Name: Rekapitulation eines Ionenkanals IV Curve mit Frequenzkomponenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Lernen Sie eine elektrophysiologische Methode zur simultanen Messung mehrerer Ionenkanalarten ohne pharmakologische Blocker. Diese Technik nutzt Frequenzkomponenten und FFT-Analyse für verbesserte physiologische Studien.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grant-Nummer R21-HL094828-01 geht an Dr. Poelzing unterstützt.

1. Bereiten Lärm Funktion und Eingangssignal <ol><li> Erstellen Sie eine Lärm-Funktion mit der gewünschten Frequenz-Komponenten. Dies kann durch die Beschreibung der gewünschten Frequenz-Komponenten im Frequenzbereich und dann die Berechnung der inversen schnellen Fourier-Transformation durchgeführt werden. In dieser Studie 1 bis 15 kHz verwendet. Alle Fourier-Transformationen und inverse Fourier-Transformationen in dieser Studie beschrieben wurden mit Matlab FFT und IFFT-Funktionen. </li><li> Skalieren Sie die Amplitude des Rauschens Funktion angemessen. In dieser Studie wurde der Lärm-Funktion wurde so skaliert, dass die Null zur Amplitude des Rauschens Funktion peak 50 oder 100 mV wurde. </li><li> Erstellen Sie ein Stimulus-Datei mit geeigneten Methoden für den Erwerb verwendeten Software. Für CLAMPEX 8, erstellen Sie zunächst eine Textdatei mit dem entsprechenden Header. Unterhalb der Kopfzeile, legen Sie die Zeit-Schritten für einen einzigen Durchlauf in der ersten Spalte. Die Zeit-Schritten sollen die gleichen zeitlichen Abstand wie das Abtastintervall in die Messungen verwendet. Für jeden Sweep in der Spannung Schritt-Protokoll legen Sie die genaue Spannungen zu jedem Zeitpunkt gewünscht. Dies sollte auch die Lärm-Funktion. </li></ol> 2. Führen Sie Voltage Clamp Messungen <ol><li> Erstellen Sie ein Messprotokoll innerhalb der Erfassungs-Software, die kompatibel mit der Reiz-Datei generiert zuvor ist. In CLAMPEX, gibt es ein Menü, dass der Benutzer auf einen Reiz-Datei mit dem aktuellen Protokoll zugeordnet werden können. </li><li> Bringen Sie ein Modell (oder biologische) Zelle, um die Messtechnik. </li><li> Führen Sie das Experiment wie geplant. Zur Kontrolle, stellen Sie sicher, regelmäßige Messungen, die keine keine Geräusche Funktionen erweitert. </li></ol> 3. Beitrag Experiment Analysis <ol><li> Berechnen Sie die IV-Kurve für eine einzelne Aufnahme. Wenn sich die Aufnahme in einem stabilen Zustand, wenn der Lärm-Funktion angewendet wird, kann die IV-Kurve erstellt mit Hilfe eines steady state Teil der Aufnahme zeitlich außerhalb des Bereichs der Lärm-Funktion. Wenn die Aufnahme war nicht in einem stabilen Zustand, der Lärm-Funktion kann mit der Berechnung der IV-Kurve stören, so dass eine zweite Aufnahme ohne den Lärm-Funktion vorhanden sein sollte vorgenommen werden. </li><li> Für jede Spannung Schritt in eine Aufnahme Berechnung der schnellen Fourier-Transformation des Anteils an der Aufnahme, wo der Lärm-Funktion eingefügt wurde. Kombinieren Sie die Fourier-Transformation für jede Spannung Schritt in mxn Matrix, wobei m die Anzahl der Frequenzen in der FFT und n ist die Anzahl der Spannung Schritte. In dieser Konfiguration stellt jeder Zeile der Matrix die Amplitude einer einzigen Frequenz auf allen Spannungsebenen Schritte in das Experiment. </li><li> Für jede Frequenz (dh jede Zeile in der obigen Matrix) korrelieren die Zeile mit der IV-Kurve in 3.1 generiert und Aufzeichnung der Korrelationskoeffizient. </li><li> Plot der Korrelationskoeffizient vs Frequenz auf Frequenzen, die stark mit dem IV-Kurve zu visualisieren. Da die DC-Komponente innerhalb der ersten Frequenz des FFT enthalten ist, sollte der Korrelationskoeffizient für diese Frequenz immer&gt; 0,99 sein. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Vertreter Voltage-Clamp-Messungen sind für ein Modell Zelle ohne (Abbildung 1A) und mit (Abbildung 1B) ein Geräusch Funktion in der Spannung Schritt-Protokoll eingefügt gezeigt. Die IV-Kurve wurde auch für das Modell Zelle (Abbildung 1C) berechnet. Für jeden Sweep, in dem Aufnahmen aus Abbildung 1 wurde die FFT über den zeitlichen Rahmen, wo der Lärm-Funktion eingesetzt wurde (siehe roter Kasten in den Figuren 1A, 1B) berechnet. 