Name: Rapid PCR Thermocycling mit Microscale thermische Konvektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Erfahren Sie, wie PCR-Thermocycling durch thermische Konvektion funktioniert. Diese Methode nutzt natürliche Konvektion für schnelle DNA-Amplifikation ohne komplexe Geräte.

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Wir danken danken T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, und B. Wallek an Lynntech, Inc. für die technische Unterstützung und viele hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der US National Science Foundation (NSF) unter dem Förderkennzeichen CBET-0933688 unterstützt.

1. Basic Design der Convective Thermocycler <ol><li> Wir haben eine einfache konvektive Thermocycling Gerät, bestehend aus auswechselbaren Kunststoff Reaktionskammer "Patronen", die zwischen zwei Aluminiumplatten, deren Temperaturen unabhängig 7 gesteuert (Abbildung 2) eingeklemmt aufgebaut sind. </li><li> Zylindrischen Reaktor Brunnen sind durch Bearbeitung Arrays von Löchern in Polycarbonat-Blöcke, mit verschiedenen Kombinationen von Durchmesser und Kunststoff Blechdicke eingesetzt, um die gewünschte Seitenverhältnis (Höhe / Durchmesser = h / d) zu erreichen eingebettet. Zwei verschiedene Reaktor Geometrien sind in der hier vorgestellten Ergebnisse betrachtet: h / d = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 ul-Volumen; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 ul Volumen. </li><li> Die untere Fläche des Reaktors erhitzt wird mit einem Aluminium-Block mit Heizpatronen Schnittstelle mit einer Mikroprozessorsteuerung angetrieben Temperaturregler. </li><li> Die Temperatur an der Reaktor-Oberfläche reguliert wird mit einem Aluminium-Block verbunden mit einem umlaufenden Wasserbad. </li><li> Der gesamte Aufbau wird zusammen mit Nylon-Schrauben, um die Wärmeleitung zwischen den gegnerischen Blöcken Aluminium Grenze geklemmt. </li></ol> 2. Vorbereitung und Laden des PCR-Reaktionsgemisches <ol><li> Eine typische 100 ul Reaktionsgemisch enthält 10 uL 10x Puffer, 6 &amp;mgr; l 25 mM MgCl 2, 10 ul dNTPs (2 mM), 41,2 ul VE-Wasser, 10 l β-Aktin-Sonde, 10 l β -Aktin Vorwärtsprimer, 10 l β-Aktin-Reverse-Primer, 2 ul der humanen genomischen DNA-Template (10 ng / mL) und 0,8 ul der KOD-DNA-Polymerase (2,5 Einheiten / ul). </li><li> Vor dem Einlegen der Reagenzien, Dichtung der unteren Fläche der PCR-Kammer mit einer dünnen Aluminiumfolie. </li><li> Spülen Sie den Reaktor Brunnen mit einer 10 mg / mL wässrige Lösung von Rinderserumalbumin durch Regen-X Anti-Fog gefolgt. </li><li> Pipette Reagenzien in den Reaktor Brunnen mit langen Gel-loading Pipettenspitzen und Abdichtung der Oberfläche mit FEP Teflon tape. </li></ol> 3. Ausführen der Reaktion in der Convective Thermocycler <ol><li> Vor Beginn der Reaktion, Vorwärmen sowohl Aluminium-Blöcken, um die gewünschte Ober-und Unterseite Temperaturen. </li><li> Sandwich der Kunststoff-Reaktor mit PCR-Reagenzien zwischen den Aluminium Heizblöcke geladen, schnell und klemmen die Montage zusammen mit Nylon-Schrauben. </li><li> Nach der Reaktion für die gewünschte Zeit fortgeschritten ist, schalten Sie die Heizung und setzen Sie den unteren (hot) Oberfläche des Gerätes auf einem gekühlten Metallblock schnell abkühlen und stoppen Sie die konvektive Strömung. </li><li> Entfernen Sie die Kunststoff-Reaktor und Pipette die Produkte aus dem Brunnen (mit dem langen Gelbeladung Tipps) für die spätere Analyse. </li></ol> 4. Performing-Gel-Elektrophorese-Analyse <ol><li> Bereiten Sie eine 2 Gew.