Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Leichtigkeit der Durchführung eines Western Blots bei Verwendung geeigneter Produkte zu demonstrieren. Nach der Probenvorbereitung werden die Proteine nach Größe getrennt und dann in eine feste Phase überführt. Die Proteine werden dann mit Antikörpern untersucht und nachgewiesen. Die Verwendung geeigneter Protokolle und hochwertiger, kostengünstiger Reagenzien führt zu verbesserten Western-Blotting-Ergebnissen.

Hallo, ich bin Jesse Luhan, Forschungs- und Entwicklungswissenschaftler bei EMD Chemicals in San Diego, Kalifornien. EMD ist eine Tochtergesellschaft der Merck, KGAA in Dharm stat Deutschland. Heute zeigen wir Ihnen ein Western-Blotting-Verfahren.

Also lasst uns loslegen. Der erste Schritt beim Western Blotting ist die Probenvorbereitung. Beginnen Sie die Probenvorbereitung, indem Sie die Zellen mit einer Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit pelletieren, z. B. fünf Minuten bei der 2.500-fachen Schwerkraft.

Nach der Zentrifugation die Küvettenpellets abtropfen lassen. Nun, resuspendieren Sie die Zellen in Cyto Buster Protein Extraktionsreagenz mit 150 Mikrolitern pro 10 auf die sechs Zellen. Inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Anschließend wird die Probe nach der Zentrifugation fünf Minuten lang bei 16.000-facher Schwerkraft bei vier Grad Celsius gedreht. Übertragen Sie das gelöschte SNA in ein frisches Röhrchen und fahren Sie mit der Analyse fort. Nachdem die Proteinkonzentration der Probe beurteilt wurde, bereiten Sie die Probe für die Beladung des Gels vor, um das Protein zu denaturieren.

Verwenden Sie einen Probenpuffer, der ein onisches denaturierendes Reinigungsmittel wie Natriumdampfsulfat oder SDS enthält. Koche die Mischung bei 95 bis 100 Grad Celsius fünf Minuten lang. Mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Fertiggels können Proteine schnell anhand des Molekulargewichts getrennt werden.

Füllen Sie die Elektrophoreseeinheit mit Laufpuffer, der aus Reagenzien hergestellt werden kann, die über die chemische Linie Omni PU angeboten werden. Beladen Sie die erste Spur des Brunnens mit dem Studentenfutter-Proteinmarker. Dieser Marker verfügt über drei Referenzbanden, die eine Überwachung während der Elektrophorese ermöglichen.

Sobald das Gel gefärbt ist, sind 10 Banden sichtbar, die von 10 bis 225 Kilo Dalton reichen. Laden Sie die vergällte Probe in die verbleibenden Vertiefungen. Lassen Sie das Gel eine Stunde lang bei 220 Volt laufen.

Sobald sich die Proteine getrennt haben, färben Sie das Gel mit Kumasi-Blau, um sicherzustellen, dass die Proteine gleichmäßig und gleichmäßig migriert sind, indem Sie Rapid Stain und Ultrasensitive Stain, die ohne DS verwendet werden können, verwenden. Die Färbung ist ebenso erforderlich, wie Proteine mit einer elektrischen Ladung dazu gebracht werden können, in einem elektrischen Feld durch ein Gel zu wandern, so dass die Proteine in einem elektrischen Feld vom Gel auf eine Membran wie NITROCELLULOSE oder PVDF übertragen werden können. Wenn Sie PVDF-Membranen verwenden, weichen Sie die Membran einige Minuten lang in Methanol ein, gefolgt von einer Äquilibrierung in eiskaltem Transferpuffer für fünf Minuten. Weichen Sie das Gel auch einige Minuten lang in eiskaltem Transferpuffer E Equilibration ein, um ein Schrumpfen des Gels während des Transfers zu verhindern.

Für einen Nasstransfer montieren Sie ein Sandwich aus Gel und Membran zwischen Schwamm und Papier. Klemmen Sie die Baugruppe dann fest zusammen, nachdem Sie sichergestellt haben, dass sich keine Luftblasen zwischen dem Gel und der Membran gebildet haben. Tauchen Sie das Sandwich in einen Transferpuffer und legen Sie ein elektrisches Feld an.

Die negativ geladenen Proteine wandern auf die positiv geladene Elektrode zu. Die Membran stoppt sie dann, bindet sie und verhindert, dass sie weitergehen. Sobald der Transfer abgeschlossen ist, visualisieren Sie Proteine, um einen gleichmäßigen Transfer ohne Lufteinschlüsse zu gewährleisten.

Dies kann ganz einfach mit einem Westernfleck mit rotem Alarm erfolgen. Diese Beize ist gebrauchsfertig und kann leicht mit Wasser abgefärbt werden. Dies ist das Gel, sobald es durch Waschen in Wasser zurückgehalten wurde, bevor die Membran mit Antikörpern nachgewiesen werden kann, wird die Membran blockiert.

Um eine unspezifische Bindung zu verhindern, blockieren Sie die Membran mit hochwertigen Blockierungsreagenzien. Um einen erhöhten Hintergrund zu vermeiden, inkubieren Sie die Membran eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren und waschen Sie die Membran nach der Inkubation dreimal in TBST oder PBST. Diese Puffer können einfach und bequem mit TBS-Tween-Tabletten bzw. PBS-Tween-Tabletten hergestellt werden.

Sobald die Membran blockiert und gewaschen wurde, kann sie mit dem primären Antikörper inkubiert werden. Wenden Sie den primären Antikörper mit einer Lösung an, einer Signalverstärkung, die eine signifikante Verstärkung des Signals ermöglicht. Bereiten Sie den Primärantikörper in Lösung eins vor und inkubieren Sie die Membran eine Stunde lang.

Es ist nicht erforderlich, nach der Inkubation weitere Blockierungsmittel hinzuzufügen. Waschen Sie die Membran mit TBST. Als nächstes inkubieren Sie die Membran mit dem sekundären Antikörper, der in Lösung zwei der Signalverstärkung verdünnt ist, eine Stunde lang.

Zum Schluss waschen Sie die Membran noch mehrmals mit TBST für HRP konjugiert. Traditionell wird hier der Nachweis von Sekundärantikörpern durch verstärkte Chemilumineszenz oder ECL eingesetzt. Es wird der ECL-Reagenz-Rapid-Step verwendet, da er kein Mischen von Luminol oder Enhancer erfordert.

Sprühen Sie die Membran einfach einige Male ein, inkubieren Sie sie zwei Minuten lang und entwickeln Sie sie mit einem Röntgenfilm weiter. Rapid Step bietet eine geringe Pikogramm-Empfindlichkeit sowie eine leichtere Mission für bis zu zwei Stunden nach der Zugabe des Substrats. Studentenfutter-Proteinmarker ermöglichen im Vergleich zu Standard-Western-Blot-Protokollen die Proteinverfolgung während der Elektrophorese.

Signal Boost ermöglicht einen größeren Dynamikbereich und eine höhere Empfindlichkeit. Schließlich kann eine überlegene Empfindlichkeit durch die Verwendung von Rapid Step anstelle herkömmlicher ECL-Reagenzien erreicht werden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie mit einem umfassenden Produktsortiment die westliche Verblindung effizient und kostengünstig durchführen können.

Denken Sie daran, dass die Qualität Ihrer Ergebnisse von der Qualität Ihrer Reagenzien abhängt. Das wars. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.