In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E16 Rattenembryonen

Hallo, mein Name ist William Ti. Ich komme aus dem Arnold Creek Stein-Labor. Heute werden ich und andere Ihnen die intrauterine Injektion von E16-Rattenembryonen zeigen. Hallo, mein Name ist Laura Elias.

Heute werde ich Ihnen zeigen, wie man die Mikroinjektionspipetten vorbereitet und belädt, um die intraventrikulären Injektionen und Elektroporationen durchzuführen, die wir heute vornehmen werden. Ich werde außerdem zeigen, wie man intraventrikuläre Injektionen und Elektroporationen an E16-Rattenembryonen durchführt. In-utero-Injektionen und Elektroporationen an der Ratte sind besonders nützlich, da die Ratte ein System darstellt, bei dem genetische Modifikationen nur schwer durchführbar sind.

OK, es gibt eine Reihe chirurgischer Instrumente, die wir für diesen Eingriff verwenden. Wir benutzen einen Freer, ein paar Adson-Zangen, ein Paar mit Riffelung und ein weiteres Paar mit einem kleinen Zahn an der Spitze. Außerdem verwenden wir ein Paar Hämostatiken.

Dies ist eine Schere, und dann verwenden wir diese beiden Hefter. Dies ist der größere, den wir für Ratten verwenden. Dies ist der kleinere, den wir für Mäuse verwenden, der einen sieben Millimeter großen Heftstapel verwendet, und dies wird mit einem neun Millimeter großen Heftstapel verwendet, und beide sind einfach federbelastet.

Einige der Dinge, die wir hier zur Unterstützung der Operationen verwenden, sind eine einfache faseroptische Lichtquelle mit Doppelkopf. Wir verwenden eine beheizte Unterlage, die warmes, erwärmtes Wasser zirkulieren lässt, um die Temperatur aufrechtzuerhalten. Als Arbeitsfläche nutzen wir dieses System für die elektive Elektroporation, hergestellt von BTX.

Wir verfügen über mehrere verschiedene Größen von Paddeln, die wir je nach Größe der Embryonen verwenden. Die blaue Seite ist die positive Seite. Gut, jetzt werden wir unsere Injektionspipetten abschrägen.

Und das ist sehr wichtig, damit Ihre Pipette eine ausreichend große Öffnung aufweist, um Ihre DNA aufzunehmen, aber auch sehr, sehr scharf ist, sodass sie den Embryo beim Injizieren nicht beschädigt. Und wenn Sie den Embryo beim Injizieren beschädigen, wird die Sterblichkeitsrate deutlich höher sein. Und das ist nicht gut.

Dies ist also tatsächlich ein sehr wichtiger Vorgang bei diesem chirurgischen Eingriff. Zunächst geben wir etwas Wasser auf diesen Schleifstein, der sich hier dreht. Danach nehmen wir, mal sehen, einfach einen Stab.

Und wir werden unsere Pipette, die wir gerade gezogen haben, mit etwas Klebeband auf diesen Stab setzen. Wir werden einen dieser Mikromanipulatoren verwenden, um die Pipette an der Schräge zu halten und sie hier zu schleifen. Wir platzieren dies also einfach und verwenden ein Mikroskop, um die Pipettenspitze sichtbar zu machen.

Und wir legen es einfach direkt ins Wasser auf die vorherige Schräge, sodass ein leichter Druck ausgeübt wird. Sie können sehen, wie die Spitze hier gegen den Stein drückt. Lassen Sie es dann für einige Zeit – mindestens etwa 15 Minuten – schräg schleifen.

Ich lasse sie manchmal sogar eine Stunde lang so. Manchmal werden sie dadurch sehr, sehr scharf, aber wie lange die Pipetten abgeschliffen werden, hängt definitiv von Person zu Person ab. Gut, hier sehen Sie oben eine gezogene Pipette, die noch nicht abgeschliffen wurde.

Es ist also scharf, weist jedoch keine Öffnung auf, durch die man die DNA laden könnte. Die untere Pipette hingegen wurde abgeschrägt, und Sie können diese schöne, schräge Öffnung sehen. Diese ermöglicht es nun, die DNA zu laden, behält aber weiterhin eine scharfe Spitze, sodass man injizieren kann, ohne Schäden zu verursachen. Gut, nun füllen wir unsere Injektionspipetten mit DNA.