% Agarosegel durch Erhitzen von 10 g Agarose mit 500 ml 1x Puffer auf einer Heizplatte unter Rühren, bis die Lösung klar wird. </li><li> Laden Sie das Agarosegel in die Gelträger und den Kamm einsetzen. Lassen Sie das Gel-Set für ~ 30 min. </li><li> Entfernen Sie den Kamm und fügen 1x TAE-Puffer, bis das Gel getaucht. </li><li> Fluoreszierend gefärbten DNA-Proben enthalten 2 ul 100x SYBR Green I-Lösung, 2 ul DNA-Probe, 2 ul 6x orange Loading Dye und 4 ul TAE-Puffer. </li><li> Fügen Sie die DNA-Proben in die Vertiefungen und führen Sie die Trennung bei 60 V für 1 h mit einer 100 bp DNA-Leiter Sizing-Marker. </li><li> Entfernen Sie das Gel, es fotografieren und unter UV-Licht, um das Ergebnis zu erhalten. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Optimale Gestaltung der konvektiven Thermocycler beinhaltet die Auswahl der richtigen Reaktorgeometrie, dass eine Zirkulationsströmung transportieren kann Reagenzien durch die wichtigsten Temperaturen in den PCR-Prozess beteiligten generieren wird. Die geometrischen Parameter, die in den zylindrischen Reaktoren als hier variiert werden kann, sind die Höhe (h) und Durchmesser (d), oder äquivalent das Seitenverhältnis (h / d). Wir haben die 3-D Strömungsfelder in konvektiven PCR Reaktoren über eine Reihe von verschiedenen Bildformaten mit Computational Fluid Dynamics (CFD) untersucht und festgestellt, dass unerwartet komplexe Muster entstehen können. Noch wichtiger ist, hat unsere Analyse eine Teilmenge dieser komplexen Strömungsfelder, die erheblich beschleunigen die Reaktion 12 aufgedeckt. Diese geometrischen Auswirkungen können eindeutig durch einen Vergleich der Strömungsfelder in Reaktoren bei hohen und niedrigen Seitenverhältnisse zu sehen. In den hohen Seitenverhältnis Fall (h / d = 9; ein großer, magerer Zylinder), sind fließend Elemente entlang Trajektorien Tracing-Pfade, die im Wesentlichen Schleifen geschlossen advehiert, und sie sind locked-in, um die gleichen Wege für lange Zeiträume verfolgen Zeit (Abbildung 3a). Folglich gibt es wenig Gelegenheit für den Austausch zwischen fniedrigen Flugbahnen, die Reagenzien aussetzen, um die optimale Abfolge der thermischen Bedingungen für die PCR (oszillierend zwischen den Glüh-und Denaturierung Extremen am Reaktor der Ober-und Unterseite) und der viel größeren Ensemble von restlichen Bahnen, die nicht zu einer Verstärkung beitragen (näher an der Mitte lokalisierten des Reaktors). Das Strömungsfeld ist ganz anders in einem kleineren Bildformat (h / d = 3; einen kürzeren, breiteren Zylinder), immer chaotisch in dem Sinne, dass das flüssige Element Bahnen nicht mehr folgen geschlossene Pfade (Abbildung 3b). So, obwohl Reagenzien zu einem komplexeren Temperaturprofil ausgesetzt sind, sind fließend Elemente in der Lage, eine viel breitere Palette von Trajektorien zu erkunden, so dass mehrere der Reagenzvolumen hat eine Chance, um eine optimale thermische Profile Erfahrung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass counterintuitively während einzelne Strömungstrajektorien bei h / d = 9 zu sein scheint günstiger für die PCR durch die Produktion Temperaturprofile, "Look" ähnlich wie in einem herkömmlichen Thermocycler, die chaotische Natur des Strömungsfeldes bei h / Arbeitnehmer d = 3 letztlich dominiert auf globaler Ebene durch die Förderung verstärkter Austausch, so dass Reagenzien nicht eingeklemmt werden in ungünstigen Trajektorien für sehr lange. Um diese Hypothese zu prüfen und festzustellen, welche Reaktorgeometrie günstiger für die PCR war, haben wir beide zu PCR-Replikation von einem 295 bp Ziel mit der β-Aktin-Gen