Name: Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Lernen Sie die Western-Blot-Probenvorbereitung für die Proteindetektion in Geweben. Diese Methode ermöglicht Forschern die zuverlässige Analyse spezifischer Proteine mit hochwertigen Reagenzien.

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1. Probenvorbereitung Der erste Schritt in Western-Blot ist die Probenvorbereitung. Zur Vorbereitung Proben für den Betrieb eines Gels Zellen und Gewebe müssen lysiert, um die Proteine ​​von Interesse freizugeben. <ul><li> Eine bequeme, ready-to-use Reagenz, das vielseitig und leicht zu lösliches Protein-Extraktion verwendet wird, ist CytoBuster oder PhosphoSafe. Diese Extraktionspuffer enthalten Waschmittel für die effiziente Gewinnung von löslichen Proteinen aus Säugetier-und Insektenzellen optimiert. Die sanfte, nicht-ionische Zusammensetzung der CytoBuster Protein Extraction Reagent ermöglicht Isolation von funktionell aktiven endogenen oder exprimierten Proteine, ohne die Notwendigkeit für sekundäre Behandlung wie Ultraschall oder Frost / Tau. PhoshoSafe hat den zusätzlichen Vorteil, mit vier Phosphatase-Inhibitoren. <ol><li> Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (zB 5 min bei 2500 xg), lassen Sie das Zellpellet gut. </li><li> Resuspendieren der Zellen in CytoBuster Protein Extraction Reagent mit 150 ul pro 10 6 Zellen (optimale Menge an CytoBuster Protein Extraction Reagent kann auf Zellgröße variieren). </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> In einen geeigneten Schlauch und Spin für 5 min bei 16.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Übertragen gelöscht Überstand (Zellextrakt) in ein frisches Röhrchen und fahren mit der Analyse. </li></ol></li><li> Für spezielle Protein-Extraktion, empfehlen wir die Verwendung unserer hochwertigen ProteoExtract Kits. EMD verfügt über mehr als ein Dutzend Kits für mitochondriale Isolierung, subzelluläre Proteom-Extraktion, Transmembranprotein Extraktion, und viele andere. Bitte besuchen Sie unsere Western-Blot-Landing-Page für weitere Details. </li><li> EMD verkauft auch eine Vielzahl von Protease-und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail-Sets. Sobald Lyse auftritt, beginnen Proteolyse, Dephosphorylierung und Denaturierung. Diese Ereignisse können sich enorm sein, wenn die Proben auf Eis oder bei 4 gehalten werden verlangsamt ° C zu allen Zeiten und geeignete Inhibitoren werden in frischem Zustand an den Lysepuffer. Bitte besuchen Sie unsere Western-Blot-Landing-Page für weitere Details. </li></ul> 2. SDS-PAGE Der zweite Schritt in Western-Blot ist Protein-Trennung. Proteine ​​sind auf der Grundlage Molekulargewicht aufgetrennt. <ul><li> Sie können Ihre eigene PAGE-Gel zu machen, aber wir werden mit einem handelsüblichen pre-cast-Gel. <ol><li> Nach der Vorbereitung Ihrer Probe, sind Sie bereit, die Protein-Konzentration bestimmen. EMD hat zwei Kits für diese die Konzentration zu messen, nämlich zum einen die nicht störende Protein Assay Kit und das andere ist das BCA Protein Assay Kit. </li><li> Sobald die Proteinkonzentration beurteilten wir sind bereit, unsere Probe für das Laden der Gel vorzubereiten. Antikörper in der Regel erkennt ein kleiner Teil des Proteins von Interesse (im Folgenden als das Epitop) und dieser Domain können innerhalb der 3D-Konformation des Proteins befinden. Um den Zugriff des Antikörpers an diesem Teil ist es notwendig, das Protein zu entfalten. </li><li> Um denaturieren, verwenden Sie einen Ladepuffer mit dem anionischen denaturierenden Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS), und kochen Sie die Mischung bei 95-100 ° C für 5 Minuten. Eine einfache und bequeme Ladepuffer zu bedienen ist 4X Sample Buffer. </li></ol></li><li> Legen Sie die erste Spur der gut mit Trail Mix Protein Marker. Dieser Marker hat drei Referenz-Bands, die man Elektrophorese überwachen können. Wenn das Gel gefärbt ist, sind 10 Banden sichtbar reicht von 10 bis 225 kDa. </li><li> Füllen Sie die Elektrophorese-Einheit mit Laufpuffer. Für PAGE Gele, ist dies in der Regel 1X Tris-Glycin. Für detaillierte Puffer Rezepte finden Sie auf der Western-Blot-Seite. EMD bietet hochwertige Puffer Reagenzien mit unseren OmniPur chemische Linie. Führen Sie das Gel bei 220 V für 1 Stunde. </li><li> Sobald der Proteine ​​getrennt haben, färben Sie das Gel mit Coomassie-Blau, um sicherzustellen, die Proteine ​​gleichmäßig und einheitlich migriert. RAPIDstain ist ein ultra-sensitive Fleck, ready-to-use ist. Keine Entfärbung erforderlich ist. </li></ul> 3. Protein übertragen So wie Proteine ​​mit einer elektrischen Ladung induziert