Name: Ein besseres Mosquito: Identifizierung der Gene aktivieren Malaria und Dengue-Fieber Widerstand in A. gambiae und A. aegypti Moskitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 3 s
Description: Erfahren Sie, wie das angeborene Immunsystem von Anopheles gambiae und Aedes aegypti Malaria- und Dengue-Erreger bekämpft. Diese Methode hilft Forschern, Resistenzgene zu identifizieren und transgene Mücken zu entwickeln.

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ein besseres mosquito: identifizierung der gene aktivieren malaria und dengue-fieber widerstand in a. gambiae und a. aegypti moskitos

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In diesem Interview, konzentriert sich George Dimopoulos auf die physiologischen Mechanismen von Mücken verwendet werden, um Plasmodium falciparum und Dengue-Virus-Infektionen zu bekämpfen. Erklärung dafür, wie Schlüssel feuerfesten Gene gegeben ist, sind die Gene, die Resistenz gegen Pathogene Vektor, in der Mücke identifiziert und wie dieses Wissen genutzt, um transgene Moskitos, die nicht in der Lage, die Malaria-Parasiten oder Dengue-Virus in sich tragen sind zu generieren.

Ein besseres Mosquito: Identifizierung der Gene aktivieren Malaria und Dengue-Fieber Widerstand in A. gambiae und A. aegypti Moskitos

In diesem Interview konzentriert sich George Dimopoulos auf die physiologischen Mechanismen, mit denen Stechmücken Plasmodium falciparum und das Dengue-Virus bekämpfen ...

