Organotypischen Kultur der E18 Gehirn von Ratten

Mein Name ist Laura Elias. Ich bin Doktorandin im Bereich Neurowissenschaften und arbeite im Labor von Arnold K. Stein. Wir befinden uns am Institut für Regenerationsmedizin hier an der UCSF, und heute werde ich Ihnen zeigen, wie man organotypische Schnittkulturen von E18-Rattengehirnen herstellt.

Dieses Verfahren beinhaltet das Herausschneiden der Gehirne, das Einbetten in Low-Melt-Agarose, das Schneiden auf dem Viome und das Gewinnen Ihrer Koronarschnitte sowie das anschließende Platzieren in das Schnittkultursystem. Für dieses Verfahren der Schnittkultur verwenden wir einige wichtige Geräte und Reagenzien. Sie benötigen ein Stereomikroskop, um die Gehirne herauszuschneiden.

Wir verwenden dieses V ebenfalls wie ein VT 1000 S Vibram, und das ist ein gutes System zum Schneiden der Schnitte. Der Kleber kann wichtig sein. Wir verwenden diesen Lock-Typ für einen Kleber, der die Gehirne sehr gut verklebt, da die Gehirne manchmal abfallen, wenn Sie den falschen Kleber verwenden, während Sie versuchen, sie zu schneiden, und das kann problematisch sein.

Wir verwenden außerdem diese Milli-Cell-Filter, auf denen wir unsere Schnitte während der Kultur ausplattieren, und dies ist ebenfalls ein wichtiger Teil des Verfahrens. Bevor Sie mit dem Kulturverfahren für Gewebeschnitte beginnen, müssen einige Schritte vorab erledigt werden. Zunächst müssen Sie Ihr aCSF herstellen. Sobald Sie die Herstellung des aCSF abgeschlossen haben, sollten Sie es auf Eis stellen, damit es abkühlt, und gleichzeitig mit Carbogen durchblubbern lassen.

Sie sollten außerdem Ihr 4 % Agaros herstellen. Verwenden Sie hierfür niedrigschmelzendes Agaros, lösen Sie es in einem CSF auf, erwärmen Sie es in der Mikrowelle und bewahren Sie es anschließend bei 50 Grad auf, bis Sie Ihr Gehirn einbetten. Außerdem sollten Sie Ihr Schnittkulturmilieu herstellen; nachdem Sie das Schnittkulturmilieu hergestellt haben, stellen Sie es auf 37 Grad, damit es sich erwärmt und am Ende die richtige Temperatur hat, wenn Sie Ihre Schnitte hineinlegen.

Und an diesem Punkt sollten Sie bereit sein, Ihre Werkzeuge zusammenzustellen und den Schnittkulturprozess zu beginnen. Gut, jetzt werden wir Schnittkulturen aus den Gehirnen von Rattenembryonen des embryonalen Tages 18 anfertigen. Zunächst werde ich überprüfen, ob die Mutter vollständig anästhesiert ist, indem ich eine Zehenquetschung durchführe.

Hier ist ein Beispiel, bei dem die Ratte noch einen kleinen Reflex hat und ihr Hinterbein leicht zurückzieht, wenn ich an ihrem Fuß drücke. Daher müssen wir entweder länger warten oder die Anästhesie etwas vertiefen, bis keine Reaktion mehr zu sehen ist. Dann werde ich fortfahren und die Bauchhöhle öffnen, um die Embryonen zu entnehmen.

Und ich möchte die Haut einfach anheben, damit ich einen sauberen Schnitt machen kann. Entfernen Sie hier einige der Embryonen, und ich werde sie herausschneiden. Sie können zwischen zwei Embryonen schneiden und dann entlangschneiden.

Und nun können wir diesen Embryo entfernen und ihn durch einen Schnitt direkt neben der Plazenta von dieser ablösen. Jetzt überführen wir den Embryo in kalte A-CSF und entfernen den Rest des Sacks hier. Ja, das ist es, und hier abschneiden.

