelte Zellmigration und BLT1 Wechselwirkungen mit β-Arrestin

Leukotrien B vier ist ein proinflammatorisches Molekül, das seine Wirkungen über die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren BT eins und BT zwei auf einer Vielzahl entzündlicher Zellen vermittelt. Der LTB vier B LT eins-Signalweg hat sich als entscheidend für mehrere entzündliche Erkrankungen erwiesen, darunter Asthma, Arthritis und Atherosklerose. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren oder GPCR vermitteln die Transduktion extrazellulärer Signale, die zu intrazellulären Antworten wie Chemotaxis, Freisetzung von intrazellulärem Calcium und Genregulation führen.

Die Bindung eines extrazellulären Liganden induziert eine Abfolge konformationeller Veränderungen, die zur Aktivierung heterotrimerer G-Proteine führen. Die G-Proteine modulieren daraufhin die Konzentrationen sekundärer Botenstoffe wie zyklisches Adenosinmonophosphat, Adenosintriphosphat und Diacylglycerol, um die Leukotrien-B4-vermittelte Zellmigration in Echtzeit zu überwachen. Aus Knochenmark stammende dendritische Zellen, oder BMDCs, werden abgebildet, während ein Reiz über einen kontrollierten Fluss aus einer Mikropipette zugeführt wird. Eine Zeitrafferaufnahme erfolgt zur Beurteilung der Migration.

Mithilfe dieser Live-Cell-Echtzeit-Bildgebungstechniken hat unser Labor entdeckt, dass der Leukotrienantagonist-B-Rezeptor BT1 funktionell auf dendritischen Zellen exprimiert ist. Wir konnten außerdem die Phosphorylierung sowie beta-Arrestin-abhängige Mechanismen der Internalisierung von BT1 identifizieren. Dr. Jla, Assistenzprofessor in unserem Labor, der viele dieser Techniken entwickelt hat, wird sowohl die Zellmigration als auch die Rezeptor-Internalisierung demonstrieren. Um aus Knochenmark gewonnene dendritische Zellen (BMDZs) für Zellmigrationsassays vorzubereiten, 0,5 Millionen Zellen in RPMI-1640-Kulturmedium, das rekombinantes G-M-CSF und rekombinantes FLT3 enthält, auf eine 35-Millimeter-Schale mit Glasboden geben.

Nach dem Ansäen die Zellen 16 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Drei Milliliter PBS hinzufügen und anschließend abpipettieren. Diesen Waschschritt mindestens zwei weitere Male wiederholen; nach der letzten Absaugung zwei Milliliter PBS in die Platte geben.

Die Zellen sind nun bereit für das Experiment und sollten bei 37 Grad Celsius gehalten werden. Bis dahin besteht das in diesem Video verwendete Abbildungssystem aus einem A-T-E-F-M-Epi-Fluoreszenzsystem, das an ein umgekehrtes Nikon Eclipse TE 300-Mikroskop angeschlossen ist und mit einem Heiztisch sowie einer Cool SNAP hq Digital-CCD-Schwarz-Weiß-Kamera ausgestattet ist.

Die Anregungs- und Emissionswellenlängen werden über Filterräder und einen Lambda-10-dash-2-Filterradregler gesteuert. Die Hardwaresteuerung und die Bildaufnahme erfolgen über die Metamorph-Software. Zwei Mikromanipulatoren sind am Mikroskoptisch befestigt, um die Pipetten zu halten, die entweder gemäß den Anweisungen im begleitenden Text hergestellt oder gekauft werden können.

Übertragen Sie 1,5 Milliliter einer 100 Nanomolar-Stammlösung des proinflammatorischen Liganden Leukotrien B vier oder LTB vier in ein 1,5-Milliliter-Fuge-Gefäß. Befüllen Sie die Mikropipette nach, indem Sie die Mikropipettenspitze in die Lösung tauchen und die Lösung eindringen lassen; diese Beladungsmethode verhindert die Bildung von Luftblasen an der Spitze der Mikropipette. Befüllen Sie anschließend eine eine Kubikzentimeter umfassende Tuberkulinspritze, die mit einer Microfill-Nadel verbunden ist, mit einem Milliliter LTB vier.