2A und 2B zeigen die FFTs für die Aufnahmen in Abbildung 1A und 1B gezeigt, jeweils berechnet. Bei visueller Betrachtung erscheint die DC-Komponente (rot markiert), um die Form der IV-Kurve zu imitieren. Ohne den Lärm-Funktion erscheinen alle Frequenzen oberhalb von DC bis Amplituden nahe Null (Abbildung 2A) haben. Wenn der Lärm-Funktion eingesetzt wird, haben Frequenzen zwischen 1 und 15 kHz optisch deutlichen Amplituden (Abbildung 2B). Abbildung 3 zeigt das Ergebnis der Korrelation von einzelnen Frequenz-Amplituden im Bereich von Spannung Schritte gegen die IV-Kurve. Abbildung 3A-C zeigt die Korrelationskoeffizienten, wenn das Experiment unter Kontrollbedingungen (kein Lärm-Funktion) und mit Rauschamplituden von 50 und 100 mV bzw. durchgeführt wurde. Beachten Sie in jedem Fall erscheint die DC-Komponente auf nahezu perfekt korrelieren mit der IV-Kurve. In der Tat, für alle Aufnahmen, betrug der Korrelationskoeffizient für diese Frequenz größer als 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, Mittelwert ± Standardabweichung). Als wir bei 3A (Kontrollbedingungen) aussehen, gibt es keine Frequenzen neben der DC-Komponente, deren Amplitude deutlich korreliert mit der IV-Kurve. Genauer gesagt, haben keine dieser Frequenzen Korrelationskoeffizienten größer als 0,5. Beim Einsetzen der niedrigsten Amplitudenrauschen Funktion (50 mV), die gleichen Frequenzen noch Korrelationskoeffizienten kleiner als 0,5. Die Korrelationskoeffizienten für diese Frequenzen auch nicht größer geworden als 0,5, wenn das Rauschen Amplitude auf 100 mV erhöht wurde. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> . Abbildung 1 Modell Zelle Recordings: Voltage Clamp Messungen sind für ein Modell Zelle ohne (1A) und mit (1B) ein Geräusch Funktion in der Spannung Schritt-Protokoll enthalten angezeigt. Für den ersten und letzten 20 ms von jedem Sweep, war das Potential an der Holding Potential (0 mV) gehalten. Jede Spannung Schritt war 80 ms lang, und der Lärm-Funktion lag bei 40 ms nach dem Beginn des Schrittes eingesetzt. Der Lärm Funktion hatte eine Laufzeit von 30 ms und enthielt Frequenzen zwischen 1 und 15 kHz. Spannung war fro, trat -150 bis +50 mV in 5 mV-Schritten. Ein IV-Kurve für das Modell Zelle wird auch gezeigt, (1C). Um die Aufnahmen leichter zu lesen, war nur jeder fünfte Sweep in 1A und 1B enthalten, aber alle Sweeps wurden in 1C enthalten. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 FFT der Aufnahmen:. Die FFT wurde für die 30 ms Teil jedes fegen, wo der Lärm-Funktion eingefügt (das Gebiet durch die rote Box in den Figuren 1A, 1B begrenzt) berechnet werden. 2A und 2B zeigen die FFTs ohne und mit dem Lärm-Funktion berechnet, jeweils. Wieder einmal ist der Übersichtlichkeit halber nur die FFT von jedem fünften Sweep in der Zahl nicht enthalten, aber alle Sweeps wurden in die künftige Berechnung verwendet. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> . Abbildung 3 IV Frequency Korrelationen: Die Ergebnisse der Korrelationen zwischen den IV-Kurve einer Aufnahme und die Amplitude der einzelnen Frequenzen im Bereich von Spannung Schritte gezeigt. 1A - 1C zeigen die Korrelationskoeffizienten für Frequenzen von 0 bis 20 kHz unter Kontrollbedingungen und in Gegenwart von 50 oder 100 mV Lärm Funktionen bzw.. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4 Re-Creation der IV-Kurve:. Die IV-Kurve für das Modell Zelle (wie Abbildung 1C) und die Größe der beiden Frequenzen wurden überlagert. Die erste Frequenz war die DC-Komponente (R = 0,995) und der zweite war ein zufällig ausgewähltes Frequenz mit geringer Korrelation (R = 0,3212). Die Frequenz Amplituden wurden auf etwa die gleiche Amplitude wie die IV-Kurve skaliert.