aus einer humanen genomischen DNA-Template zugeordnet wird. Bemerkenswert ist, dass wir routinemäßig erreicht Verstärkung der richtigen Ziel-Produkt in nur 10 min bei h / d = 3 (Abbildung 4a), während die gleiche Reaktion benötigt mindestens 20 min vor nachweisbare Produkte h / d beobachtet = 9 (Abbildung 4b) . Die Reaktion Spezifität ist auch viel größer bei h / d = 3, wo ein einziges PCR-Produkt erhalten wird, während mehrere unspezifische Produkte zu h erzeugt / d = 9, wo das Strömungsfeld Fallen Fluidelemente in ungünstigen thermischen Trajektorien für längere Zeit. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Thermische Konvektion in einer zylindrischen Kammer, deren Ober-und Unterseite befinden sich in verschiedenen festen Temperaturen gehalten. Wenn die Temperatur an der Unterseite höher ist als an der Spitze, ist eine vertikale Dichtegradienten innerhalb des eingeschlossenen Flüssigkeit, geeignet zur Erzeugung einer Zirkulationsströmung Muster ist etabliert. Mit der richtigen Wahl der geometrischen Parameter (Höhe h und Durchmesser d), kann die Konvektionsströmung Bereich genutzt werden, um PCR Thermocycling betätigen, wenn die Ober-und Unterseite in der Nähe Glüh-und Denaturierung Temperaturen, bzw. (Schwerkraft wirkt senkrecht nach unten) sind manintained werden. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. (A) Die wichtigsten Komponenten einer Konvektionsströmung PCR Thermocyclers. Ein Reaktor Kartusche besteht aus einem Polycarbonat-Block mit einer Reihe von zylindrischen Kammern. Der Block wird zwischen einer oberen Platte zur Verbindung mit einem zirkulierenden Wasserbad und einer Bodenplatte Einbeziehung embedded Heizungen angeschlossen werden eingeklemmt. (B) Die PCR-Reagenzien beladen und versiegelt im Inneren des Reaktors Patrone, nach der das Gerät montiert wird, um die Reaktion durchzuführen. Nach der Fertigstellung können die procucts leicht pipettiert werden aus für die spätere Analyse. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Computersimulationen von 3-D Konvektionsströmung Felder in zylindrischen Reaktoren mit Temperaturen von 53 und 96 ° C erzeugt an der Ober-und Unterseite verhängt, jeweils. Die Ergebnisse werden auf Seitenverhältnisse von (a) gezeigt h / d = 9 (38,2 ul Reaktorvolumen) und (b) h / d = 3 (18,5 ul Reaktorvolumen). Eine repräsentative Trajektorie durch eine flüssige Element Reise durch die 3D-Strömungsfeld gefolgt ist gezeigt, die zusammen mit Ober-und Seitenansicht Projektionen der Weg nach links, die entsprechende Kurve der Temperatur-Zeit-im Anschluss an eine flüssige Element ist an der rechten Seite angezeigt. Die thermische Profil bei h / d = 9 erscheint nahe dem eines herkömmlichen Thermocycler, aber die chaotischen Feld h / d = 3 ist counterintuitively günstiger für PCR. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. DNA-Replikation Ergebnisse in den Reaktor Geometrien in Abbildung 3 (Ober-und Unterseite wurden bei 53 und 96 ° C gehalten, bzw.) gezeigt erhalten. (A) PCR ist sehr besorgt h / d = 3 beschleunigt, da offensichtlich durch starke Produkte sichtbar nach nur 10 min Reaktionszeit (M: 100 bp Leiter, Spuren 1-4: Produkte aus Reaktionen parallel in 4 verschiedenen zylindrischen Kammern). (B h / d = 9 durchgeführt benötigt mindestens 20 min vor dem sichtbaren Produkten beobachtet werden, und mehrere Bänder sind offensichtlich zeigt die Replikation von nicht-spezifische Ziel-DNA neben dem gewünschten Produkt (M: 100 bp Leiter, Spuren 1-2: Produkte aus Reaktionen parallel in 2 verschiedenen zylindrischen Kammern).