Danach langsam eine Mikropipette von oben füllen, indem man Schlauch an die mit Mikropipette gefüllte LTB-Vorrichtung anschließt. Anschließend die Mikropipette und den Schlauch an eine 21-Gauge-einhalb-Zoll-Nadel anschließen, die an eine Ein-Milliliter-Spritze angeschlossen ist, die ebenfalls mit Ligand gefüllt ist. Danach die mit Ligand gefüllte Mikropipette vorsichtig an einem der Mikromanipulatoren auf dem Mikroskopständer befestigen, um Live-Cell-Imaging von aus Knochenmark stammenden dendritischen Zellen durchzuführen.

Als Reaktion auf die Zugabe des LTB4-Liganden nehmen Sie die mit unreifen bMDCs beschichteten Platten aus dem Inkubator und stellen sie auf den beheizten Mikroskoptisch. Bringen Sie die Zellen mit einem 60×-Ölimmersionsobjektiv in den Fokus. Suchen Sie einen Bereich, in dem die Zellen nicht zu dicht gedrängt sind, um eine ordnungsgemäße Beobachtung der Migration zu ermöglichen.

Entfernen Sie den Deckel von der Fluoroschale. Senken Sie dann mithilfe des groben manuellen Manipulators vorsichtig die mit Ligand beladene Pipette ab und führen Sie sie heran. Bringen Sie sie mit dem hydraulischen feinen Mikromanipulator in unmittelbare Nähe der Zellen.

Bringen Sie die Pipette in den Fokus. Geben Sie einen geringen Druck über die Spritze ab, um die langsame Freisetzung des LTB4-Liganden aus der Spitze zu initiieren; der Ligand sollte sich langsam durch Diffusion im Medium ausbreiten. Stellen Sie anschließend mit der Metam-Software die Bildaufnahmeparameter so ein, dass alle 15 Sekunden ein Hellfeldbild über einen Zeitraum von zwei Stunden aufgenommen wird.

Überwachen Sie alle fünf Minuten die Fortschritte der Migration in Richtung Ligand. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode wurde verwendet, um die Migration dendritischer Zellen in Richtung Leukotrien B vier zu bestimmen. Hier erfolgte die Migration dendritischer Zellen aus murinem Knochenmark in Richtung 100.

Nan Tier oder LTB vier ist in diesem Zeitraffervideo zu sehen, das die Lebendzellmigration von BMDCs in Richtung LTB zeigt. Vier ähnliche Methoden können angewendet werden, um die chemotaktische Antwort vieler Zelltypen auf eine Vielzahl von Chemoattraktanten zu bestimmen. Diese Art der Bildgebung in Kombination mit fluoreszierenden Proteinmarkermolekülen kann verwendet werden, um Bewegungen und Wechselwirkungen von Molekülen in Echtzeit in lebenden Zellen zu verfolgen.

Hier zeigen wir die Wechselwirkungen des mit einem fluoreszierenden Marker versehenen Leukotrien-B-vier-Rezeptors eins mit Beta-Arrestin in Echtzeit. RBL zwei H drei ist eine aus Wistar-Ratten isolierte Ratten-basophile Leukämiezelllinie, die von A TCC bezogen werden kann. Diese Zellen exprimieren nur wenige Chemokinrezeptoren, verfügen jedoch über die zellulären Komponenten, um chemokinabhängige Signalwege zu vermitteln.

Um die ligandinduzierte Internalisierung von BT1 in Echtzeit zu untersuchen, werden RBL-2H3-Zellen mit BT1-RFP und Beta-Arrestin-GFP transfiziert. Während der Zeitrafferaufnahme wird der Ligand der Platte zugesetzt. Änderungen in der Lokalisation dieser Proteine können mittels Bildanalyse bewertet werden.