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</ol>

Es gibt technische Hindernisse, die derzeit verhindern, Forscher aus der Messung mehrerer Ionenkanal-Typen gleichzeitig mit der Absicht, später zu bestimmen, wie viel Strom sollte für jeden Kanal-Typ zugeordnet werden. Aufgrund dieser Einschränkung sind Ionenkanäle in der Regel individuell mit Hilfe von Techniken wie Spannung, Strom, und Aktionspotential Klammer untersucht. 1 Um individuelle Kanaltypen, heterologe Expressionssysteme werden oft verwendet, zu studieren. 2 Bei der Arbeit mit Zellen aus dem Gewebe isoliert, wie Kardiomyozyten , müssen andere Mittel verwendet, um verschiedene Ionenkanäle blockieren. Zum Beispiel Natrium-Kanäle durch eine langsame depolarisierende Spannungsrampe inaktiviert werden kann, können 3 nach innen Behebung Kalium-Kanäle mit extrazellulären BaCl2 blockiert werden, 4 und Calcium-Kanäle blockiert mit Verapamil werden. 5 Eine Methode verwendet, die teilweise überwindet diese Einschränkung ist es, aktuelle Fluss durch zwei Kanäle Typen gleichzeitig messen Sie dann die Messung zu wiederholen, nachdem eine selektive Blockade eines Kanals Typ mit einem geeigneten Agenten. Subtraktion der beiden Messungen kann dann verwendet werden, um die Menge des Stroms auf die Kanal-Typ, der blockiert wurde, zu schätzen. 6 Es gibt jedoch zwei wesentliche Einschränkungen dieser Technik. Zunächst chemischen Mitteln nicht identifiziert worden, die selektiv blockieren Ionenkanal, und einige weit verbreitete Drogen haben unspezifische Wechselwirkungen mit anderen Kanal-Typen. 5,7 Zweitens kann es nicht von dieser Technik festgestellt werden, ob ein Kanal moduliert durch eine andere Kanal. Zum Beispiel hat heterogene Expression von NAV 1.5 und 2.1 in Kir Meerschweinchen Ventrikel gezeigt worden, und es wurde vorgeschlagen, dass eine synergistische Beziehung zwischen den beiden Kanälen besteht, so dass höhere Kir 2,1 Ausdruck in der rechten Herzkammer Leitgeschwindigkeit drückt. 8 Derzeit Dies kann nicht verifiziert werden. In dieser Studie empfehlen wir, dass Impedanzspektroskopie kann ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung mehrerer Ionenkanal-Typen gleichzeitig gemessen werden. Obwohl das vorgestellte Verfahren noch nie benutzt worden, um Ströme von Zwei-Kanal-Typen gleichzeitig gemessen zu erkennen, hat Impedanzspektroskopie verwendet worden, um eine Reihe von anderen Aspekten der Ionenkanal-Funktion zu untersuchen. Goodman und Kunst zeigte mit Schildkröte auditive Haarzellen, die Stromzange Protokolle geändert werden, um eine Zelle auf verschiedene Frequenzen einstellen werden können, und die Schwingungen in der Transmembran-Potential ist durch ein Wechselspiel zwischen einer inneren Gleichrichtung K +-Kanal und einen Ca 2 +-Kanal. 9 Han und Frazier gezeigt, dass Impedanz kann in einer einzelnen Zelle über einen weiten Bereich von Frequenzen (100 Hz bis 5 MHz) gemessen werden, und der Anstieg der Impedanz beobachtet werden, wenn K + oder Ca 2 +-Kanäle blockiert waren ein einfaches Mittel sein könnte, um erkennen Kanalblock in hohem Durchsatz Drogen-Bildschirme. 10 Hayashi und Fishman haben komplexe Leitwert zur kinetischen Eigenschaften einer inneren Gleichrichtung K + Kanal. 11 Andere Gruppen haben eine einzige Frequenz in den Voltage-Clamp-Protokoll verschiedener Kanäle eingesetzt und zeigte, dass die beobachtet Frequenzgang stimmte mit der erwarteten Antwort für einige Frequenzen, andere aber nicht. 12,13 Millonas und Hanck schlug der Grund, warum einige Frequenzen nicht vorgelegt habe die erwartete Antwort ist die Anwesenheit von mehreren Geschwindigkeitskonstanten in der Markov-Modell. 