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</ol>

Das Wechselspiel zwischen Fluss und chemische Reaktion kann dramatisch verändern unter dem Einfluss der chaotischen Advektion. Aber diese komplexen Strömungs-Staaten sind schwierig zu untersuchen, insbesondere in realistischen Geometrien, wo 3D-Effekte wichtig werden. Rayleigh-Benard-Konvektion in h / d&gt; 1 bietet nicht nur eine bequeme Plattform, um diese Phänomene zu erforschen, deren Anwendung auf PCR durchführen ermöglicht auch die Kopplung zwischen Strömung und chemischen Reaktionen untersucht werden. Diese einzigartige Fähigkeit macht es möglich, optimale Strömung Staaten, in denen chaotische Effekte handeln (counterintuitively) die Rate der DNA-Replikation zu beschleunigen, um zu wählen.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA-Polymerase-Kit</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan &amp;#946;-Actin-Control-Reagenzien-Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>401846</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X Anti-Fog</td><td>SOPUS Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Long Gel-Lade-Pipettenspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-151</td><td></td></tr><tr><td>FEP-Teflon-Band</td><td>McMaster-Carr</td><td>7562A17</td><td></td></tr><tr><td>Agarosegel</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3107</td><td></td></tr><tr><td>TAE-Laufpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>141-0743</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>6x Orangefarbener Lade-Farbstoff</td><td>Fermentas</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA-Längenmarker (DNA-Ladder)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8202</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid pcr thermocycling mit microscale thermische konvektion

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Viele molekularbiologische Tests hängen in irgendeiner Weise auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um eine zunächst verdünnt Ziel-DNA-Probe, um eine nachweisbare Konzentration zu verstärken. Aber auch das Design der konventionellen PCR Thermocycling Hardware, vor allem auf massive Metall Heizblöcke, deren Temperatur durch thermoelektrische Heizungen geregelt, schränkt die erreichbare Reaktionsgeschwindigkeit 1. Erhebliche elektrische Energie wird auch benötigt, um wieder heizen und kühlen die Reagenz-Mischung, mit denen die Fähigkeit, diese Instrumente in ein portables Format bereitgestellt werden. Thermische Konvektion ist als eine vielversprechende Alternative Thermocycling Ansatz, der das Potenzial, diese Einschränkungen zu überwinden 2-9 entstanden. Konvektive Strömungen sind an der Tagesordnung in eine Vielfalt von Einstellungen von der Erdatmosphäre, die Ozeane, und Interieur, dekorative und bunte Lavalampen. Fluid-Bewegung ist in der gleichen Weise in jedem Fall eingeleitet: einen Auftrieb getrieben Instabilität entsteht, wenn eine beschränkte Volumen der Flüssigkeit, um eine räumliche Temperaturgradienten ausgesetzt ist. Die gleichen Phänomene bieten eine attraktive Möglichkeit, PCR Thermocycling durchzuführen. Durch Anlegen eines statischen Temperaturgradient über eine entsprechend ausgebildete Reaktorgeometrie, kann eine kontinuierliche Zirkulationsströmung festgestellt, dass wird wiederholt Transport PCR Reagenzien durch Temperaturzonen mit der Denaturierung, Annealing und Ausbaustufen der Reaktion (Abbildung 1) in Verbindung gebracht werden. Thermocycling kann daher in einer pseudo-isotherme Weise durch einfaches hält zwei gegenüberliegenden Flächen zu festen Temperaturen betätigt werden, vollständig entfällt die Notwendigkeit, immer wieder heizen und kühlen das Gerät. Eine der größten Herausforderungen für Design konvektiven Thermocycler ist die Notwendigkeit zur präzisen Steuerung der räumlichen Geschwindigkeits-und Temperaturverteilung innerhalb des Reaktors zu gewährleisten, dass die Reagenzien nacheinander besetzen die richtigen Temperaturzonen für einen ausreichenden Zeitraum 10,11. Hier beschreiben wir Ergebnisse unserer Bemühungen um die volle 3-D Geschwindigkeit und Temperatur-Verteilungen in mikroskaligen konvektiven Thermocycler 12-Sonde. Unerwarteterweise haben wir eine Teilmenge der komplexen Strömungstrajektorien, die sehr günstig sind für die PCR durch eine synergistische Kombination von (1) kontinuierlicher Austausch zwischen Fließwege, dass eine erweiterte Möglichkeit bietet für Reagenzien das gesamte Spektrum der optimalen Temperatur-Profile Probe zu entdecken, und ( 2) erhöhten Zeitaufwand in der Verlängerung Temperaturzone der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der PCR. Extrem schnelle DNA-Vervielfältigung Zeiten (unter 10 min) sind erreichbar in Reaktoren entwickelt, um diese Ströme zu erzeugen.

