Name: In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E16 Rattenembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 4 s
Description: Erfahren Sie die intrauterine intraventrikuläre Injektion und Elektroporation bei E16-Rattenembryonen. Diese Methode ermöglicht genetische Manipulationen für Studien zur Entwicklungsneurobiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

in utero intraventrikuläre injektion und elektroporation von e16 rattenembryonen

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos

In-utero in-vivo-Injektion und Elektroporation von embryonalen Ratten Neocortex ist ein leistungsstarkes Tool für die Manipulation von einzelnen Vorfahren an den Wänden der Seitenventrikel. Diese Technik ist mittlerweile weit verbreitet, um die Prozesse in Kortikogenese durch Überexpression oder umzuwerfen Gene und beobachten die Auswirkungen auf die zelluläre Proliferation, Migration und Differenzierung beteiligt zu studieren. Im Vergleich zu traditionellen Ko-Strategien, bietet in-utero Elektroporation eine schnelle Mittel, um eine Population von Zellen in einem bestimmten Zeitfenster zu manipulieren. In diesem Video-Protokoll, skizzieren wir die experimentelle Methodik zur Vorbereitung Ratten für eine Operation, Freilegung der Uterushörner durch laporatomy, Injektion von DNA in die Seitenventrikel des sich entwickelnden Embryos, Elektroporation von DNA in den Vorläuferzellen entlang der Seitenwand und Pflege von Tieren nach Chirurgie. Unser Labor nutzt dieses Protokoll für Operationen auf E15-E21 Ratten, aber es ist am häufigsten bei E16 durchgeführt, wie in diesem Video gezeigt.

In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E16 Rattenembryonen

Die In-utero-In-vivo-Injektion und Elektroporation des embryonalen Neocortex der Ratte stellt ein leistungsfähiges Instrument zur Manipulation einzelner Progenitorzellen dar ...