Ich bin George Dimopoulos. Ich bin Assistenzprofessor an der Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und Immunologie der School of Public Health der Johns Hopkins University am Malaria Research Institute. Meine Forschungsgruppe arbeitet an der Mücke und Gambia, die Malaria übertragen, und wir untersuchen die Molekularbiologie der Mücke mit besonderem Interesse am angeborenen Immunsystem der Mücke, das an der Abtötung von Malariaparasiten beteiligt ist.Wir möchten verstehen, wie dieses Immunsystem funktioniert und welche Gene und Moleküle wichtig für die Abtötung des Parasiten sind. Wir sind der Überzeugung, dass wir durch das Verständnis der Biologie dieses Systems in der Lage sein werden, dieses Wissen zukünftig zur Entwicklung von Strategien zur Malaria-Bekämpfung zu nutzen. Malaria ist eine der schwerwiegendsten Krankheiten weltweit.Es begleitet die Menschheit schon seit jeher, und es ist eine Schande, dass wir es nach wie vor haben. Malaria infiziert jedes Jahr 400 Millionen Menschen und tötet 2 Millionen Menschen, hauptsächlich in der afrikanischen Region südlich der Sahara, aber wir finden es auch in anderen Entwicklungsländern Südamerikas und Asiens. Malaria wird durch einen einzelligen Parasiten des Genus *Plasmodium* verursacht, und es gibt vier *Plasmodium*-Arten, die bei Menschen Malaria auslösen können.Der wichtigste dieser Erreger ist Plasmodium falciparum. Plasmodium falciparum wird hauptsächlich durch Mücken der Gattung Anopheles übertragen, und die wichtigsten Vektormücken für die Übertragung von Malaria in Afrika südlich der Sahara gehören zum Anopheles gambiae-Artenkomplex und sind vorwiegend in der afrikanischen Region südlich der Sahara verbreitet. Das Dengue-Virus ist ein Flavivirus und wird überwiegend durch die Mücke Aedes aegypti übertragen.Seine geographische Verbreitung ist der von Malaria sehr ähnlich. Wir finden es in Amerika, in Südostasien und in Afrika. Das Dengue-Virus verursacht eine hämorrhagische Fiebererkrankung.Etwa 2,5 Milliarden Menschen sind von dem Dengue-Virus bedroht, und das Virus verursacht jährlich bei Millionen von Menschen eine hämorrhagische Fiebererkrankung. In den letzten 10 Jahren hat sich das Dengue-hämorrhagische Fieber zu einer der schwerwiegendsten vektorübertragenen Krankheiten entwickelt. Der Malariaparasit besitzt somit einen komplexen Lebenszyklus sowohl im Mückenvektor, der zwischen menschlichen Wirten übertragen wird, als auch im menschlichen Wirt.Und meine Forschungsgruppe untersucht die Biologie der Malariaübertragung in der Mücke. Wenn eine Mücke eine infizierte Blutmahlzeit aufnimmt, nimmt sie auch die Plasmodium falciparum-Parasiten auf. Die Gametozyten des Parasiten befruchten sich im Mitteldarm und bilden eine MT-Kachel oder Kinit etwa 18 bis 35 Stunden nach der Aufnahme der Blutmahlzeit.Diese Orkin-Bedürfnisse werden das Mücken-Darmepithel hier befallen. Die meisten Orkin-Bedürfnisse werden zu diesem Zeitpunkt vom Immunsystem der Mücke abgetötet, und genau auf diese Phase konzentrieren wir unsere Untersuchungen. Dies ist außerdem eine konfokale Mikroskopieaufnahme der Orkinine; die Orkinine, die es durch den Mitteldarm schaffen, bilden hier auf der basalen Seite eine Zyste, und innerhalb dieser Zyste entwickeln sich Tausende von Sporozoiten-Stadien-Parasiten. Diese fortgeschrittenen Stadien wandern dann etwa 15 Tage nach der Blutmahlzeit der Mücke zu den Speicheldrüsen, und von dort aus können die Sporozoiten auf einen neuen Wirt übertragen werden. Das Immunsystem der Mücke ist auch an der Abtötung der Sporozoiten in diesem Stadium beteiligt, wenn diese im Hämolymphe der Mücke freigesetzt werden.Das Genom der Mücken wurde kürzlich im Jahr 2002 sequenziert, und dies hat es uns ermöglicht, neuartige molekularbiologische und genomische Werkzeuge zu entwickeln, um die Genexpression aller Mücken – etwa 14.000 Gene – unter verschiedenen Infektionsbedingungen mittels sogenannter Mikroarrays zu untersuchen. Dieser hier gezeigte Mikroarray, den wir vor einigen Jahren entwickelt haben, enthält das gesamte Transkriptom der Mücke, also alle zu diesem Zeitpunkt bekannten Mückengene, sowie die Gene des Plasmodium-Parasiten. So können wir die Aktivität von Genen sowohl in der Mücke als auch im Parasiten gleichzeitig während einer Infektion analysieren.Wenn wir Gene identifiziert