Wir beschreiben eine neuartige Methode zur DNA-Replikation über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchführen. Thermische Konvektion ist die kontinuierliche Shuttle Reagenzien zwischen Denaturierung, Annealing und Extension Bedingungen durch die Aufrechterhaltung gegenüberliegenden Oberflächen des Reaktors bei konstanter Temperatur genutzt. Dieses an sich einfache Design verspricht, um eine schnelle PCR mehr zugänglich.

Rapid PCR Thermocycling mit Microscale thermische Konvektion

Viele molekularbiologische Assays hängen in irgendeiner Weise von der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ab, um eine anfangs verdünnte Ziel-DNA-Probe bis zu einer nachweisbaren ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie das Prinzip der PCR-Thermocycling mittels thermischer Konvektion angewendet werden kann, um eine tatsächliche Reaktion durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Konzept der natürlichen Konvektions-Thermocycling sowie die grundlegenden Konstruktionsprinzipien erläutert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens zeigt, wie die Reaktorkartusche vorbereitet und mit den Reagenzien befüllt wird.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Reaktorkassette in die Heizeinheit einzubauen und die Reaktion durchzuführen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Entfernen der Reagenzien nach der Reaktion und die Überprüfung der Ergebnisse mittels Gelelektrophorese. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine schnelle DNA-Replikation durch natürliche Konvektions-PCR-Thermocycling zeigen.Hallo, ich bin Radha OU aus dem UGAs-Labor der Texas A&M University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung einer schnellen PCR-Thermocyclisierung unter Verwendung natürlicher Konvektion, wie bei einer Lava-Lampe. Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um die Konstruktion und Optimierung von Thermocyclisierungsgeräten zu untersuchen, die auf diesem Prinzip basieren.Beginnen wir also. Dieses Protokoll startet mit der Konstruktion und dem Aufbau eines einfachen konvektiven Thermocyclers. Die Vorrichtung, die für diese Demonstration verwendet wird, besteht aus austauschbaren Kunststoff-Reaktionskammer-Kassetten, die zwischen zwei Aluminiumplatten eingeschoben werden, deren Temperaturen unabhängig voneinander gesteuert werden.Zylindrische Reaktorwannen wurden durch Fräsen von Lochrastern in Polycarbonatblöcken mit unterschiedlichen Kombinationen aus Lochdurchmesser und Kunststoffscheibendicke realisiert, um die gewünschten Aspektverhältnisse zu erreichen. Die optimale Konstruktion erfordert die Auswahl der geeigneten Reaktorgeometrie, die eine zirkulatorische Strömung erzeugt, welche Reagenzien durch die für den PCR-Prozess entscheidenden Temperaturen transportieren kann. Die geometrischen Parameter, die bei den hier betrachteten zylindrischen Reaktoren variiert werden können, sind die Höhe und der Durchmesser beziehungsweise das Aspektverhältnis.Die untere Oberfläche des Reaktors wird mithilfe eines Aluminiumblocks erhitzt, der Heizpatronen enthält und mit einem mikroprozessorgesteuerten Temperaturregler verbunden ist. Die Temperatur an der oberen Oberfläche des Reaktors wird über einen mit einem umwälzenden Wasserbad verbundenen Aluminiumblock geregelt. Die gesamte Baugruppe wird mit Nylon-Schrauben zusammengeklemmt, um die Wärmeleitung zwischen den gegenüberliegenden Aluminiumblöcken zu begrenzen.Bereiten Sie jede 100 µL-Freisetzung der PCR-Reaktion vor, indem Sie 10× Pufferlösung, 25 mmol/l Magnesiumchlorid, zwei DTPs destilliertes Wasser, die Beta-Aktin-Sonde, Vorwärtsprimer und Rückwärtsprimer, humanen genomischen DNA-Vorlage und KOD-DNA-Polymerase mischen. Vor dem Einfüllen der Reagenzien versiegeln Sie die untere Oberfläche der PCR-Kammer mit einem dünnen Aluminiumfolienstreifen, spülen die Reaktionsgefäße mit einer wässrigen Lösung von 10 mg/ml Rinderserumalbumin und anschließend mit Rain X Anti-Fog. Geben Sie schließlich die Reagenzien mit Gel-Ladepipettenspitzen in die Reaktionsgefäße und verschließen Sie die obere Oberfläche mit FEP-Teflon-Band.Bevor die Reaktion beginnt, beide Aluminiumblöcke auf die gewünschten oberen und unteren Oberflächentemperaturen vorheizen. Den mit PCR-Reagenzien beladenen Kunststoffreaktor zwischen die Aluminiumheizblöcke legen und die Einheit mithilfe von Nylon-Schrauben schnell zusammenspannen. Nachdem die Reaktion für die gewünschte Zeit abgelaufen ist, die