Hallo, mein Name ist William Ti. Ich komme aus dem Arnold Creek Stein-Labor. Heute werden ich und andere Ihnen die intrauterine Injektion von E16-Rattenembryonen zeigen. Hallo, mein Name ist Laura Elias.Heute werde ich Ihnen zeigen, wie man die Mikroinjektionspipetten vorbereitet und belädt, um die intraventrikulären Injektionen und Elektroporationen durchzuführen, die wir heute vornehmen werden. Ich werde außerdem zeigen, wie man intraventrikuläre Injektionen und Elektroporationen an E16-Rattenembryonen durchführt. In-utero-Injektionen und Elektroporationen an der Ratte sind besonders nützlich, da die Ratte ein System darstellt, bei dem genetische Modifikationen nur schwer durchführbar sind.OK, es gibt eine Reihe chirurgischer Instrumente, die wir für diesen Eingriff verwenden. Wir benutzen einen Freer, ein paar Adson-Zangen, ein Paar mit Riffelung und ein weiteres Paar mit einem kleinen Zahn an der Spitze. Außerdem verwenden wir ein Paar Hämostatiken.Dies ist eine Schere, und dann verwenden wir diese beiden Hefter. Dies ist der größere, den wir für Ratten verwenden. Dies ist der kleinere, den wir für Mäuse verwenden, der einen sieben Millimeter großen Heftstapel verwendet, und dies wird mit einem neun Millimeter großen Heftstapel verwendet, und beide sind einfach federbelastet.Einige der Dinge, die wir hier zur Unterstützung der Operationen verwenden, sind eine einfache faseroptische Lichtquelle mit Doppelkopf. Wir verwenden eine beheizte Unterlage, die warmes, erwärmtes Wasser zirkulieren lässt, um die Temperatur aufrechtzuerhalten. Als Arbeitsfläche nutzen wir dieses System für die elektive Elektroporation, hergestellt von BTX.Wir verfügen über mehrere verschiedene Größen von Paddeln, die wir je nach Größe der Embryonen verwenden. Die blaue Seite ist die positive Seite. Gut, jetzt werden wir unsere Injektionspipetten abschrägen.Und das ist sehr wichtig, damit Ihre Pipette eine ausreichend große Öffnung aufweist, um Ihre DNA aufzunehmen, aber auch sehr, sehr scharf ist, sodass sie den Embryo beim Injizieren nicht beschädigt. Und wenn Sie den Embryo beim Injizieren beschädigen, wird die Sterblichkeitsrate deutlich höher sein. Und das ist nicht gut.Dies ist also tatsächlich ein sehr wichtiger Vorgang bei diesem chirurgischen Eingriff. Zunächst geben wir etwas Wasser auf diesen Schleifstein, der sich hier dreht. Danach nehmen wir, mal sehen, einfach einen Stab.Und wir werden unsere Pipette, die wir gerade gezogen haben, mit etwas Klebeband auf diesen Stab setzen. Wir werden einen dieser Mikromanipulatoren verwenden, um die Pipette an der Schräge zu halten und sie hier zu schleifen. Wir platzieren dies also einfach und verwenden ein Mikroskop, um die Pipettenspitze sichtbar zu machen.Und wir legen es einfach direkt ins Wasser auf die vorherige Schräge, sodass ein leichter Druck ausgeübt wird. Sie können sehen, wie die Spitze hier gegen den Stein drückt. Lassen Sie es dann für einige Zeit – mindestens etwa 15 Minuten – schräg schleifen.Ich lasse sie manchmal sogar eine Stunde lang so. Manchmal werden sie dadurch sehr, sehr scharf, aber wie lange die Pipetten abgeschliffen werden, hängt definitiv von Person zu Person ab. Gut, hier sehen Sie oben eine gezogene Pipette, die noch nicht abgeschliffen wurde.Es ist also scharf, weist jedoch keine Öffnung auf, durch die man die DNA laden könnte. Die untere Pipette hingegen wurde abgeschrägt, und Sie können diese schöne, schräge Öffnung sehen. Diese ermöglicht es nun, die DNA zu laden, behält aber weiterhin eine scharfe Spitze, sodass man injizieren kann, ohne Schäden zu verursachen. Gut, nun füllen wir unsere Injektionspipetten mit DNA.Es ist daher wichtig, dass Sie Ihre DNA endotoxinfrei aufbereiten, damit beim Injizieren der DNA keine Lipopolysaccharide injiziert werden. Wir nehmen nun unsere DNA und bereiten hier tatsächlich unser Paraform vor. Sie stellen also hier Ihr Paraform her und sammeln Ihre DNA, um sie als kleinen Tropfen auf diesem Param aufzutragen.Und dann nehmen wir – ich nehme üblicherweise pro 10 Mikroliter meiner DNA, die ich normalerweise in einer Konzentration von etwa 1,5 bis 1,7 Mikrogramm pro Mikroliter verwende – etwa ein Mikroliter dieses schnellen Cremefarbstoffs. Dies dient lediglich dazu, uns bei der Lokalisierung der Injektion zu helfen und sicherzustellen, dass wir erfolgreich in das Ventrikel injiziert haben.Dann mische ich einfach diesen Fast-Green-Farbstoff mit meiner DNA. Danach nehmen Sie Ihre Injektionselektrode und füllen die Pipette, indem Sie den Kolben zurückziehen. Und Sie können hier sehen, dass, wenn die Pipette korrekt ist und eine ausreichend große Öffnung aufweist, die DNA ziemlich leicht eingesaugt werden sollte.Manchmal müssen Sie den Kolben einfach mehrmals vor und zurück bewegen, um das korrekte Befüllen zu erleichtern. Auf diese Weise können Sie die Pipette dann wie folgt beladen. Die DNA ist nun vollständig in dieser Pipette geladen und bereit für die Injektion.Okay, ich werde das Tier nun anästhesieren. Wir verwenden diese Dec-Capi-Kappen. Ich rolle einfach den Rand ein wenig zurück, um sie besser halten zu können.Beginnen wir also. Ich lege es normalerweise einfach an den Rand der Käfigs, um einen kleinen Tunnel für ihn zu bilden, so wie hier. Okay, dieses Tier sieht aus, als wäre es unten.Wir führen nun eine Zehenquetschung durch, um dies zu überprüfen, und müssen dazu lediglich die Zehe greifen und kräftig zusammendrücken. Nicht zu fest. Man möchte das Tier nicht verletzen, sondern lediglich sicherstellen, dass es bewusstlos ist.Und dieses Tier ist eindeutig bewusstlos. Ich werde daher fortfahren und ihren Bauch