Induktion und Überwachung von Active Delayed Type Überempfindlichkeit (DTH) in Ratten

Hallo, ich bin Christine Beaton. Ich arbeite im Labor von George Chandy an der Abteilung für Physiologie und Biophysik an der UCI. Heute werde ich Ihnen zeigen, wie man eine aktive DTH-Reaktion bei Ratten auslöst.

Dazu werde ich eine Emulsion aus KLH, meinem Antigen, in France-Adjuvans herstellen. Anschließend werde ich diese Emulsion an der Schwanzwurzel von Lewis-Ratten injizieren. Dadurch wird eine Immunisierung der Ratten gegen KH ausgelöst. Nach einer Woche werde ich die Ratten mit KH herausfordern und die DTH-Reaktion durch Messung der Schwellung quantifizieren.

Das ist der Ort der Herausforderung, und wir nutzen dies im Labor, um die Wirkung von PO-Kanalblockern auf entzündliche Reaktionen wie die verzögerte Typ-Hypersensitivität (DTH) zu untersuchen. Hier ist das unvollständige trans-Adjuvans, das ich zur Herstellung der Emulsion verwenden werde. Ich könnte auch das vollständige trans-Adjuvans verwenden.

Hier sind Quarze von KLH, das ist mein Antigen für heute, und ich habe hier eine Lösung mit zwei Milligramm pro ml. In PBS werde ich diese 5-ml-Spritze verwenden, um das inkomplette Trans-Adjuvans abzusaugen und in ein 15-ml-Gefäß umzufüllen. Anschließend stelle ich das Gefäß auf den Vortexer und gebe unter Vortexen mein Antigen tropfenweise zum Adjuvans hinzu.

Dann werde ich weitere fünf Minuten lang vortexen. Danach fülle ich die Mischung in eine 5-M-Glaspipette, die aus Glas bestehen muss, da das Adjuvans die Neigung hat, Plastik aufzulösen. Die 5-M-Pipetten haben sich als die besten zur Emulsionsherstellung erwiesen.

Kleiner oder größer ist nicht so gut. Und sobald ich meine Spritze mit der Mischung gefüllt habe, werde ich diese Metallbrücke verwenden, um diese Glasspritze mit einer weiteren 5-ml-Glasspritze zu verbinden. Dann werde ich Druck auf die Spritzen ausüben, um die Mischung so schnell wie möglich von einer Spritze in die andere zu befördern, bis sie wirklich fest wird, bis die Emulsion wirklich fest ist, und dann ist sie bereit zur Injektion.

Ich werde also 2,5 ml meines Adjuvans hinzufügen. Ich injiziere zunächst Luft, um das Adjuvans leichter entnehmen zu können, und gebe anschließend das gesamte Adjuvans in mein Reagenzglas. Als Nächstes entnehme ich 2,5 ml davon und gebe diese unter Wirbeln in das Gefäß.

Da ich 2,5 ml des Adjuvans genommen habe, werde ich nun 2,5 ml meines KLH hinzufügen. Wenn ich es tropfenweise hinzugebe, werden Sie sehen, wie sich die Mischung verfärbt und weiß wird. Nun habe ich das gesamte Antigen zum Adjuvans hinzugefügt.

Was ich nun tun werde, ist, die Mischung weitere fünf Minuten lang zu wirbeln. Da ich jedoch das Gefäß nicht fünf Minuten lang halten möchte, werde ich es am Wirbelmixer festkleben, um den Wirbel in der Probe erzeugen. Dabei soll der Wirbel so schnell wie möglich sein, ohne dass die Probe überläuft. Ich werde es daher fünf Minuten lang so belassen.

Die fünf Minuten sind also vorbei. Ich werde nun den Vortex anhalten, und meine Mischung ist weiß. Ich nehme das Reagenzglas heraus. Hoppla.

Die Mischung ist mittlerweile vollständig weiß, aber immer noch ziemlich flüssig. Für die Injektion wollte ich jedoch eine festere Konsistenz. Daher werde ich die gesamte Mischung in eine 5-ml-Glaskanüle umfüllen.

Diese Spritzen wurden also autoklaviert. Ich verbinde eine komplette Spritze mit meiner Brücke. Von der anderen Spritze verbinde ich nur den Zylinder.

Ich lasse den Kolben draußen und gieße dann meine Mischung in die obere Spritze. Ich werde alles in die untere Spritze übertragen. Danach muss ich die hier vorhandene Luftblase nachspülen.

Ich werde nun die obere Spritze abkoppeln und die Luftblase voranschieben. Die Blase ist schwer zu erkennen, aber sie befindet sich genau hier. Ich schiebe also die Luftblase voran.