Heizungen ausschalten und die untere beheizte Oberfläche des Geräts auf einen gekühlten Metallblock legen, um sie rasch abzukühlen und die konvektive Strömung zu stoppen.Entfernen Sie den Kunststoffreaktor und pipettieren Sie die Produkte aus den Vertiefungen für die anschließende Analyse. Bereiten Sie ein 2 %iges Agarosegel vor, indem Sie 10 Gramm Agarose mit 500 Millilitern eines Pufferlösungsansatzes (1×) auf einem gerührten Heizplättchen erhitzen, bis die Lösung klar wird. Gießen Sie das Agarosegel in die Gussform und setzen Sie den Kamm ein.Lassen Sie das Gel etwa 30 Minuten lang erstarren. Entfernen Sie den Kamm und geben Sie 1× TAE-Puffer hinzu, bis das Gel bedeckt ist. Bereiten Sie fluoreszenzmarkierte DNA-Proben mit zwei Mikrolitern 100× Cyber Green vor.Eine Lösung aus zwei Mikrolitern DNA-Probe, zwei Mikrolitern sechsfarbigen orangefarbenen Lade-Farbstoff und vier Mikrolitern TAE-Puffer. Geben Sie einen 100-Basenpaar-DNA-Längenmarker (DNA-Ladder) und die DNA-Proben in die Vertiefungen des Gels. Trennen Sie die DNA durch Elektrophorese bei 60 Volt für eine Stunde. Entfernen Sie das Gel und fotografieren Sie es unter UV-Licht, um das Ergebnis zu erhalten. 3D-Strömungsfelder innerhalb konvektiver PCR-Reaktoren wurden über einen Bereich unterschiedlicher Seitenverhältnisse hinweg mithilfe der numerischen Strömungsmechanik (Computational Fluid Dynamics, CFD) untersucht. Diese Daten zeigten, dass komplexe Muster entstehen können und dass eine Teilmenge dieser komplexen Strömungsfelder die Reaktion erheblich beschleunigen kann.Diese geometrischen Effekte lassen sich deutlich erkennen, wenn man die Strömungsfelder in Reaktoren mit hohen und niedrigen Seitenverhältnissen vergleicht, und zwar bei hohem Seitenverhältnis. Fluidpartikel werden entlang von Trajektorien beeinflusst, die im Wesentlichen geschlossene Schleifen beschreiben und dazu verdammt sind, über längere Zeiträume denselben Pfaden zu folgen. Folglich besteht kaum Gelegenheit zum Austausch zwischen Strömungspfaden, die Reagenzien der optimalen Abfolge thermischer Bedingungen für die PCR aussetzen, und dem weitaus größeren Ensemble der übrigen Trajektorien, die nicht zur Amplifikation beitragen.Das Strömungsfeld unterscheidet sich bei einem kleineren Seitenverhältnis stark. Das Strömungsfeld ist chaotischer, da die Trajektorien der Fluidelemente den geschlossenen Bahnen nicht mehr folgen. Obwohl die Reaktionen einem komplexeren Temperaturprofil unterliegen, können die Fluidelemente ein viel breiteres Spektrum an Trajektorien durchlaufen, sodass ein größerer Teil des Reagenzvolumens die Möglichkeit hat, optimale thermische Profile zu durchlaufen.Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwar individuelle Strömungsverläufe bei H durch D gleich neun günstiger für die PCR erscheinen, da sie Temperaturprofile erzeugen, die denen eines herkömmlichen Thermocyclers ähneln. Die chaotische Natur des Strömungsfeldes bei HOD gleich drei dominiert jedoch auf globaler Ebene, indem sie einen verbesserten Austausch fördert, sodass Reagenzien nicht allzu lange in ungünstigen Trajektorien gefangen bleiben. Um diese Hypothese zu überprüfen und festzustellen, welche Reaktorgeometrie für die PCR günstiger war, wurden beide Zylinder verwendet, um die PCR-Vervielfältigung eines 295 Basenpaare langen Zielabschnitts, der mit dem Beta-Aktin-Gen aus einer humanen genomischen DNA-Vorlage assoziiert ist, durchzuführen. Die Amplifikation des korrekten Zielprodukts wurde wiederholt innerhalb von nur 10 Minuten bei H durch D gleich drei erreicht.Umgekehrt dauerte dieselbe Reaktion mindestens 20 Minuten, bis nachweisbare Produkte bei einem H/D-Verhältnis von neun beobachtet wurden. Die Reaktionsspezifität ist ebenfalls deutlich höher bei einem H/D-Verhältnis von drei, wo ein einziges PCR-Produkt erhalten wird. Während bei einem H/D-Verhältnis von neun mehrere unspezifische Produkte entstehen, wobei das Strömungsfeld Fluidelemente über längere Zeiträume in ungünstige thermische Trajektorien einschließt.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine PCR-Reaktion mithilfe eines konvektiven Flusses durchführt. Thermocycler. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, darauf zu achten, die Reagenzien im Reaktionsgefäß luftblasenfrei zu verschließen. Andernfalls würden diese das Strömungsfeld im Inneren stören und die Reaktion hemmen.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Proteinfehlfaltungen Cyclic Amplification von Prionen