Um die GPCR-Internalisierung in Echtzeit zu untersuchen, transfizieren Sie B-LT-one-RFP und Beta-Arrestin-GFP gemäß den Anweisungen im begleitenden Text in RBL-2H3-Zellen. Danach überführen Sie 300 µL des elektroporierten Zell- und normales Wachstumsmedium enthaltenden Gemischs in 35-mm-Fluoreszenzschalen, die zwei Milliliter normales Wachstumsmedium enthalten. Stellen Sie die Zellen bei 37 °C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid, um die Anheftung an den Schalenboden zu ermöglichen.

Nach einer Stunde das Transfektionsmedium durch normales Wachstumsmedium ersetzen und die Zellen weitere 18 bis 24 Stunden in den Inkubator stellen. Nach der Inkubation die Zellen zwei- oder dreimal waschen, indem zwei Milliliter warmes, phenolrotfreies RPMI mit 10 Millimolar HEPES direkt in die Platte gegeben und das Medium abgesaugt werden. Anschließend weitere 1,8 Milliliter hinzufügen.

Als Nächstes stellen Sie die Kulturschale auf die beheizte Mikroskopbühne. Nehmen Sie Bilder mit 600×-Vergrößerung unter Verwendung eines 60×-Ölimmersionsobjektivs auf. Wechseln Sie anschließend zum geeigneten Fluoreszenzfilter.

Wählen Sie eine gesunde Zelle aus, die HBL BT one RFP auf der Zelloberfläche exprimiert, und nehmen Sie hier das Bild auf. Wechseln Sie mithilfe des RFP-Filters zum GFP-Filter und vergewissern Sie sich, dass Beta-Arrestin und GFP im Zytoplasma exprimiert werden, und nehmen Sie das Bild auf. Untersuchen Sie anschließend die fusionierten pseudogefärbten Bilder, um sicherzustellen, dass keine Farbdurchschwächung (Bleed-through) der Fluoreszenz auftritt, die als Ergebnis einer Verwechslung auftreten könnte.

Die gezielte Ansteuerung der Rezeptoren erfolgt nicht zwischen RFP und GFP. Geben Sie hier die Parameter für die Zeitrafferaufnahme ein. 16-Bit-Bilder werden mit der Kameraeinstellung für Binning auf eins zu eins erfasst.

Die roten und grünen Fluoreszenzbilder werden nacheinander mithilfe von RFP- und GFP-Fluoreszenzfarbstoff-Filtern über einen R-F-P-G-F-P-Strahlteiler aufgenommen. Leiten Sie die Software an, Bilder in 32-Intervallen über einen Zeitraum von einer Stunde aufzunehmen. Stellen Sie die Belichtungszeiten der Kamera so ein, dass ähnliche Dynamikbereiche erzielt werden.

Für die Fluoreszenzintensität von RFP und GFP. Sammeln Sie eine Minute lang Bilder, dann bei t gleich null. Geben Sie 200 µL des Liganden direkt in die Platte, ohne diese zu stören.

Setzen Sie die Sammlung von Fluoreszenzbildern für 60 Minuten fort. Nach dem Hinzufügen des Liganden werden die Bilder während der Aufnahme automatisch als TIFF-Bilder mit fortlaufenden Dateinamen gespeichert. Die Dateien können anschließend einzeln oder kombiniert mit der Software betrachtet werden.

Abschließend, nachdem alle Zellbilder aufgenommen wurden, Bilder mit reinem Medium ohne Zellen unter Verwendung der gleichen Einstellungen aufnehmen. Die Dateien zur späteren Verwendung als Hintergrundbilder zur Analyse der Bilder speichern. Nutzen Sie die Bildsubtraktionsfunktion in MetaMorph, um den Hintergrund von den oben erhaltenen eigentlichen Datenaufnahmen abzuziehen.