Es ist daher wichtig, dass Sie Ihre DNA endotoxinfrei aufbereiten, damit beim Injizieren der DNA keine Lipopolysaccharide injiziert werden. Wir nehmen nun unsere DNA und bereiten hier tatsächlich unser Paraform vor. Sie stellen also hier Ihr Paraform her und sammeln Ihre DNA, um sie als kleinen Tropfen auf diesem Param aufzutragen.

Und dann nehmen wir – ich nehme üblicherweise pro 10 Mikroliter meiner DNA, die ich normalerweise in einer Konzentration von etwa 1,5 bis 1,7 Mikrogramm pro Mikroliter verwende – etwa ein Mikroliter dieses schnellen Cremefarbstoffs. Dies dient lediglich dazu, uns bei der Lokalisierung der Injektion zu helfen und sicherzustellen, dass wir erfolgreich in das Ventrikel injiziert haben.

Dann mische ich einfach diesen Fast-Green-Farbstoff mit meiner DNA. Danach nehmen Sie Ihre Injektionselektrode und füllen die Pipette, indem Sie den Kolben zurückziehen. Und Sie können hier sehen, dass, wenn die Pipette korrekt ist und eine ausreichend große Öffnung aufweist, die DNA ziemlich leicht eingesaugt werden sollte.

Manchmal müssen Sie den Kolben einfach mehrmals vor und zurück bewegen, um das korrekte Befüllen zu erleichtern. Auf diese Weise können Sie die Pipette dann wie folgt beladen. Die DNA ist nun vollständig in dieser Pipette geladen und bereit für die Injektion.

Okay, ich werde das Tier nun anästhesieren. Wir verwenden diese Dec-Capi-Kappen. Ich rolle einfach den Rand ein wenig zurück, um sie besser halten zu können.

Beginnen wir also. Ich lege es normalerweise einfach an den Rand der Käfigs, um einen kleinen Tunnel für ihn zu bilden, so wie hier. Okay, dieses Tier sieht aus, als wäre es unten.

Wir führen nun eine Zehenquetschung durch, um dies zu überprüfen, und müssen dazu lediglich die Zehe greifen und kräftig zusammendrücken. Nicht zu fest. Man möchte das Tier nicht verletzen, sondern lediglich sicherstellen, dass es bewusstlos ist.

Und dieses Tier ist eindeutig bewusstlos. Ich werde daher fortfahren und ihren Bauch rasieren. Ich möchte die Tet vermeiden, damit Sie die Enden nicht abschneiden.

Ich denke, es könnte sehr schmerzhaft für das Tier sein. Daher wird das Tier rasiert. Jetzt werde ich es in den Abzug bringen.

Wir werden sie säubern und mit dem Eingriff beginnen. Okay, wir haben bestätigt, dass dieses Tier erneut bewusstlos ist, und sind nun bereit, zunächst die Säuberung durchzuführen. Ich werde etwas Augensalbe auftragen, um zu verhindern, dass ihre Augen austrocknen – jeweils ein wenig auf jedes Auge.

Danach führen wir abwechselnd Abreibungen mit Alkoholtupfern und Jodtupfern durch. Dies wiederholen wir dreimal, also insgesamt drei abwechselnde Abreibungen. Dabei müssen wir sehr vorsichtig sein, um die Embryonen während des Vorgangs nicht zu beschädigen.

Sie sollten also einfach gerade nach unten wischen und dann direkt wieder zurück. Das ist Schritt eins. Ich muss sie zuerst gut befeuchten, damit ich die Abstriche durchführen kann. Gut.

Das ist zwei und das ist drei. Okay, wir haben diese Abdeckung angebracht, um die Sterilität zu gewährleisten, und jetzt werde ich das Tier öffnen. Schneiden wir also.

Als Erstes muss ich die Sterilisation vornehmen. Wir ziehen sterile Handschuhe an und können hier nun öffnen. Es ist immer wichtig zu bestätigen, dass das Tier noch ruhig liegt.

Ich werde also einen weiteren Zehenquetschtest durchführen, und wir werden dies während des gesamten Eingriffs tun. Normalerweise quetsche ich zunächst leicht das Gewebe, führe schnell einen Schnitt durch, halte es oben fest und schneide nach unten, greife dann mit dem anderen Paar Pinzetten, um das Gewebe auseinanderzuhalten.

Dann greifen Sie den Muskel, den Sie möchten, und schneiden entlang der Mittellinie, sodass keine Gefäße oder Nerven verletzt werden. Achten Sie darauf, nicht versehentlich das Sure zu erfassen. Es sieht also so aus, als hätten wir hier eine gute Ausbeute.