werden können, um durch ein Gel in einem elektrischen Feld zu reisen, können so die Proteine ​​in einem elektrischen Feld aus dem Gel werden auf eine Membran übertragen, die entweder PVDF oder Nitrocellulose. <ul><li> Heute werden wir eine nasse übertragen. In nassen übertragen, sind die Gel und Membran zwischen Schwamm und Papier (Schwamm / Papier / Gel / Membran / Papier / Schwamm) und alle sind fest zusammen, nachdem sichergestellt keine Luftblasen zwischen dem Gel und Membran gebildet eingeklemmt eingeklemmt. Das Sandwich wird in Transfer-Puffer, auf die ein elektrisches Feld angelegt wird überflutet. Die negativ geladenen Proteine ​​Reise in Richtung der positiv geladenen Elektrode, sondern die Membran hält sie, bindet sie und verhindert, dass sie weiter auf. </li><li> Zwei Arten von Membranen zur Verfügung: Nitrocellulose und PVDF. Beide funktionieren gut. Heute werden wir mit PVDF. PVDF-Membranen erfordern in Methano Einweichenl für ein paar Minuten, um eiskalt Transfer-Puffer für 5 Minuten. Das Gel muss auch für ein paar Minuten in eiskaltes Transferpuffer äquilibriert. Andernfalls kann das Gel während der Übertragung zu schrumpfen. </li><li> Der Puffer für feuchte Übertragung 1X Tris-Glycin mit 20% Methanol. Detaillierte Puffer Vorbereitungen sind auf unserer Website verfügbar. </li><li> Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, ist es eine gute Idee, um Proteine ​​zu visualisieren, um auch sicher zu übertragen, ohne Lufteinschlüsse. Dies kann leicht mit RedAlert Western Blot Stain durchgeführt werden. Dieser Fleck ist ready-to-use und Entfärben kann einfach mit Wasser erfolgen. </li></ul> 4. Antikörper und Zubehör Reagenzien <ul><li> Der erste Schritt dabei Sondieren und Antikörper-Antigen ist, um die Membran zu blockieren. Das Blockieren der Membran verhindert unspezifische Hintergrund bindend. </li><li> Entweder fettfreie Milch oder BSA kann als Blocking-Lösung verwendet werden. Wenn Sie jedoch phospho-spezifische Antikörper, ist es nicht empfehlenswert, Milch verwenden, da es hohen Hintergrund verursachen. </li><li> EMD bietet mehrere hochwertige Blockierungsreagenzien, einschließlich Seablock, die eine Nicht-Säuger-Blocker und BLOT QuickBlocker, die bereit ist, ready-to-use Blocker. Wir haben auch hochwertige BSA (Fraktion V) zur Verfügung. <ol><li> Inkubieren Sie die Membran 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Dreimal in TBST oder PBST nach Inkubation. Eine einfache und bequeme Möglichkeit, TBST oder PBST machen, ist unsere Tabletten verwenden (PBS Tween Tablets / TBS Tween-Tabletten) </li></ol></li><li> Sobald die Membran blockiert wurde, sind Sie bereit, mit dem primären Antikörper inkubiert. EMD wurde mit einem umfassenden Portfolio an außergewöhnlichen Antikörper mit den besten Antikörper Garantie in der Industrie seit über 30 Jahren. Denken Sie daran, dass mit allen EMD Antikörper, wir eine 100% ohne Risiko-Garantie anbieten. Kauf eines Antikörpers und verwendet sie für keine Spezies-Spezifität oder Anwendung Sie wünschen. Wenn der Antikörper nicht zu Ihrer Zufriedenheit funktioniert, werden wir eine volle Gutschrift auf ein anderes Produkt verwendet werden. Für weitere Informationen, besuchen Sie bitte unsere Western-Blot-Web-Seite. <ol><li> Heute werden wir unseren Inkubation primärer Antikörper mit Lösung 1 von SignalBoost. SignalBoost ist ein großartiges Produkt ermöglicht das Signal erheblich verbessert werden. Einfach inkubieren Ihre primäre Antikörper in Lösung 1 und Inkubation für 1 Stunde oder wie gewohnt. Es gibt keine Notwendigkeit, weitere Blockierungsmittel hinzuzufügen. Alternativ können Sie BSA oder fettfreie Trockenmilch als Blockierungsmittel. </li><li> Waschen mit TBST. Wir machen TBST mit dem ready-to-Auflösung TBST Tablette. </li><li> Inkubieren Sie Ihre sekundären Antikörper mit Lösung 2 von SignalBoost. Inkubieren der sekundäre Antikörper in Blocking-Puffer für 1 Stunde. Waschen Sie die Membran wieder mehrmals mit TBST. </li></ol></li></ul> 5. Erkennung Für HRP konjugiert Sekundärantikörper wird ECL traditionell verwendet. Eine ausgezeichnete ECL-Reagenz wir anbieten, ist RapidStep. Die Vorteile der RapidStep sind, dass keine Vermischung der luminalen oder Enhancer benötigt wird. Einfach aufsprühen die Membran ein paar Mal und entwickeln mit x-ray-Film. RapidStep bietet niedrige Piktogramm Empfindlichkeit sowie die Licht für bis zu 2 Stunden nach der Zugabe von Substrat.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren Anna Eslami und Jesse Lujan von EMD Chemicals Inc., die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendete produziert beschäftigt.

