Rapid PCR Thermocycling mit Microscale thermische Konvektion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie das Prinzip der PCR-Thermocycling mittels thermischer Konvektion angewendet werden kann, um eine tatsächliche Reaktion durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Konzept der natürlichen Konvektions-Thermocycling sowie die grundlegenden Konstruktionsprinzipien erläutert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens zeigt, wie die Reaktorkartusche vorbereitet und mit den Reagenzien befüllt wird.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Reaktorkassette in die Heizeinheit einzubauen und die Reaktion durchzuführen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Entfernen der Reagenzien nach der Reaktion und die Überprüfung der Ergebnisse mittels Gelelektrophorese. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine schnelle DNA-Replikation durch natürliche Konvektions-PCR-Thermocycling zeigen.

Hallo, ich bin Radha OU aus dem UGAs-Labor der Texas A&M University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung einer schnellen PCR-Thermocyclisierung unter Verwendung natürlicher Konvektion, wie bei einer Lava-Lampe. Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um die Konstruktion und Optimierung von Thermocyclisierungsgeräten zu untersuchen, die auf diesem Prinzip basieren.

Beginnen wir also. Dieses Protokoll startet mit der Konstruktion und dem Aufbau eines einfachen konvektiven Thermocyclers. Die Vorrichtung, die für diese Demonstration verwendet wird, besteht aus austauschbaren Kunststoff-Reaktionskammer-Kassetten, die zwischen zwei Aluminiumplatten eingeschoben werden, deren Temperaturen unabhängig voneinander gesteuert werden.

Zylindrische Reaktorwannen wurden durch Fräsen von Lochrastern in Polycarbonatblöcken mit unterschiedlichen Kombinationen aus Lochdurchmesser und Kunststoffscheibendicke realisiert, um die gewünschten Aspektverhältnisse zu erreichen. Die optimale Konstruktion erfordert die Auswahl der geeigneten Reaktorgeometrie, die eine zirkulatorische Strömung erzeugt, welche Reagenzien durch die für den PCR-Prozess entscheidenden Temperaturen transportieren kann. Die geometrischen Parameter, die bei den hier betrachteten zylindrischen Reaktoren variiert werden können, sind die Höhe und der Durchmesser beziehungsweise das Aspektverhältnis.

Die untere Oberfläche des Reaktors wird mithilfe eines Aluminiumblocks erhitzt, der Heizpatronen enthält und mit einem mikroprozessorgesteuerten Temperaturregler verbunden ist. Die Temperatur an der oberen Oberfläche des Reaktors wird über einen mit einem umwälzenden Wasserbad verbundenen Aluminiumblock geregelt. Die gesamte Baugruppe wird mit Nylon-Schrauben zusammengeklemmt, um die Wärmeleitung zwischen den gegenüberliegenden Aluminiumblöcken zu begrenzen.

Bereiten Sie jede 100 µL-Freisetzung der PCR-Reaktion vor, indem Sie 10× Pufferlösung, 25 mmol/l Magnesiumchlorid, zwei DTPs destilliertes Wasser, die Beta-Aktin-Sonde, Vorwärtsprimer und Rückwärtsprimer, humanen genomischen DNA-Vorlage und KOD-DNA-Polymerase mischen. Vor dem Einfüllen der Reagenzien versiegeln Sie die untere Oberfläche der PCR-Kammer mit einem dünnen Aluminiumfolienstreifen, spülen die Reaktionsgefäße mit einer wässrigen Lösung von 10 mg/ml Rinderserumalbumin und anschließend mit Rain X Anti-Fog. Geben Sie schließlich die Reagenzien mit Gel-Ladepipettenspitzen in die Reaktionsgefäße und verschließen Sie die obere Oberfläche mit FEP-Teflon-Band.

Bevor die Reaktion beginnt, beide Aluminiumblöcke auf die gewünschten oberen und unteren Oberflächentemperaturen vorheizen. Den mit PCR-Reagenzien beladenen Kunststoffreaktor zwischen die Aluminiumheizblöcke legen und die Einheit mithilfe von Nylon-Schrauben schnell zusammenspannen. Nachdem die Reaktion für die gewünschte Zeit abgelaufen ist, die Heizungen ausschalten und die untere beheizte Oberfläche des Geräts auf einen gekühlten Metallblock legen, um sie rasch abzukühlen und die konvektive Strömung zu stoppen.

Entfernen Sie den Kunststoffreaktor und pipettieren Sie die Produkte aus den Vertiefungen für die anschließende Analyse. Bereiten Sie ein 2 %iges Agarosegel vor, indem Sie 10 Gramm Agarose mit 500 Millilitern eines Pufferlösungsansatzes (1×) auf einem gerührten Heizplättchen erhitzen, bis die Lösung klar wird. Gießen Sie das Agarosegel in die Gussform und setzen Sie den Kamm ein.