Ich möchte sicherstellen, dass es gut geschmiert bleibt, damit es nicht austrocknet. Und ich werde noch einen weiteren Tropfen hinzufügen, nur um sicherzugehen, dass alles in Ordnung ist, und es sieht so aus, als wäre alles gut. Ich positioniere diese stets für Laura, und was ich normalerweise mache – beziehungsweise immer mache – ist, den Kopf so zu platzieren, dass der Embryokopf auf der rechten Seite der Mutterratte liegt, einfach der Einheitlichkeit halber.

Und nun werde ich beginnen. Hier können wir den Embryo sehen. Wir erkennen den Schwanz und die hintere Linse hier sowie den Kopf weiter oben.

Hier betrachten wir den Kopf dieses Embryos. Sie können die Mittellinie an dieser dunklen Linie erkennen. Sie sehen die linke und die rechte Hemisphäre sowie das Nachhirn.

Jetzt werde ich die Injektion in der linken Hemisphäre vornehmen. Mit der Pipette injektieren, leicht zurückziehen und den Farbstoff injizieren. Wie Sie sehen, breitet er sich nun im linken Seitenventrikel aus.

Und das sieht nach einer erfolgreichen Injektion aus. Gut, jetzt sehen wir, dass sich die Ventrikel gut gefüllt haben. Die Farbe ist tatsächlich vom linken zum rechten Ventrikel übergetreten.

Wir haben also D und DNA in beiden Ventrikeln. An dieser Stelle nehme ich meine Elektroporations-Elektroden und platziere sie über das Gehirn, wobei die positive Elektrode auf der linken Seite liegt. Dadurch gelangt die DNA in die Vorläuferzellen und die kortikale Wand der linken Hemisphäre.

Und nun leite ich den Strom durch. Wenn wir den elektrischen Strom einschalten, sehen Sie einen Schaum an der negativen Elektrodenstelle. Das ist beruhigend und zeigt Ihnen, dass Sie die richtigen Kontakte hergestellt haben.

Okay, jetzt, da wir diese Embryonen elektroporiert haben, werde ich sie wieder einsetzen und zunähen. Ich werde ihr nun 10 ml antibiotische chirurgische Nahtlösung verabreichen. Ich bevorzuge Blockstiche.

Danach werden wir die Haut mit dem Hauthefter verschließen. Okay? Gut. Ich habe ihr eine Dosis Buprenorphin verabreicht, um sicherzustellen, dass sie keine Schmerzen verspürt, wenn sie aus der Narkose aufwacht. Nun lege ich sie in den Inkubator, der sie während des Aufwachens warm hält, um sicherzustellen, dass keine Hypothermie auftritt.

Okay, wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man intrauterine, intraventrikuläre Injektionen und Elektroporation durchführt. Bei der Ratte können Sie eine Reihe verschiedener Substanzen injizieren. Sie können beispielsweise direkt ein Virus, einschließlich Lentivirus oder Retrovirus, in das Ventrikelgefüge spritzen.

Und in diesem Fall ist eine Elektroporation nicht erforderlich, da das Virus in die Zellen integriert wird. Wenn Sie jedoch Plasmid-DNA injizieren, wie wir es heute getan haben, müssen Sie die Elektroporation durchführen, um die Plasmide in die Zellen einzubringen, die das Ventrikelinnere auskleiden. So können Sie diese Vektoren für eine Vielzahl von Möglichkeiten nutzen.

Sie können sie verwenden, um die Zellen einfach zu verfolgen und GFP exprimieren zu lassen, und anschließend können Sie beobachten, wie diese Vorläuferzellen sich teilen und wandern. Sie können diese Vektoren auch nutzen, um die Zellen zu manipulieren. So können Sie S-H-R-N-A-Haarnadeln exprimieren und dadurch spezifische Gene herunterregulieren.

Sie können auch spezifische Gene überexprimieren und auf diese Weise die Zellen beeinflussen, die Sie elektroporiert oder mit dem Virus infiziert haben. Dies kann eine sehr leistungsfähige Technik sein, um die Rolle spezifischer Proteine in dem Prozess zu untersuchen, der Sie interessiert. Dies ist insbesondere für Studien an der Ratte besonders wichtig, da genetische Modifikationen bei der Ratte nicht so einfach durchführbar sind wie bei der Maus.