rasieren. Ich möchte die Tet vermeiden, damit Sie die Enden nicht abschneiden.Ich denke, es könnte sehr schmerzhaft für das Tier sein. Daher wird das Tier rasiert. Jetzt werde ich es in den Abzug bringen.Wir werden sie säubern und mit dem Eingriff beginnen. Okay, wir haben bestätigt, dass dieses Tier erneut bewusstlos ist, und sind nun bereit, zunächst die Säuberung durchzuführen. Ich werde etwas Augensalbe auftragen, um zu verhindern, dass ihre Augen austrocknen – jeweils ein wenig auf jedes Auge.Danach führen wir abwechselnd Abreibungen mit Alkoholtupfern und Jodtupfern durch. Dies wiederholen wir dreimal, also insgesamt drei abwechselnde Abreibungen. Dabei müssen wir sehr vorsichtig sein, um die Embryonen während des Vorgangs nicht zu beschädigen.Sie sollten also einfach gerade nach unten wischen und dann direkt wieder zurück. Das ist Schritt eins. Ich muss sie zuerst gut befeuchten, damit ich die Abstriche durchführen kann. Gut.Das ist zwei und das ist drei. Okay, wir haben diese Abdeckung angebracht, um die Sterilität zu gewährleisten, und jetzt werde ich das Tier öffnen. Schneiden wir also.Als Erstes muss ich die Sterilisation vornehmen. Wir ziehen sterile Handschuhe an und können hier nun öffnen. Es ist immer wichtig zu bestätigen, dass das Tier noch ruhig liegt.Ich werde also einen weiteren Zehenquetschtest durchführen, und wir werden dies während des gesamten Eingriffs tun. Normalerweise quetsche ich zunächst leicht das Gewebe, führe schnell einen Schnitt durch, halte es oben fest und schneide nach unten, greife dann mit dem anderen Paar Pinzetten, um das Gewebe auseinanderzuhalten.Dann greifen Sie den Muskel, den Sie möchten, und schneiden entlang der Mittellinie, sodass keine Gefäße oder Nerven verletzt werden. Achten Sie darauf, nicht versehentlich das Sure zu erfassen. Es sieht also so aus, als hätten wir hier eine gute Ausbeute.Ich möchte sicherstellen, dass es gut geschmiert bleibt, damit es nicht austrocknet. Und ich werde noch einen weiteren Tropfen hinzufügen, nur um sicherzugehen, dass alles in Ordnung ist, und es sieht so aus, als wäre alles gut. Ich positioniere diese stets für Laura, und was ich normalerweise mache – beziehungsweise immer mache – ist, den Kopf so zu platzieren, dass der Embryokopf auf der rechten Seite der Mutterratte liegt, einfach der Einheitlichkeit halber.Und nun werde ich beginnen. Hier können wir den Embryo sehen. Wir erkennen den Schwanz und die hintere Linse hier sowie den Kopf weiter oben.Hier betrachten wir den Kopf dieses Embryos. Sie können die Mittellinie an dieser dunklen Linie erkennen. Sie sehen die linke und die rechte Hemisphäre sowie das Nachhirn.Jetzt werde ich die Injektion in der linken Hemisphäre vornehmen. Mit der Pipette injektieren, leicht zurückziehen und den Farbstoff injizieren. Wie Sie sehen, breitet er sich nun im linken Seitenventrikel aus.Und das sieht nach einer erfolgreichen Injektion aus. Gut, jetzt sehen wir, dass sich die Ventrikel gut gefüllt haben. Die Farbe ist tatsächlich vom linken zum rechten Ventrikel übergetreten.Wir haben also D und DNA in beiden Ventrikeln. An dieser Stelle nehme ich meine Elektroporations-Elektroden und platziere sie über das Gehirn, wobei die positive Elektrode auf der linken Seite liegt. Dadurch gelangt die DNA in die Vorläuferzellen und die kortikale Wand der linken Hemisphäre.Und nun leite ich den Strom durch. Wenn wir den elektrischen Strom einschalten, sehen Sie einen Schaum an der negativen Elektrodenstelle. Das ist beruhigend und zeigt Ihnen, dass Sie die richtigen Kontakte hergestellt haben.Okay, jetzt, da wir diese Embryonen elektroporiert haben, werde ich sie wieder einsetzen und zunähen. Ich werde ihr nun 10 ml antibiotische chirurgische Nahtlösung verabreichen. Ich bevorzuge Blockstiche.Danach werden wir die Haut mit dem Hauthefter verschließen. Okay? Gut. Ich habe ihr eine Dosis Buprenorphin verabreicht, um sicherzustellen, dass sie keine Schmerzen verspürt, wenn sie aus der Narkose aufwacht. Nun lege ich sie in den Inkubator, der sie während des Aufwachens warm hält, um sicherzustellen, dass keine Hypothermie auftritt.Okay, wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man intrauterine, intraventrikuläre Injektionen und Elektroporation durchführt. Bei der Ratte können Sie eine Reihe verschiedener Substanzen injizieren. Sie können beispielsweise direkt ein Virus, einschließlich Lentivirus oder Retrovirus, in das Ventrikelgefüge spritzen.Und in diesem Fall ist eine Elektroporation nicht erforderlich, da das Virus in die Zellen integriert wird. Wenn Sie jedoch Plasmid-DNA injizieren, wie wir es heute getan haben, müssen Sie die Elektroporation durchführen, um die Plasmide in die Zellen einzubringen, die das Ventrikelinnere auskleiden. So können Sie diese Vektoren für eine Vielzahl von Möglichkeiten nutzen.Sie können sie verwenden, um die Zellen einfach zu verfolgen und GFP exprimieren zu lassen, und anschließend können Sie beobachten, wie diese Vorläuferzellen sich teilen und wandern. Sie können diese Vektoren auch nutzen, um die Zellen zu manipulieren. So können Sie S-H-R-N-A-Haarnadeln exprimieren und dadurch spezifische Gene herunterregulieren.Sie können auch spezifische Gene überexprimieren und auf diese Weise die Zellen beeinflussen, die Sie elektroporiert oder mit dem Virus infiziert haben. Dies kann eine sehr leistungsfähige Technik sein, um die Rolle spezifischer Proteine in dem Prozess zu untersuchen, der Sie interessiert. Dies ist insbesondere für Studien an der Ratte besonders wichtig, da genetische Modifikationen bei der Ratte nicht so einfach durchführbar sind wie bei der Maus.