In diesem Video-Präsentation haben wir die wichtigsten Schritte in Western-Blot die Probenvorbereitung werden hervorgehoben, SDS-PAGE-, Membran-Sperrung / Sondieren mit Antikörpern und Detektion. Für jeden Schritt des Prozesses, sollten geeignete Protokolle und entsprechenden Reagenzien verwendet werden, um hochwertige Ergebnisse zu erzielen sein.

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; Protein-Extraktionsreagenz</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; Extraktionsreagenz</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Nicht interferierender Protein-Assay&amp;#8482; Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BCA-Protein-Assay-Kit </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4X SDS-Probelösung </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Trail-Mix&amp;#8482; Proteinmarker</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Proteine&amp;#8211;xtrahieren&amp;#8482; Protein-Extraktions-Kits</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; Produkte</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; Reagenz</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; 10X Western Blot Färbung</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; Reagenz, Lachsplasma</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BLOT-QuickBlocker-Reagenz</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Albumin, Rinderserum, Fraktion V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-Tween&amp;#174; Tabletten</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-TWEEN&amp;#174; Tabletten</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SignalBoost&amp;#8482; Immunreaktions-Verstärker-Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; ECL-Reagenz</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

western blot: probenvorbereitung zur detektion

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western-Blot ist eine analytische Technik verwendet, um bestimmte Proteine ​​in einer Probe von Gewebehomogenat oder Extrakt zu erkennen. Es nutzt Gelelektrophorese zur nativen oder denaturierten Proteinen durch die Länge des Polypeptids (denaturierende Bedingungen) oder durch die 3-D Struktur des Proteins (native / nicht-denaturierenden Bedingungen) zu trennen. Die Proteine ​​werden anschließend auf eine Membran (in der Regel Nitrozellulose oder PVDF), wo sie untersucht (erkannt) mit Antikörpern, die spezifisch an das Zielprotein übertragen.