Jetzt ist dieses Embryo bereit, und wir werden Gehirnschnitte anfertigen. Gut, jetzt haben wir unser Embryo, und ich werde hier den Kopf mit der Schere entfernen. Okay, jetzt bin ich bereit, das Gehirn zu präparieren.

Zunächst müssen wir den Kopf fixieren, und das tun wir, indem wir Stifte durch die Augenhöhlen sowie in das Hinterhirn einbringen. Dies hilft uns, das Gehirn in der Schale zu immobilisieren. Wie Sie hier sehen, haben wir nun ein fixiertes Gehirn in unserer Schale, und wir beginnen damit, einen Schnitt im Hinterhirn zu machen und uns dann weiter nach vorne zu arbeiten.

Ich beginne nun mit einem Schnitt in der Nähe des Kleinhirns. Ich führe meine Schere unter die Haut und den Schädel und verlängere dann den Schnitt in Richtung Roswell-Gebiet. Anschließend mache ich zwei weitere seitliche Schnitte am hinteren Ende der Großhirnrinde, nahe dem Sero meum.

Ich werde Schnitte in lateraler Richtung und dann einen weiteren Schnitt dort durchführen. Anschließend verwende ich meine Pinzette, um den Schädel wie folgt abzulösen. Nun haben wir das Geflecht freigelegt und ich werde es nun derart aus dem Kopf herausschöpfen.

So haben Sie nun Ihr vollständig präpariertes Gehirn vorliegen. Gut, jetzt werden wir diese Gehirne in Agarose einbetten; ich habe bereits 4 %ige Low-Melt-Agarose hergestellt. Diese stellen Sie in Ringer-Lösung her, erwärmen sie in der Mikrowelle und halten sie anschließend bei etwa 50 °C warm, damit sie flüssig bleibt.

Und nun werde ich mit dem Einbettungsprozess beginnen. Ich nehme etwas von diesem Agar und gebe es in diese Schalen, die ich dann bis fast an den Rand fülle. Als ersten Schritt nehmen Sie nun Ihre Gehirne und spülen sie einfach in einer Schale mit Agar ab.

Sie möchten keine überschüssige Flüssigkeit auf den Gehirnen, da diese verhindert, dass sie gut in das Agarosegel einbetten und daran haften. Wenn Sie sie im ersten Schritt nicht gründlich waschen, lösen sie sich tendenziell aus der Agarose, wenn Sie versuchen, sie am Vibratom zu schneiden. Daher schwenken wir sie einfach und versuchen, die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.

Dann überführen wir diese Gehirne in andere Schalen, die mit dem hier gezeigten 4 %igen Agarose gefüllt sind. Nun positionieren wir die Gehirne in der Agarose. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass sie weder zu nahe am Boden noch zu nahe an der Oberseite der Schale liegen, sodass sie auf allen Seiten von Agarose umgeben sind.

Dann legen wir den Deckel über diese Schale, verschließen sie und stellen die Schale anschließend auf Eis, damit das Agarosegel erstarrt und das Gehirn gut in der Agarose eingebettet wird. Die Agarose sollte in etwa fünf bis zehn Minuten verfestigt sein. So, nun haben wir unsere Gehirne in Agarose eingebettet und werden nun damit beginnen, sie hier am Vibratom zu schneiden, um Schnitte mit einer Dicke von etwa 300 µm herzustellen, die wir für die Kultur von Gewebeschnitten verwenden werden. Dies werden wir ebenso wie alle anderen bisher durchgeführten Schritte in kaltem, mit Carbogen durchblästem ACSF durchführen.

Und nun sind wir bereit, loszulegen. Gut, jetzt werden wir beginnen, das Gehirn aus dem Agros zu entnehmen. Dazu entfernen wir einfach hier die Oberseite, und manchmal muss man nachhelfen, um sicherzustellen, dass der Agros-Block vollständig aus der Oberseite herauskommt.