12 Studien wie diese, sowie andere, haben gezeigt, dass es Fälle, in denen Ionenströme von Ionenkanälen gemessen, während mit Impedanzspektroskopie nicht mit den theoretischen Frequenzgang zustimmen. Dies ist kein Problem in dieser Studie, weil der Zweck des Verfahrens in dieser Studie ist die Frequenzen, die mit der aktuellen Amplitude unabhängig von der zugrunde liegenden Annahmen der Membran Stromkreis korrelieren zu identifizieren. Furtheremore, ist die Stromamplitude von Teilen der Aufnahmen, die haben noch keine Lärm-Funktionen in sie eingefügt berechnet. Eine Reihe von anderen Studien ebenfalls anwesend Modelle zahlreicher Ionenkanäle ausstellenden zahlreichen leitenden und nicht-Leitungszuständen alle mit ihren eigenen Geschwindigkeitskonstanten. 14,15,16 Thompson et al zeigten, dass die Selektivität des Filters KcsA Kanal verschiedene Bindungsstellen für Na hat +, Li + und K +, und die energetischen Kosten des Übergangs von einer Bindungsstelle zu einem anderen als Ion bewegt sich durch die Selektivitätsfilter macht der Kanal bevorzugt Verhalten K +-Ionen durch ihre Poren. 17 In diesem Papier haben wir eingefügt eine Reihe von Frequenzen (Lärm-Funktion) in eine Spannung Schritt-Protokoll und sah für Frequenzen, deren Amplitude sehr zufrieden mit dem gesamten Stromamplitude korrelieren. Da starke Beweise vorgelegt hat darauf hindeutet, mehrere Geschwindigkeitskonstanten spielen eine Rolle bei Ionenleitung durch different-Kanäle, die Einführung der Frequenzen mit diesen Geschwindigkeitskonstanten verbundene kann bestimmte Frequenzen zu schwingen oder stark mit der Stromamplitude, die nicht über die sonst zu korrelieren. Die Technik in dieser Studie gezeigt, basiert auf einem Modell-Zelle, die eine parallele RC-Schaltung, die normalerweise verwendet wird, um die Voltage-Clamp-Schaltung und den Erwerb Ausrüstung durchgeführt wird. Es wird nicht erwartet, dass alle Frequenzen außer DC würde mit der aktuellen Größenordnung korrelieren, und das ist in unserer Datenbank angezeigt. Wir zeigen auch, dass neben der Lärm-Funktion nicht die Ursache für alle Frequenzen zu stark mit der Stromamplitude zu korrelieren. Diese beiden Ergebnisse sind kritisch, weil sie zeigen, dass die Messgeräte und Lärm-Funktion nicht selbst verursacht keine Frequenzen mit der Stromamplitude zu korrelieren. Wenn zukünftige Studien-Messungen mit Membranen, die Ionenkanäle zu machen, ist zu erwarten, dass, abhängig von der verwendeten Kanal, Frequenzen, die Geschwindigkeitskonstanten im Selektivitätsfilter oder eventuell die Poren entsprechen, werden der Frequenzgang des Kanals beeinflussen und Auswirkungen auf die Frequenzen hoch gewesen oder geringe Korrelation mit der Stromamplitude. Da diese Methode ist eine neue Technik zur Untersuchung von Ionenkanälen, gibt es eine Reihe von Richtungen zukünftigen Studien könnten folgen. Erstens sollte die Technik verwendet, um den Frequenzgang der spezifischen isolierte Kanäle zu charakterisieren. Zusätzliche Arbeit muss auch getan werden, um die Frequenz Amplituden der Stromamplituden zu kalibrieren. Sobald mehrere Kanäle einzeln gekennzeichnet sind, sollten mehrere Kanal-Typen gleichzeitig gemessen werden. Die Technik könnte auch für den Einsatz in Aktionspotential Klemme, Stromzange und Feld Stimulation Studien angepasst werden. Zwar ist dies eine neue Technik, zeigt es, was kann eine leistungsfähige Methode zur elektrophysiologischen Messungen, die bisher nicht möglich zu gestalten und liefern wertvolle neue Erkenntnisse über die physiologische Rolle von Ionenkanälen werden.