Western-Blot ist eine analytische Technik verwendet, um bestimmte Proteine ​​in einer Probe von Gewebehomogenat oder Extrakt zu erkennen.

Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

Western Blotting ist eine analytische Technik, die zum Nachweis spezifischer Proteine in einer gegebenen Probe aus Gewebehomogenat oder Extrakt eingesetzt wird. Sie nutzt Gel- ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Einfachheit der Durchführung einer Western Blot-Analyse unter Verwendung geeigneter Produkte zu demonstrieren. Nach der Probenvorbereitung werden die Proteine entsprechend ihrer Größe getrennt und anschließend auf eine feste Phase übertragen. Die Proteine werden dann mit Antikörpern nachgewiesen, und die Anwendung geeigneter Protokolle sowie hochwertiger, kosteneffizienter Reagenzien führt zu verbesserten Western Blot-Ergebnissen.Hallo, ich bin Jesse Luhan, Forschungs- und Entwicklungswissenschaftler bei EMD Chemicals in San Diego, Kalifornien. EMD ist eine Tochtergesellschaft von Merck KGaA in Darmstadt, Deutschland. Heute werden wir Ihnen ein Western-Blot-Verfahren zeigen.Beginnen wir also. Der erste Schritt beim Western Blot ist die Probenvorbereitung. Starten Sie die Probenvorbereitung, indem Sie die Zellen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletieren, beispielsweise fünf Minuten bei 2.500 ×g.Nach der Zentrifugation die Zellpellets abpipettieren. Die Zellen gut in CytoBuster-Protein-Extraktionsreagenz resuspendieren, wobei 150 Mikroliter pro 106 Zellen verwendet werden. Die Probe fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Als Nächstes wird die Probe fünf Minuten bei 16.000 × g und vier Grad Celsius nach der Zentrifugation zentrifugiert. Überführen Sie das geklärte SNA in ein frisches Gefäß und fahren Sie mit der Analyse fort. Nachdem die Proteinkonzentration der Probe bestimmt wurde, bereiten Sie die Probe zum Beladen des Gels vor, um das Protein zu denaturieren.Verwenden Sie einen Probenpuffer, der ein ionisches denaturierendes Detergens wie Natriumlaurylsulfat oder SDS enthält. Erhitzen Sie das Gemisch fünf Minuten lang auf 95 bis 100 Grad Celsius. Mithilfe eines kommerziell erhältlichen vorgefertigten Gels können Proteine schnell entsprechend ihrem Molekulargewicht getrennt werden.Füllen Sie die Elektrophoreseeinheit mit Laufpuffer, der aus Reagenzien der Omni-PU-Chemikalienreihe hergestellt werden kann. Beladen Sie die erste Spur des Wells mit dem Trail-Mix-Proteinkalibrierungsmarker. Dieser Marker verfügt über drei Referenzbanden, die eine Überwachung während der Elektrophorese ermöglichen.Nach der Färbung des Gels sind 10 Banden sichtbar, die von 10 bis 225 Kilodalton reichen. Geben Sie die denaturierte Probe in die verbleibenden Vertiefungen. Führen Sie das Gel eine Stunde lang bei 220 Volt durch.Nachdem sich die Proteine getrennt haben, färben Sie das Gel mit Kumasisierblau, um sicherzustellen, dass die Proteine gleichmäßig und einheitlich migriert sind, unter Verwendung einer Schnellfärbung und einer ultrav sensitiven Färbung, die gebrauchsfertig ist, ohne dass ein DS-Färbeschritt erforderlich ist. Genauso wie Proteine mit elektrischer Ladung durch ein elektrisches Feld durch ein Gel bewegt werden können, können die Proteine in einem elektrischen Feld vom Gel auf eine Membran wie NITROCELLULOSE oder PVDF übertragen werden. Bei Verwendung von PVDF-Membranen tauchen Sie die Membran einige Minuten in Methanol ein, gefolgt von einer Äquilibration in eiskaltem Transferpuffer für fünf Minuten. Tauchen Sie außerdem das Gel einige Minuten in eiskalten Transferpuffer ein; die Äquilibration verhindert eine Schrumpfung des Gels während des Transfers.Bei einem nassen Transfer wird ein Sandwich aus Gel und Membran zwischen Schwamm und Papier zusammengestellt. Danach wird die Anordnung fest zusammengedrückt, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keine Luftblasen zwischen Gel und Membran gebildet haben. Das Sandwich