in-utero-intraventricular-injection-electroporation-e16-rat

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E15 muriner Embryonen

In utero Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von neuronalen Vorläuferzellen in vivo. Abhängig von der Platzierung der Elektroden und der Entwicklungspsychologie Zeitpunkt der Elektroporation können bestimmte Teilmengen von kortikalen Zellen ausgerichtet werden. Gezielte Zellen können dann in vivo oder in vitro für die Auswirkungen der genetischen Veränderung untersucht werden.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

Diese Studie beschreibt die Entwicklung...

In-vitro-Elektroporation von der Unteren Rhombischer Lip von der Schwangerschaft ab muriner Embryonen

Steuern der Expansion von somatischen Stammzellen ist ein Hauptfaktor, was ihrer Studie und therapeutischen Verwendung. Hier beschreiben wir ein System zur zeitlich steuern Nervenstammzellen Expansion während der Entwicklung und im Erwachsenenalter, die verwendet werden, um die Zahl der Neuronen im Gehirn der Maus erzeugt erhöhen kann.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Dieses Video zeigt die Abgabe von Plasmid-DNA in zerebelläre neuronale Zellen von Mausembryonen mittels in utero-Elektroporation. Diese Methode ist nützlich, um die in vivo Funktion von Genen bei der normalen Gehirnentwicklung und die Veränderungen in der Genexpression von Neuronenzellen während der Tumorprogression zu verstehen.

In utero Elektroporation basierte Genabgabe: Eine Technik zur Injektion von Plasmid-DNA in embryonale Kleinhirnzellen von Mausembryonen

Gene bei der Entwicklung des Kortex oder des Hippokampus von Ratten über in utero Elektroporation (IUE) an E16 manipuliert werden, um eine schnelle und gezielte Modifikationen der neuronalen Verbindungen für spätere Untersuchungen des Verhaltens oder der Neuropathologie in erwachsenen Tieren ermöglichen. Postnatale in-vivo-Bildgebung für die Kontrolle der IUE Erfolg durch Biolumineszenz der Aktivierung co-transfizierten Luciferase durchgeführt.

Erzeugung von Aktuell transgenen Ratten durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Biolumineszenz Screening

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie verschiedene Regionen im Zentralnervensystem C57BL/6 mittels in utero-Elektroporation spezifisch transfiziert werden. In diesem Protokoll sind detaillierte Anweisungen für Transfektionen von Regionen enthalten, die sich zum Kortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Nucleus lateralis septum lateralis und Striatum entwickeln.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

Periventrikulären noduläre Heterotopie (PNH) ist die häufigste Form der Fehlbildung der kortikalen Entwicklung (MCD) im Erwachsenenalter, aber seine genetische Basis bleibt bei den sporadischen Fällen unbekannt. Vor kurzem haben wir eine Strategie, um neue Kandidatengene für MCDs zu identifizieren und direkt ihre ursächliche Rolle in Vivobestätigen.

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.

Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren

Dieses Protokoll stellt einen optimierten Ansatz zur Herstellung genetisch veränderter Rattenmodelle dar. Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wird verwendet, um eine DNA-Reparaturvorlage zu liefern, und die Elektroporation wird verwendet, um CRISPR-Cas9-Reagenzien zu verabreichen, um den Genom-Editierungsprozess im 2-Zell-Embryo abzuschließen.

CRISPR-Cas9 Genom-Editierung von Rattenembryonen mit Hilfe des Adeno-assoziierten Virus (AAV) und der Elektroporation von 2-Zell-Embryonen

Erfahren Sie die intrauterine intraventrikuläre Injektion und Elektroporation bei E16-Rattenembryonen. Diese Methode ermöglicht genetische Manipulationen für Studien zur Entwicklungsneurobiologie.

In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E16 Rattenembryonen

Weitere Videos entdecken