<table><tbody><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>n/v</td><td>Natick, MA</td></tr><tr><td>Clampex 8</td><td>Molekulare Geräte</td><td>Clampex 8</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Integrierender Patch-Clamp-Verstärker</td><td>Molekulare Geräte</td><td>Axopatch 200</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Kopfverstärker</td><td>Molekulare Geräte</td><td>CV202</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>16-Bit-Datenerfassungssystem</td><td>Molekulare Geräte</td><td>Digidata 1322A</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Modellzelle</td><td>Molekulare Geräte</td><td>Patch-1-Modellzelle</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr></tbody></table>

rekapitulation eines ionenkanals iv curve mit frequenzkomponenten

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

EINFÜHRUNG: Derzeit gibt es keine etablierten Methoden, um mehrere Ionenkanal-Typen gleichzeitig zu messen und zersetzen sich der gemessene Strom in Portionen, die den einzelnen Kanal-Typ. Diese Studie zeigt, wie Impedanzspektroskopie verwendet werden, um spezifische Frequenzen, die stark mit der stationären Stromamplitude während Voltage-Clamp-Experimenten gemessen zu identifizieren. Das Verfahren beinhaltet das Einfügen eines Lärm-Funktion, die bestimmte Frequenzen in der Spannung Schritt-Protokoll. In der vorliegenden Arbeit wird ein Modell Zelle verwendet werden, um nachzuweisen, dass keine hohen Korrelationen der Voltage-Clamp-Schaltung eingeführt werden, und auch, dass der Lärm Funktion selbst führt keine hohen Korrelationen, wenn keine Ionenkanäle vorhanden sind. Diese Überprüfung ist notwendig, bevor die Technik, um Zubereitungen, die Ionenkanäle angewendet werden können. Der Zweck des Protokolls vorgelegt wird, um zu demonstrieren, wie man den Frequenzgang eines einzelnen Ionenkanal-Typ in einen Rausch zu charakterisieren. Sobald bestimmte Frequenzen in einem einzelnen Kanal-Typ identifiziert worden sind, können sie verwendet werden, um die stationäre Strom-Spannungs-(IV)-Kurve zu reproduzieren. Frequenzen, die stark mit einem Kanal-Typ und minimal korrelieren mit anderen Kanal-Typen können dann verwendet werden, um die aktuelle Beitrag von Mehrkanal-Typen gleichzeitig gemessen zu schätzen. Methodik: Voltage Clamp-Messungen wurden an einem Modell-Zelle mit einem Standard-Spannung Schritt-Protokoll (-150 bis +50 mV, 5mV Schritten) durchgeführt. Lärm-Funktionen, die gleiche Größenordnung von 1-15 kHz Frequenzen (null bis Spitzenamplituden: 50 oder 100 mV) wurden in jede Spannung Schritt eingefügt. Der Realteil der Fast Fourier Transformation (FFT) des Ausgangssignals wurde mit und ohne Lärm für jeden Schritt Potential berechnet. Die Größe der einzelnen Frequenz als Funktion der Spannung Schritt wurde mit der Stromamplitude bei den entsprechenden Spannungen korreliert. Ergebnisse und Schlussfolgerungen: In der Abwesenheit von Lärm (Kontrolle), Größen aller Frequenzen mit Ausnahme der DC-Komponente korreliert schlecht (| R | &lt;0,5) mit der IV-Kurve, während die DC-Komponente war ein Korrelationskoeffizient größer als 0,999 in allen Maßen. Die Qualität der Korrelation zwischen einzelnen Frequenzen und die IV-Kurve nicht ändern, wenn ein Geräusch Funktion, um die Spannung Schritt-Protokoll aufgenommen wurde. Ebenso die Erhöhung der Amplitude des Rauschens Funktion auch nicht zu einer Erhöhung der Korrelation. Kontrollmessungen zeigen, dass die Voltage-Clamp-Schaltung an sich verursacht keine Frequenzen oberhalb von 0 Hz bis sehr zufrieden mit dem Steady-State-IV-Kurve korrelieren. Ebenso zeigen Messungen in Anwesenheit des Lärm-Funktion, die den Lärm-Funktion verursacht keine Frequenzen oberhalb von 0 Hz bis die steady-state IV-Kurve korrelieren, wenn keine Ionenkanäle vorhanden sind. Auf der Grundlage dieser Überprüfung kann die Methode nun Zubereitungen, die ein einzelner Ionenkanal-Typ mit der Absicht, die Identifizierung Frequenzen, deren Amplituden korrelieren speziell mit diesem Kanal Typ angewendet werden.