wird in Transferpuffer getaucht und ein elektrisches Feld angelegt.Die negativ geladenen Proteine wandern zur positiv geladenen Elektrode. Die Membran hält sie dann an, bindet sie und verhindert, dass sie weiterwandern. Nach Abschluss der Übertragung sollten die Proteine sichtbar gemacht werden, um eine gleichmäßige Übertragung ohne Luftblasen zu überprüfen.Dies kann problemlos mit dem roten Western-Blot-Farbstoff („red alert Western blot stain“) durchgeführt werden. Dieser Farbstoff ist gebrauchsfertig, und die Entfärbung kann einfach mit Wasser erfolgen. Dies ist das Gel, nachdem es durch Waschen mit Wasser entfärbt wurde. Bevor die Membran mit Antikörpern nachgewiesen werden kann, wird sie blockiert.Um unspezifische Bindungen zu verhindern, blockieren Sie die Membran mit hochwertigen Blockierreagenzien. Um einen erhöhten Hintergrund zu vermeiden, inkubieren Sie die Membran eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren in der Blockierungslösung und waschen Sie die Membran anschließend dreimal in TBST oder PBST. Diese Puffer können einfach und bequem mit TBS-Tween-Tabletten bzw. PBS-Tween-Tabletten hergestellt werden.Nach dem Blockieren und Waschen der Membran kann diese mit dem primären Antikörper inkubiert werden. Geben Sie den primären Antikörper unter Verwendung der Lösung eins, einem Signalverstärker, auf, wodurch das Signal erheblich verstärkt werden kann. Bereiten Sie den primären Antikörper in Lösung eins vor und inkubieren Sie die Membran eine Stunde lang.Es ist nicht erforderlich, nach der Inkubation weitere Blockiermittel hinzuzufügen. Waschen Sie die Membran mit TBST. Anschließend inkubieren Sie die Membran mit dem sekundären Antikörper, der in Lösung zwei von Signal Boost verdünnt ist, für eine Stunde.Spülen Sie die Membran abschließend mehrmals mit TBST für HRP-konjugierte Sekundärantikörper. Der Nachweis erfolgt traditionell mittels verstärkter Chemilumineszenz oder ECL. Das ECL-Reagens im Rapid-Schritt-Verfahren wird verwendet, da kein Mischen von Luminol oder Enhancer erforderlich ist.Sprühen Sie die Membran einfach mehrmals an, inkubieren Sie sie zwei Minuten lang und entwickeln Sie sie anschließend mit Röntgenfilm. Rapid Step bietet eine Empfindlichkeit im niedrigen Pikogramm-Bereich sowie eine schwächere Emission für bis zu zwei Stunden nach Zugabe des Substrats. Die Verwendung von Trail-Mix-Proteinmarkern ermöglicht die Verfolgung der Proteine während der Elektrophorese im Vergleich zu Standard-Western-Blot-Protokollen.Signal Boost ermöglicht einen größeren dynamischen Bereich und höhere Empfindlichkeit. Schließlich kann durch die Verwendung von Rapid im Vergleich zu herkömmlichen ECL-Reagenzien eine überlegene Empfindlichkeit erzielt werden. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Western Blotting effizient und kostengünstig mit einer umfassenden Produktpalette durchführt.Denken Sie daran, dass die Qualität Ihrer Ergebnisse von der Qualität Ihrer Reagenzien abhängt. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

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Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

Dieses Video demonstriert die Herstellung von ultra-dünnen Matrix / Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen durch Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

Archiv Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten (FFPE) klinische Proben sind wertvolles Material für die Untersuchung von Krankheiten. Hier zeigen wir eine Probenvorbereitung Workflow ermöglicht eingehende Proteomanalyse mikrodissezierten FFPE Gewebe.

Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

Lernen Sie die Western-Blot-Probenvorbereitung für die Proteindetektion in Geweben. Diese Methode ermöglicht Forschern die zuverlässige Analyse spezifischer Proteine mit hochwertigen Reagenzien.

Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

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