Lassen Sie das Gel etwa 30 Minuten lang erstarren. Entfernen Sie den Kamm und geben Sie 1× TAE-Puffer hinzu, bis das Gel bedeckt ist. Bereiten Sie fluoreszenzmarkierte DNA-Proben mit zwei Mikrolitern 100× Cyber Green vor.

Eine Lösung aus zwei Mikrolitern DNA-Probe, zwei Mikrolitern sechsfarbigen orangefarbenen Lade-Farbstoff und vier Mikrolitern TAE-Puffer. Geben Sie einen 100-Basenpaar-DNA-Längenmarker (DNA-Ladder) und die DNA-Proben in die Vertiefungen des Gels. Trennen Sie die DNA durch Elektrophorese bei 60 Volt für eine Stunde.

Entfernen Sie das Gel und fotografieren Sie es unter UV-Licht, um das Ergebnis zu erhalten. 3D-Strömungsfelder innerhalb konvektiver PCR-Reaktoren wurden über einen Bereich unterschiedlicher Seitenverhältnisse hinweg mithilfe der numerischen Strömungsmechanik (Computational Fluid Dynamics, CFD) untersucht. Diese Daten zeigten, dass komplexe Muster entstehen können und dass eine Teilmenge dieser komplexen Strömungsfelder die Reaktion erheblich beschleunigen kann.

Diese geometrischen Effekte lassen sich deutlich erkennen, wenn man die Strömungsfelder in Reaktoren mit hohen und niedrigen Seitenverhältnissen vergleicht, und zwar bei hohem Seitenverhältnis. Fluidpartikel werden entlang von Trajektorien beeinflusst, die im Wesentlichen geschlossene Schleifen beschreiben und dazu verdammt sind, über längere Zeiträume denselben Pfaden zu folgen. Folglich besteht kaum Gelegenheit zum Austausch zwischen Strömungspfaden, die Reagenzien der optimalen Abfolge thermischer Bedingungen für die PCR aussetzen, und dem weitaus größeren Ensemble der übrigen Trajektorien, die nicht zur Amplifikation beitragen.

Das Strömungsfeld unterscheidet sich bei einem kleineren Seitenverhältnis stark. Das Strömungsfeld ist chaotischer, da die Trajektorien der Fluidelemente den geschlossenen Bahnen nicht mehr folgen. Obwohl die Reaktionen einem komplexeren Temperaturprofil unterliegen, können die Fluidelemente ein viel breiteres Spektrum an Trajektorien durchlaufen, sodass ein größerer Teil des Reagenzvolumens die Möglichkeit hat, optimale thermische Profile zu durchlaufen.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwar individuelle Strömungsverläufe bei H durch D gleich neun günstiger für die PCR erscheinen, da sie Temperaturprofile erzeugen, die denen eines herkömmlichen Thermocyclers ähneln. Die chaotische Natur des Strömungsfeldes bei HOD gleich drei dominiert jedoch auf globaler Ebene, indem sie einen verbesserten Austausch fördert, sodass Reagenzien nicht allzu lange in ungünstigen Trajektorien gefangen bleiben. Um diese Hypothese zu überprüfen und festzustellen, welche Reaktorgeometrie für die PCR günstiger war, wurden beide Zylinder verwendet, um die PCR-Vervielfältigung eines 295 Basenpaare langen Zielabschnitts, der mit dem Beta-Aktin-Gen aus einer humanen genomischen DNA-Vorlage assoziiert ist, durchzuführen. Die Amplifikation des korrekten Zielprodukts wurde wiederholt innerhalb von nur 10 Minuten bei H durch D gleich drei erreicht.

Umgekehrt dauerte dieselbe Reaktion mindestens 20 Minuten, bis nachweisbare Produkte bei einem H/D-Verhältnis von neun beobachtet wurden. Die Reaktionsspezifität ist ebenfalls deutlich höher bei einem H/D-Verhältnis von drei, wo ein einziges PCR-Produkt erhalten wird. Während bei einem H/D-Verhältnis von neun mehrere unspezifische Produkte entstehen, wobei das Strömungsfeld Fluidelemente über längere Zeiträume in ungünstige thermische Trajektorien einschließt.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine PCR-Reaktion mithilfe eines konvektiven Flusses durchführt. Thermocycler. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, darauf zu achten, die Reagenzien im Reaktionsgefäß luftblasenfrei zu verschließen. Andernfalls würden diese das Strömungsfeld im Inneren stören und die Reaktion hemmen.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.