Es gibt technische Hindernisse für die Messung der Stromfluss durch mehrere Ionen-Kanäle gleichzeitig und später erkennen, was Teil der transmembrane Strom wird durch jeden Kanal-Typ. Um diesen Bedarf, stellt diese Methode eine Möglichkeit, die IV-Kurve der einzelnen Kanal-Typen mit spezifischen Frequenz-Komponenten zu erzeugen.

Rekapitulation eines Ionenkanals IV Curve mit Frequenzkomponenten

EINLEITUNG: Derzeit gibt es keine etablierten Methoden, um mehrere Ionenkanaltypen gleichzeitig zu messen und den gemessenen Strom in ... zu zerlegen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Technik zur Charakterisierung der Frequenzantwort von Ionenkanälen zu demonstrieren, um den Stromfluss durch mehrere Kanaltypen gleichzeitig zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Rauschfunktion erzeugt wird, die in das Spannungsschritt-Protokoll eingebettet und in eine Stimulationsdatei integriert wird. Dies ist erforderlich, um benutzerdefinierte Wellenformen mit der Clamp-X-Software nutzen zu können. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das soeben erstellte Spannungsschritt-Protokoll mithilfe standardmäßiger Ganzzell-Spannungsklemm-Techniken auf eine Modellzelle anzuwenden und den resultierenden Strom aufzuzeichnen. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Strom-Spannungs-Kennlinie (IV-Kurve) der Zelle sowie die FFT desjenigen Teils jedes Sweep, der die Rauschfunktion enthält, zu berechnen.Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Amplitude jeder Frequenz bei allen Spannungsschritten einzeln mit der Strom-Spannungs-Kurve dieser Zelle zu korrelieren. Die Ergebnisse zeigen, dass keine der Frequenzen stark mit der Strom-Spannungs-Kurve der Modellzelle korreliert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem standardmäßigen Ganzzell-Spannungs-Clamp ist, dass sie eine Möglichkeit bieten könnte, mehr als einen Ionenkanaltyp gleichzeitig zu messen, ohne pharmakologische Blocker oder Spannungs-Inaktivierungsprotokolle verwenden zu müssen.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen auf dem Gebiet der Ionenkanalphysiologie beantworten, beispielsweise welchen Einfluss die Expressionshöhe eines bestimmten Ionenkanaltyps auf die Aktivität anderer Ionenkanaltypen im selben Gewebe hat. Der erste Schritt des Protokolls besteht darin, eine Rauschfunktion zu erzeugen, die die gewünschten Frequenzkomponenten enthält. Beschreiben Sie hierzu zunächst die gewünschten Frequenzkomponenten im Frequenzbereich.In dieser Studie werden Frequenzkomponenten zwischen einem und 15 Kilohertz verwendet. Berechnen Sie anschließend die inverse schnelle Fourier-Transformation mithilfe der IFFT-Funktion von MATLAB, um die ausgewählten Frequenzen in den Zeitbereich zu transformieren, und skalieren Sie danach die Amplitude der Rauschfunktion entsprechend.In dieser Studie wird die Rauschfunktion zweimal skaliert, einmal, sodass die Amplitude von null bis zur Spitze 50 Millivolt beträgt, und ein zweites Mal, sodass die Amplitude von null bis zur Spitze 100 Millivolt beträgt. Der nächste Schritt besteht darin, mithilfe eines Programms wie Matlab eine Stimulus-Datei zu erstellen. Eine Stimulus-Datei ist lediglich eine Textdatei mit einem Header, der der Clamp-X-eight-Aufnahmesoftware genau vorgibt, welche Spannung zu jedem Zeitpunkt verwendet werden soll.Um die Stimulusdatei zu erstellen, erstellen Sie zunächst eine Textdatei mit der entsprechenden Kopfzeile. Unterhalb der Kopfzeile tragen Sie in der ersten Spalte die Zeitinkremente für einen einzelnen Sweep ein; die Zeitinkremente sollten denselben zeitlichen Abstand wie das bei den Messungen verwendete Abtastintervall aufweisen. Dieses Protokoll verwendet eine Abtastrate von 200 Kilohertz. Tragen Sie für jeden Sweep die gewünschten exakten Spannungen für jeden Zeitschritt ein.Jede Spalte wird als separater Sweep betrachtet, daher sollten für ein Protokoll, das in Fünf-Millivolt-Schritten