haben, die aktiviert werden, wenn die Mücke mit Plasmodium-Parasiten infiziert ist, müssen wir prüfen, ob diese Gene an der Abtötung des Parasiten beteiligt sind, und dies tun wir mittels einer Methode, die als RNA-Interferenz-Genstilllegung bezeichnet wird. Wir injizieren im Grunde RNA für die Gene, die wir gezielt beeinflussen möchten, und diese doppelsträngige RNA führt zum Abbau der mRNA der betreffenden Gene in der Mücke, wodurch diese Gene kein Protein mehr produzieren. Anschließend infizieren wir die Mücke mit einem Parasiten.Nun, wenn wir ein bestimmtes Gen im Moskito stillgelegt oder inaktiviert haben und sich nach dieser Stilllegung der Parasit stärker infizieren kann als normalerweise in nicht behandelten Mücken, würde dies darauf hindeuten, dass dieses Gen auf irgendeine Weise zur Abtötung von Malaria-Parasiten verwendet wird. Und dies ist tatsächlich die Hauptmethode, die wir nutzen, um zu prüfen, ob Gene an der Abtötung von Parasiten im Moskito beteiligt sind.Die meisten Plasmodium-Parasiten werden in der Mücke abgetötet, und wir verfügen über starke Hinweise darauf, dass das angeborene Immunsystem der Mücke hauptsächlich für diese Abtötung verantwortlich ist. Unser Laboratorium und die Labore unserer Kooperationspartner haben eine Vielzahl von Genen identifiziert, die daran beteiligt sind. Außerdem existieren genetisch selektierte Mückenstämme, die Malaria nicht übertragen, da sie sämtliche Parasiten im Mitteldarm durch angeborene Immunabwehrmechanismen abtöten.Es scheint, als hätte die Mücke eine Vielzahl unterschiedlicher Komponenten und Mechanismen, um den Parasiten gezielt anzugreifen, und die größte Herausforderung heute besteht darin, zu verstehen, wie diese Funktionen wirken und wie wir sie manipulieren können, um resistente Mücken zu entwickeln. Die GTI-Mücke verwendet andere Mechanismen zur Kontrolle der Dengue-Virusinfektion als die Anopheles gambiae-Mücke, die die Malaria-Infektion kontrolliert. Die Aedes aegypti-Mücke verfügt – wie alle Eukaryoten – über einen RNA-abhängigen Abwehrmechanismus, der als RNA-Interferenz bezeichnet wird.Es handelt sich im Grunde um einen Abwehrmechanismus, der in der Lage ist, die RNA des Virus gezielt abzubauen und sich auf diese Weise gegen eine Virusinfektion zu schützen. Wir versuchen, diesen Abwehrmechanismus zu verstehen und herauszufinden, wie wir ihn manipulieren können, um Mücken zu erzeugen, die resistent gegen das Virus sind. In den letzten 10 Jahren hat die Molekularbiologie einige wirklich dramatische Fortschritte erlebt, vor allem methodische Fortschritte, die unsere Forschung enorm beschleunigt haben.Einer der wesentlichen Fortschritte ist die Sequenziertechnologie, die eine Hochdurchsatzsequenzierung ganzer Genome ermöglicht hat. Dank dieser Technologien verfügen wir nun über die vollständig sequenzierten Genome von ous Gambia und dem A, dieser Gyp-Mücke. Dies erlaubt es uns, Gene, die an der Kontrolle von Infektionen beteiligt sind, viel einfacher zu identifizieren als zuvor.Weitere sehr wichtige Fortschritte im Bereich der Funktionalen Genomik sind die hochdurchsatzfähige Genexpressionsanalyse mittels Microarray. Microarrays sind kleine Glasscheiben, auf denen Tausende von DNA-Fragmenten immobilisiert wurden, und wir können diese sogenannten DNA-Chips nutzen, um die Genexpression einer sehr großen Anzahl von Genen zu überwachen. Ein weiterer sehr wichtiger Fortschritt auf diesem Gebiet ist die RNA-Interferenz-basierte Genstilllegungsmethode, die es uns ermöglicht, gezielt Gene anzusteuern und sie in der Mücke zu inaktivieren, und dadurch einen sogenannten reversen genetischen Ansatz zu verwenden, um die Genfunktion und die Bedeutung unserer Gene von Interesse beim Abtöten des Parasiten zu untersuchen.Die Mücken, an denen wir und unsere Kooperationspartner die meisten dieser Studien durchgeführt haben, stammen aus Moskito-Kolonien, die unter Laborbedingungen bis zu 30 Jahre lang gehalten wurden. Diese Mücken haben sich offensichtlich erheblich von den Mücken in der Natur differenziert. Die Mücken in der Natur unterliegen einem kontinuierlichen selektiven Druck durch verschiedene Mikroben und andere Parameter, die im Freiland stark variieren, im Gegensatz zu den relativ stabilen Bedingungen, die wir im Labor haben.Man könnte also argumentieren, dass unsere Studien wahrscheinlich