Dies berücksichtigt jegliche Hintergrund- oder Autofluoreszenz des Mediums. Öffnen Sie als Nächstes im Dateimenü die endgültige generierte Stapeldatei-Option und öffnen Sie die einzelnen Bildstapel. Wählen Sie anschließend unter Region Measurements die Option Eclipse Region Trace Region aus und zeichnen Sie die Regionen von Interesse; wählen Sie Oberflächen- und zytoplasmatische Regionen, um die Fluoreszenzintensität von RFP und GFP entsprechend der Translokation von BLT1 und Beta-Arrestin zu messen.

Verwenden Sie die Protokolldatenoption, die automatisch eine Verbindung zu Excel herstellt, um die Fluoreszenzintensitäten als Funktion der Zeit aufzutragen. Dieses Diagramm liefert Informationen über die Kinetik der Translokation eines bestimmten Moleküls. Die Bildanalyse kann die Lokalisation von G-PCR-R und zytosolischen Proteinen sowie des Zellkerns aufzeigen.

Hier ist die Expression von BT one RFP auf der Oberfläche einer RBL two H three-Zelle zu sehen. Dieses Bild zeigt die Lokalisation von Beta-Rest und GFP im Cytosol derselben Zelle, und hier ist p nuke CFP im Zellkern sichtbar. Das hier gezeigte farbkombinierte Bild weist auf die unterschiedliche zelluläre Lokalisation jedes Fluorochroms hin. Die ligandengesteuerte Interaktion von Oberflächen-GPCRs mit zytoplasmatischen Proteinen kann hier ebenfalls beurteilt werden.

Ligandinduzierte Translokation des BLT1-Rezeptors und von Beta-Arrestin. Dieses Video zeigt die Live-Bildgebung einer Zelle, die BLT1-RFP und Beta-Arrestin-GFP exprimiert. Nach Zugabe von einem Mikromolar LTB4 können die Translokationsmuster mittels Metamorph-Software quantifiziert und verfolgt werden.

Ein Linienscan der Fluoreszenzintensitäten in einer repräsentativen Zelle wird bei T gleich null gezeigt. BT1-RFP ist an der Membran zu sehen, und Beta-Arrestin-GFP ist im Cytosol zu sehen. Nach Zugabe des Liganden wird eine Überlappung der RFP- und GFP-Linien beobachtet, was eine Kolokalisation des Rezeptors und des Beta-Arrestins nahelegt.

Außerdem können hier die Kinetik der Proteinebewegung, die Kinetik der Rezeptor-Internalisierung und die Translokation von Beta-Arrestin bestimmt werden. Diese wurde nach Zugabe von einem Mikromolar LTB4 untersucht.

Die Fluoreszenzintensitäten wurden als Funktion der Zeit an membran- und zytoplasmatischen Lokalisationen der Zelle gemessen. Die Zugabe des LTB4-Liganden zu B-LT1-RFP- und Beta-Arrestin1-GFP-transfizierten RBL-2H3-Zellen führt innerhalb einer Minute zur Translokation von Beta-Arrestin1-GFP vom Zytosol zur Membran, erkennbar an der Bildung eines gelben Rings. Durch Wechselwirkung mit Beta-Arrestin1-GFP bildet B-LT1-RFP einen Rezeptor-Beta-Arrestin1-GFP-Komplex, der in Form von Endosomen durch das Zytosol transloziert, sichtbar anhand der Erscheinung gelber Pünktchen innerhalb von fünf Minuten. Mit diesen Methoden können der ligandabhängige Aktivierungsstatus des Rezeptors sowie kritische Motive oder Prozesse, die an der Rezeptoraktivierung beteiligt sind, bestimmt werden.

Das Wichtigste bei dem Experiment ist, das Puffermedium in der Platte während der Bearbeitung genau zu beobachten. Während das Experiment mehr als eine Stunde nach seiner Einleitung andauert. Diese Technik erschien den Forschern auf dem Gebiet der Chemokine und ihrer Rezeptoren, um die Zellmigration sowie Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Liganden in verschiedenen Säugetierzelltypen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Echtzeit-Bildgebungsexperimente durchführt, die Chemokine und ihre Rezeptoren sowie deren Wechselwirkungen mit zytosolischen Proteinen wie Beta-Arrestinen beinhalten.