von minus 150 Millivolt bis plus 50 Millivolt ansteigt, 41 Spalten nach der Zeitspalte hinzugefügt werden. Die angegebenen Spannungen müssen die Rauschfunktion in Clamp X enthalten. Für jedes Experiment muss ein eigenes Protokoll erstellt werden; der nächste Schritt besteht daher darin, ein Messprotokoll zu erstellen, das mit einer zuvor generierten Stimulationsdatei kompatibel ist. Wählen Sie in Clamp X die Menüoption „Acquirer Edit Protocol Wave Zero“, die es ermöglicht, eine Stimulationsdatei mit dem aktuellen Protokoll zu verknüpfen.Der nächste Schritt besteht darin, den definierten Reiz auf die Zelle anzuwenden. Dieses Protokoll verwendet eine Modellzelle mit einem parallelen RC-Kreis. Schließen Sie die Modellzelle an die Messausrüstung an, klicken Sie auf die Aufnahmetaste und klemmen Sie X, um die Durchführung durchzuführen.Das Experiment ist zu Kontrollzwecken vorgesehen. Stellen Sie sicher, dass periodische Messungen durchgeführt werden, die keine Rauschfunktionen enthalten. Nach der Datensammlung besteht der nächste Schritt darin, die Strom-Spannungs-Kurven (IV-Kurven) zu erzeugen und die schnellen Fourier-Transformationen durchzuführen. Um die IV-Kurve einer einzelnen Aufnahme zu berechnen, verwenden Sie einen zeitlich außerhalb des Bereichs der Rauschfunktion liegenden Abschnitt im stationären Zustand der Aufnahme, um die Stromamplitude zu messen.Wenn die Aufnahme nicht im stationären Zustand ist, während die Rauschfunktion angewendet wird, kann die Rauschfunktion die Berechnung der Strom-Spannungs-Kurve (IV-Kurve) stören; in diesem Fall sollte die Kontrollaufnahme verwendet werden. Um stattdessen die IV-Kurve für jeden Spannungsschritt in einer Aufnahme zu berechnen, berechnen Sie die FFT desjenigen Teils der Aufnahme, in den die Rauschfunktion eingefügt wurde. Kombinieren Sie die Fourier-Transformation für jeden Spannungsschritt zu einer M × N-Matrix, wobei M die Anzahl der Frequenzen in der FFT und N die Anzahl der Spannungsschritte in dieser Konfiguration ist.Jede Zeile der Matrix stellt die FFT-Amplitude einer einzelnen Frequenz bei allen Spannungsschritten des Experiments dar. Als nächster Schritt wird der Korrelationskoeffizient für jede Frequenz berechnet, indem die Zeile mit der zuvor erstellten IV-Kurve korreliert wird. Notieren Sie den Korrelationskoeffizienten.Erstellen Sie anschließend ein Diagramm des Korrelationskoeffizienten in Abhängigkeit von der Frequenz, um Frequenzen zu visualisieren, die stark mit der IV-Kurve korrelieren. Die Ergebnisse der Spannungs-Klammer-Messungen ohne eingefügte Rauschfunktion sind hier dargestellt. Für die ersten und letzten 20 Millisekunden jedes Sweeps wurde das Potential am Haltepotential von null Millivolt gehalten.Dazwischen wurde die Spannung in Fünf-Millivolt-Schritten von minus 150 Millivolt auf plus 50 Millivolt erhöht. Jeder Spannungsschritt dauerte 80 Millisekunden, um die Abbildung besser lesbar zu machen; lediglich jeder fünfte Sweep ist in der Abbildung enthalten. Der rote Rahmen zeigt an, wann die Rauschfunktion angewendet worden wäre, falls in diesen Sweeps eine Rauschfunktion vorhanden gewesen wäre.Diese Abbildung ähnelt der vorherigen, jedoch wurde die Rauschfunktion 40 Millisekunden nach Beginn des Spannungsschritts in das Spannungsschrittprotokoll eingefügt; der rote Kasten zeigt die Stelle, an der die Rauschfunktion eingefügt wurde. Die Rauschfunktion hatte eine Dauer von 30 Millisekunden und enthielt Frequenzen zwischen ein und 15 Kilohertz. Diese Abbildung zeigt die IV-Kurve, die für die Modellzelle berechnet wurde.Diese IV-Kurve ist linear, was erwartet wird, da die Modellzelle eine einfache parallele RC-Schaltung darstellt. Diese Abbildung zeigt das FFT-Ergebnis ohne die Rauschfunktion für jeden Sweep. Bei den Aufnahmen der Modellzelle wurde die FFT über den Zeitraum berechnet, in dem die Rauschfunktion eingefügt wurde.Die Gleichstromkomponente, die rot hervorgehoben