Mal sehen. Sie können es einfach in den unteren Teil hineinlegen. Nun haben wir die Agros, und was wir tun werden, ist, in die Agros hineinzuschneiden, sodass wir im Grunde das Gehirn herausschneiden.

Ich werde also vier Schnitte machen, einen von hinten und dann einen ganz vorne sowie zwei entlang der Seiten. Ich schneide praktisch das Gehirn so heraus, wie wir es eingebettet haben. Nun haben wir also Einschnitte gemacht und das Gehirn im Agaros geschnitten.

Und jetzt sollten wir im Grunde unser Gehirn einfach aus dem Agaroseblock herausholen können. Unser Gehirn ist soeben herausgekommen und ist in der Agarose eingebettet. Nun nehmen wir den Kleber und bringen ihn auf diesem kleinen Podest hier an.

Wir werden nun etwas Klebstoff auftragen und das Gehirn direkt darauf platzieren. Dabei zeigt das Kleinhirn, also das Hinterhirn, nach unten in Richtung des Klebstoffs, während die Riechrinde oder das rostrale Ende senkrecht nach oben weist. Anschließend bringen wir dies in die Vibram-Kammer.

Jetzt überführe ich das Gehirn in das Vibrom, in dem wir es schneiden werden. So, hier ist es. Wir legen es in das Vibrom ein und befestigen es derartig fest.

Dann fügen wir die kalte, perlorierende ACSF hinzu, die ich hier auf Eis habe. Dadurch wird der Klebstoff ebenfalls verfestigt, was wichtig ist. Nun ist unser Gehirn auf der Platte im Vibratome befestigt.

Jetzt sind wir bereit, mit dem Schneiden des Gehirns am Vibratom zu beginnen. Ich werde etwas von diesem überschüssigen Agar hier entfernen. Dazu führen wir einen kleinen Schnitt durch und entfernen diesen Teil.

Jetzt haben wir unser Gehirn hier. Ich werde die Klinge hier auf den Vibratomkopf setzen. Die Klinge wird also hier eingeführt und auf das Vibratome gesetzt.

Und ich werde hier auch diese kleine Pipette abschneiden, damit sie groß genug ist, um die Schnitte aufzunehmen, sobald ich sie geschnitten habe. Das hätten wir also. Und jetzt sind wir bereit, mit dem Schneiden zu beginnen.

Wie bereits gesagt, habe ich für diese Schnitte eine Dicke von 300 Mikrometern verwendet. Daher müssen wir unsere Klinge in Richtung des Gehirns bewegen, indem wir den Objekttisch nach oben fahren. Zunächst positionieren wir die Klinge direkt vor dem Gewebe. Die ersten Schnitte treffen entweder nur das Agar oder möglicherweise die äußersten Ränder des Gewebes, dienen aber hauptsächlich der korrekten Positionierung der Klinge.

Wir haben die Vibration bei etwa sieben und unsere Geschwindigkeit liegt bei etwa fünf. Wir schneiden hier also kortikale koronare Schnitte. Wir beginnen am äußersten rostralen Ende des Gehirns und sind aktuell erst gerade eben ins Gehirn eingedrungen.

Wir beginnen gerade. Dies ist also unser erster Schnitt, aber er liegt bereits fast, er ist an dieser Stelle sehr rostral. Wir werden daher meine Handabschnitte beibehalten.

Während die Schnitte austragen, entferne ich sie mit dem Fuß und lege sie in blubberndes, bei Raumtemperatur befindliches ACSF. Es ist außerdem optional, hier Eis in die Kammer zu geben, um alles mit diesen embryonalen Gehirnen noch kälter zu halten. Erste Eiskultur.

Sie scheinen sich perfekt zu entwickeln, solange Ihre ACSF eiskalt ist. Für andere Experimente oder wenn Ihre Gehirne etwas älter sind, sollten Sie jedoch Eis in Ihre Kammer geben, um alles extrem kalt zu halten. Nun haben wir unsere Schnitte in der belüfteten ACSF.