Pyrosequencing ist eine vielseitige Technik, die mikrobielle Genom-Sequenzierung, die verwendet werden, um bakterielle Spezies identifizieren, diskriminieren Bakterienstämme und erkennen genetische Mutationen, die eine Resistenz gegen antimikrobielle Mittel werden erleichtert. In diesem Video, wird das Verfahren für die mikrobielle Amplikon Generation Amplikon pyrosequencing und DNA-Sequenzanalyse nachgewiesen werden.

Pyrosequencing für Mikrobielle Identifizierung und Charakterisierung

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Dieses Protokoll beschreibt die kritische Schritte und Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, einzelne Zelle multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-Clamp durchzuführen. Diese Technik ist eine einfache und effektive Methode um das Expressionsprofil eines vorgegebenen Satzes Gene aus einer einzigen Zelle zeichnet sich durch Patch-Clamp-Aufnahmen zu analysieren.

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

Die kinetische Vernetzung und Analyse von cDNA ist eine Methode, die es ermöglicht, die Dynamik von Protein-RNA-Interaktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Hier wird das Protokoll detailliert beschrieben, einschließlich des Wachstums von Hefezellen, der UV-Vernetzung, der Ernte, der Proteinreinigung und der Vorbereitungsschritte der Next-Generation-Sequencing-Bibliothek.

Überwachung der Protein-RNA-Interaktionsdynamik in vivo mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von χCRAC

Dieses Protokoll beschreibt, wie man ein Continuous-Flow-Polymerase-Kettensystem auf der Basis eines Mikrofluidik-Chips aufbaut und wie man ein Kapillarelektrophoresesystem im Labor aufbaut. Es stellt eine einfache Methode für die Analyse von Nukleinsäuren im Labor vor.

Amplifikation von Escherichia coli in einem Continuous-Flow-PCR-Mikrofluidik-Chip und deren Detektion mit einem Kapillarelektrophorese-System

Die vollständige Genotypisierung von einer Maus Schwanz Probe, einschließlich Gewebe Verdauung und PCR-Anzeige ist in eineinhalb Stunden mit Sigma SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit durchgeführt.

Schnelle Genotypisierung von Maus Tissue Mit Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Die Solaris qPCR Gene Expression Assays sind neuartige pre-designed qPCR Primer / Sonden-Kombinationen entwickelt, um die qPCR-Prozess, ohne die Spezifität und Robustheit des Tests zu vereinfachen.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Erfahren Sie, wie PCR-Thermocycling durch thermische Konvektion funktioniert. Diese Methode nutzt natürliche Konvektion für schnelle DNA-Amplifikation ohne komplexe Geräte.

Rapid PCR Thermocycling mit Microscale thermische Konvektion

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