ist, scheint die Form der IV-Kurve nachzuahmen. Alle Frequenzen oberhalb von DC scheinen Amplituden nahe null zu haben; der Übersichtlichkeit halber ist nur die FFT aus jedem fünften Sweep in der Abbildung enthalten. Wenn die FFT für die Aufnahmen mit der eingefügten Rauschfunktion berechnet wird, weisen die Frequenzen zwischen einem und 15 Kilohertz bemerkbare Amplituden auf. Das Vorhandensein dieser höheren Frequenzen, die normalerweise in Spannungs-Clamp-Experimenten nicht auftreten, wirft die Frage auf, ob die Größe einer dieser Frequenzen proportional zur Stromamplitude verändert wird.Die nächsten drei Abbildungen zeigen den Korrelationskoeffizienten zwischen der Amplitude der einzelnen Frequenz und der IV-Kurve der Aufnahme. In der ersten Abbildung wird keine Rauschfunktion verwendet. In der zweiten Abbildung hatte die Rauschfunktion eine Spitzenamplitude von 50 Millivolt und in der dritten Abbildung eine Spitzenamplitude von 100 Millivolt.Beachten Sie, dass in allen Fällen die Gleichstromkomponente, mit anderen Worten die Antwort bei Null Hertz, einen Korrelationskoeffizienten von mehr als 0,99 aufweist und daher nahezu perfekt mit der Strom-Spannungs-Kennlinie korreliert. Beachten Sie außerdem, dass in allen drei Abbildungen keine der anderen Frequenzen Korrelationskoeffizienten größer als 0,5 aufweisen. Zusätzlich hat der Einbau der Rauschfunktion mit einer Amplitude von entweder 50 oder 100 Millivolt dieses Muster nicht verändert.Diese Ergebnisse zeigen, dass die Spannungs-Klemm-Elektronik und die Rauschfunktion selbst keine hohen Korrelationen in die I-V-Kurve einführen. Diese Validierung ist wichtig, um diese Technik auf Präparationen mit Ionenkanälen anwenden zu können. Diese Abbildung stellt die I-V-Kurve erneut dar, um die Korrelation beziehungsweise deren Fehlen in zwei Datensätzen von Frequenzdaten zu veranschaulichen.Die IV-Kurve für die Modellzelle, die in dieser Abbildung als tatsächliche IV gekennzeichnet ist, ist die gepunktete Linie, die auf der roten gestrichelten Linie zu liegen scheint. Die rote gestrichelte Linie zeigt die Gleichstromkomponente, die einen Korrelationskoeffizienten von 0,995 zur tatsächlichen IV-Linie aufweist. Die dritte dargestellte Kurve, die Linie mit den Zacken, zeigt eine zufällig gewählte Frequenz von 4,399 Kilohertz mit geringer Korrelation.Der Korrelationskoeffizient dieser Linie zur IV-Kurve beträgt 0,3212. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Messausrüstung und die Rauschfunktion allein keine Frequenzen verursachen, die mit der Stromamplitude korrelieren. Basierend auf dieser Überprüfung kann die hier vorgestellte Methode, bei der eine Rauschfunktion in Spannungsschritte während Spannungsclampe-Experimenten eingefügt wird, zunächst auf Membranpräparationen mit einem einzelnen Ionenkanaltyp und anschließend auf Präparationen mit mehreren Kanaltypen angewendet werden. Die Ergebnisse aus den Experimenten mit einzelnen Ionenkanälen können mithilfe der hier vorgeschlagenen FFT- und Korrelationsanalyse ausgewertet werden.Diese Analyse kann verwendet werden, um Frequenzen zu identifizieren, deren Amplituden spezifisch mit diesem bestimmten Kanaltyp korrelieren. Es wurden starke Hinweise vorgelegt, die darauf hindeuten, dass mehrere Geschwindigkeitskonstanten eine Rolle bei der Ionenleitung durch verschiedene Kanäle spielen. Sobald daher Frequenzen identifiziert wurden, korrelieren sie stark mit einem bestimmten Kanaltyp und nur minimal mit anderen Kanaltypen.Diese Frequenzen können anschließend verwendet werden, um den aktuellen Beitrag mehrerer Kanaltypen simultan anhand dieses Verfahrens abzuschätzen. Andere Methoden wie pharmakologische Blockaden und Präimpulse können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie die Frequenzantwort von Kanälen ist, wenn ein Ionenkanal in einer blockierten oder inaktiven Konformation vorliegt.

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