weitaus aussagekräftiger wären, wenn sie direkt an Feldmücken durchgeführt würden. Leider ist dies jedoch nicht so einfach möglich. Wie bereits erwähnt, verfügen wir nicht über die notwendige Infrastruktur im Feld, und es ist außerdem sehr schwierig, Mücken aus dem Feld zu sammeln und daraus Kolonien zu züchten.Daher sind die besten biologischen Modelle, die wir heute haben, die Labormodelle. Natürlich müssen wir jedoch irgendwann in die Feldforschung wechseln, um die wichtigsten Erkenntnisse, die sich aus unseren Entdeckungen mit Labormücken ergeben, zu überprüfen und zu bestätigen. Wir wissen, dass die Abwehrsysteme der Mücken an der Abtötung der menschlichen Krankheitserreger beteiligt sind, die diese Insekten übertragen. Wenn wir nun verstehen, wie diese Abtötung erfolgt, welche Gene und welche Mechanismen dabei eine Rolle spielen, könnten wir diese möglicherweise gezielt beeinflussen. Mithilfe dieser Beeinflussung ließen sich genetisch veränderte Mücken entwickeln, die nicht mehr in der Lage sind, den Krankheitserreger zu übertragen.Nachdem wir solche genetisch veränderten Mücken entwickelt haben, können wir darüber nachdenken, wie wir sie tatsächlich im Freiland einsetzen und zu einer dominanten Art gegenüber den empfänglichen Mücken machen können. Eine Strategie, die häufig diskutiert wurde, um dies zu erreichen, besteht im Wesentlichen darin, resistente Gene in natürlichen Populationen zu verbreiten – Gene, die die Mücken resistent gegenüber Krankheitserregern machen würden –, und dies muss mithilfe sogenannter genetischer Treibmechanismen erreicht werden. Gegenwärtig konzentriert sich viel Forschung auf die Entwicklung solcher genetischen Treibmechanismen.Es gibt natürlich viele ethische Überlegungen, die man bei der Freisetzung jeglicher Art genetisch veränderter Organismen in die Natur anstellen muss. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass genetische Veränderungen in der Natur ständig und auf natürliche Weise auftreten. Bei den drei Mutationen gibt es wenig bis keinen Grund zu der Annahme, dass wir am Ende einen Moskito erhalten würden, der besser darin ist, einen Krankheitserreger zu übertragen, oder der irgendeine andere unerwünschte Eigenschaft aufweist.Das Schlimmste, was passieren könnte, wäre, dass der Erreger irgendwann Resistenzen gegenüber diesem transgenen Moskito entwickelt. Natürlich müssten wir umfangreiche Feld- und Labortests durchführen, bevor wir jemals in Erwägung ziehen würden, einen genetisch veränderten Moskito in der freien Natur freizusetzen. Außerdem müssten wir die Bevölkerung über diese kontrollierten Strategien aufklären und sicherstellen, dass sich alle wohlfühlen und diese Strategie unterstützen. Es gibt nach wie vor viele Hindernisse, die überwunden werden müssen, um eine Strategie zur Krankheitskontrolle zu verwirklichen, die darauf basiert, den Erreger im Mückenvektor zu blockieren.Einige dieser Hindernisse hängen mit technischen beziehungsweise experimentellen Problemen zusammen, die wir lösen müssen. Ein Hindernis ist beispielsweise die Entwicklung genetischer Treibmechanismen, Mechanismen, die es diesen resistenten Genen effizient ermöglichen würden, sich in Populationen auszubreiten. Das wissenschaftliche Fachgebiet der Biologie von Krankheitsüberträgern hat in den letzten 10 bis 15 Jahren einen tiefgreifenden Fortschritt erfahren, hauptsächlich aufgrund der Erkenntnis, dass das Verständnis der Biologie der Wechselwirkung zwischen Insekten und Krankheitserregern uns tatsächlich dabei helfen könnte, Kontrollstrategien zu entwickeln.Und diese Anerkennung führte zu einer erhöhten Finanzierung der Forschung in diesem Bereich. Es ist äußerst wichtig, dass diese Finanzierung fortgesetzt wird und das Engagement aufrechterhalten bleibt, damit wir den erreichten Schwung beibehalten und unsere Mission abschließen können, indem wir die Biologie der Vektor-Pathogen-Interaktion verstehen und nutzen, um Strategien zur Bekämpfung von Krankheiten zu entwickeln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für die Dengue-Virus identifiziert ist, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung virale Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Dengue-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für den Anbau bis das Virus in Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.

Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

In diesem offenen Interview, erklärt Anthony A. James, wie Mücken Genetik genutzt werden, um Malaria und Dengue-Übertragung zu steuern. Bevölkerung Ersatz-Strategie, die Idee, dass transgene Moskitos in die freie Wildbahn kann freigesetzt werden, um die Übertragung von Krankheiten steuern, ist ebenso wie das Konzept der genetischen Antrieb und die Design-Kriterium für eine effektive genetische Antriebssystem eingeführt. Die ethischen Überlegungen der Freisetzung genetisch veränderter Organismen...

Verhinderung der Ausbreitung von Malaria und Dengue-Fieber mit Hilfe gentechnisch veränderter Moskitos

Oligonukleotide können die Besucher genutzt werden speziell Ersatz eines einzelnen Nukleotids von transfizierten Zielgene in...

Transfektion und Mutagenese von Zielgenen in Mosquito-Zellen durch Locked Nucleic Acid-modifizierte Oligonukleotide

Malaria übertragende Mücken haben eine Reihe von epidemiologisch wichtigen Eigenschaften, die nur mit molekularen Techniken nachgewiesen werden können. Unter Verwendung einer MALDI-TOF-basierten SNP-Genotypisierungsplattform haben wir einen Assay entwickelt, mit dem mehrere Schlüsselmerkmale (Spezies, Insektizidresistenz, Parasiteninfektion und Wirtswahl) von Malariavektoren gleichzeitig nachgewiesen werden können.

Ein Multi-Nachweistest für Malaria tragenden Mücken

Das bipartite GAL4-UAS-System ist ein vielseitiges Werkzeug zur Modifikation der Genexpression in kontrolliert raumzeitlicher Weise, das eine funktionelle genetische Analyse in Anopheles gambiae ermöglicht. Die beschriebenen Verfahren für die Verwendung dieses Systems sind eine semi-standardisierte Klonierungsstrategie, Sexing und Screening von Puppen auf fluoreszierende Proteinmarker und Embryofixierung.

Einsatz des GAL4-UAS-Systems für die funktionelle Genetik bei Anopheles gambiae

Das Protokoll beschreibt, wie mit dem φC31-System ortsgerichtete Modifikationen im Genom von Anopheles-Malariamücken erreicht werden können. Zu den beschriebenen Modifikationen gehören sowohl die Integration als auch der Austausch transgener Kassetten im Genom von attP-tragenden Andockleitungen.

Ortsgerichtete φC31-vermittelte Integration und Kassettenaustausch in Anopheles-Vektoren der Malaria

Die hier berichteten Protokolle veranschaulichen drei alternative Möglichkeiten, die Leistung von gentechnisch veränderten Moskitos zu bewerten, die für die Vektorkontrolle in laboreigenen Kleinkäfigversuchen bestimmt sind. Jedes Protokoll ist auf die spezifische Modifikation des Mückenstamms (Gene Drive oder Non-Gene Drive) und die Art der gemessenen Parameter zugeschnitten.

Kleinkäfig-Laborversuche mit gentechnisch veränderten Anopheline-Mücken

Mikroinjektionstechniken sind unerlässlich, um exogene Gene in die Genome von Moskitos einzuführen. Dieses Protokoll erklärt eine Methode, die vom James-Labor verwendet wird, um DNA-Konstrukte in Anopheles gambiae-Embryonen zu mikroinjizieren, um transformierte Moskitos zu erzeugen.

Mikroinjektionsmethode für Anopheles gambiae Embryonen

Die ausgewachsene Mückenspeicheldrüse (SG) ist für die Übertragung aller durch Mücken übertragenen Krankheitserreger auf ihre menschlichen Wirte, einschließlich Viren und Parasiten, erforderlich. Dieses Video zeigt die effiziente Isolierung der SGs von den Larven (L4) Anopheles gambiae-Mücken und die Vorbereitung der L4-SGs für die weitere Analyse.

Dissektion und Immunfärbung von Larven-Speicheldrüsen von Anopheles gambiae Mücken

Aufgrund ihrer einfachen Anatomie bieten Anopheles-Hoden ein gutes zytologisches Modell für die Untersuchung der Spermatogenese. Dieses Protokoll beschreibt die Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung , eine Technik, die zur Untersuchung dieses biologischen Prozesses verwendet wird, sowie den Phänotyp transgener Stämme, die Mutationen in den Genen aufweisen, die an der Spermienproduktion beteiligt sind.

Ganzkörper-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Untersuchung der Spermatogenese in der Anopheles-Mücke

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Genom-Editierung durch embryonale Mikroinjektion in der Mücke A. aegypti unter Verwendung der CRISPR-Cas9-Technologie.

Genome Editing bei der Gelbfiebermücke Aedes aegypti mittels CRISPR-Cas9

Erfahren Sie, wie das angeborene Immunsystem von Anopheles gambiae und Aedes aegypti Malaria- und Dengue-Erreger bekämpft. Diese Methode hilft Forschern, Resistenzgene zu identifizieren und transgene Mücken zu entwickeln.

Ein besseres Mosquito: Identifizierung der Gene aktivieren Malaria und Dengue-Fieber Widerstand in A. gambiae und A. aegypti Moskitos (Video) | JoVE Journal

Ein besseres Mosquito: Identifizierung der Gene aktivieren Malaria und Dengue-Fieber Widerstand in A. gambiae und A. aegypti Moskitos

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