Sie können hier etwa bis zu einer Stunde verbleiben, aber wir können sie auch direkt in unser Schnittkultursystem überführen. Gut, jetzt sind wir bereit, die Schalen und das Kultursystem vorzubereiten, damit wir die soeben hergestellten Schnitte inkubieren können. Dazu nehmen wir hier eine 6-Loch-Platte.

Und wir werden in jede dieser Vertiefungen etwa eineinhalb Milliliter dieses vorbereiteten und auf 37 Grad erwärmten Schnittkulturmediums geben, also etwa eineinhalb Milliliter in jede dieser Schalen. Dann nehme ich meine Filter. Wir werden die Gehirnschnitte tatsächlich auf diese Filter legen, aber zuvor kommen diese Filter in dieses hier vorliegende Medium.

Wir werden die Filter auf das Medium legen, das Sie entfernen möchten, und sicherstellen, dass sich die Blasen zumindest an der Seite befinden. Unter dem Filter dürfen keine Blasen sein. Diese Filter ermöglichen es den Schnitten, die Nährstoffe aus dem Medium aufzunehmen, während sie weiterhin der Luft ausgesetzt bleiben, sodass sie im Wesentlichen nicht ersticken.

Jetzt haben wir unsere Filter in der Schale und sind bereit, unsere Schnitte zu entnehmen und auf die Filter zu übertragen. Hier in dieser Schale liegen nun unsere Schnitte, und ich habe den Großteil des A-CSF entfernt. Daher möchte ich schnell das Schnittkulturmedium hinzufügen, da man die Schnitte im Grunde aus dem A-CSF in das Schnittkulturmedium überführen möchte.

Ich werde nun einfach Kulturmedium zu meinen Schnitten hinzufügen. Versuchen Sie, dies vorsichtig durchzuführen, damit die Schnitte nicht allzu sehr beschädigt werden. Jetzt befinden sich meine Schnitte im Kulturmedium, und ich werde sie lediglich auf diese Filter übertragen, die drei Filter, die ich hier vorbereitet habe.

Ich nehme nun mein Pipettiergerät und sauge die Schnitte auf, um sie auf den Filter zu geben. Sie können mehrere Schnitte auf demselben Filter platzieren oder, falls gewünscht, jeweils nur einen Schnitt verwenden. Ich werde hier mehrere Schnitte auf diesen Filter legen.

Und dann ist es wichtig, hier diese überschüssige Mediummenge zu entfernen, die Sie übertragen haben. Hier nehme ich also einfach die zusätzliche Menge Medium auf, die ich zusammen mit den Schnitten übertragen habe, da Sie nicht zu viel Medium in diesen Schalen haben möchten; andernfalls würden die Schnitte mit Medium bedeckt sein und würden nicht so lange überleben, weil sie in der Regel nicht genügend Sauerstoff erhalten. So, ich habe das überschüssige Medium entfernt, und nun liegen meine Schnitte einfach auf dieser Schale und sind bereit, in den Inkubator gestellt zu werden.

Gut, jetzt können diese Schnitte in den 37-Grad-Inkubator gegeben werden. Sie sind etwa fünf bis sieben Tage lang verwendbar. Dabei wechseln wir das Medium alle drei Tage, indem wir jeweils die Hälfte des Mediums austauschen und durch frisches Medium ersetzen.

Und so werde ich diese Kulturen einfach in den Inkubator stellen. Gut, das war's. Wir sind fertig.

Daher verwenden wir diese Technik in unserem Labor, um verschiedene Aspekte der kortikalen Entwicklung zu untersuchen, einschließlich der Vorläuferzellteilungen und der neuronalen Migration. Diese Technik kann besonders nützlich sein, wenn sie mit Zeitraffer-Mikroskopie kombiniert wird, sodass Sie einzelne Zellen verfolgen können, während sie sich in Ihrer Schnittkultur teilen und migrieren.