Ich presse es außerdem aus der Verbindung heraus und verbinde danach die obere Spritze erneut. Ich stelle sicher, dass alles fest verbunden ist, und gebe dann meine Mischung von der einen Spritze in die andere weiter. Zunächst ist dies einfach, doch bald wird sich die Mischung verfestigen.

Daher wird es heute Abend schwieriger und ich möchte die Brücke nicht beschädigen, also drehe ich einfach meine Spritzen. Manchmal dauert es länger. Das variiert von Emulsion zu Emulsion.

Das hängt wahrscheinlich von der Temperatur und auch vom Feuchtigkeitsgrad ab. Aber ich denke, meine Emulsion ist fertig. Sie ist viel dicker als beim Eingießen.

Es ist vollständig weiß und es gibt nur eine Phase. Es sollte niemals eine Trennung der ACO-Phase vom Öl auftreten.

Jetzt ist es bereit zur Injektion. Die Suspension ist jetzt bereit zur Injektion. Um sie zu injizieren, verwende ich 200 Mikroliter pro Tier.

Dafür werde ich 3-ml-Spritzen verwenden. Ich benutze Spritzen mit Luer-Lock-Aufsatz, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht herausfällt, da die Emulsion sehr zäh und schwierig zu injizieren sein kann. Bei den Nadeln versuche ich, die kleinstmöglichen Nadeln zu verwenden, die dennoch zulassen, dass die Emulsion hindurchfließen kann.

Und ich stellte fest, dass die 20-ml-Spritzen ausreichend für diese Emulsion sind. Für dickflüssigere Emulsionen benötigen Sie möglicherweise größere Spritzen. So wie wir es machen: Eine Person hält die Ratte, während die andere Person die Injektion durchführt.

Und aus Gründen der maximalen Sicherheit trägt die Person, die die Ratten hält – obwohl diese Ratten sehr ruhig sind und es gewohnt sind, angefasst zu werden – spezielle, rattenzahnsichere Handschuhe, um höchstmögliche Sicherheit zu gewährleisten; wir möchten keine Verletzungen durch die Ratte riskieren. Ich fülle die gesamte Emulsion in eine Glasspritze und trenne die leere Glasspritze von der Brücke ab. An deren Stelle setze ich meine untere Dreimilliliter-Kunststoffspritze mit Luer-Lock-Verschluss ein.

Nun übertrage ich mehr, als ich für eine Injektion der Emulsion benötige. Ich verdränge die Luftblase. Da ich 200 Mikroliter pro Injektion verabreichen werde, lasse ich 300 Mikroliter in meiner Spritze.

Ich trenne die Verbindung, setze meine Nadel auf die Plastikspritze auf, fülle anschließend die Nadel und stelle den Kolben auf 200 Mikroliter ein. Auf diese Weise stelle ich sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Nun sind wir bereit zur Injektion.

Daher müssen wir sicherstellen, dass sich die Ratte nicht bewegt. Wir halten die Ratte fest, lege einen Finger oberhalb und einen unterhalb der Schulter, und mit der anderen Hand halte ich die Hinterbeine und den Schwanz. Dann injizieren wir an den Flanken hier Mikroliter auf dieser Seite und anschließend Mikroliter auf der anderen Seite. Letzte Woche habe ich die Ratten mit einer Emulsion immunisiert, die KLH als Antigen enthält.

Und heute werde ich sie intradermal am Rücken mit KLH, meinem Antigen, und mit Ovumalbumin, einem relevanten Antigen, herausfordern. Doch um sie intradermal am Rücken injizieren zu können, muss ich sie zuerst rasieren. Dazu verwende ich einen einfachen elektrischen Rasierer. Ja, ich wechsle die Nadeln zwischen den einzelnen Ratten, um sicherzustellen, dass die Nadeln nicht stumpf sind.

Es erleichtert die intradermale Injektion, besonders wenn ich kleine Volumina von jeweils 20 Mikrolitern jedes Antigens injiziere. Ich habe daher meine beiden Antigene allen Ratten verabreicht und werde sie nun bis morgen in ihren Käfigen belassen. Morgen werden wir eine Entzündungsreaktion beobachten können.

Die Injektionsstelle wird also gerötet und geschwollen sein, und wir werden den Durchmesser der Entzündungsstelle als Maß für die Entzündung messen können. Gestern habe ich die Ratten intradermal am Rücken mit einem relevanten Antigen, KLH, und einem irrelevanten Antigen, Albumin, herausgefordert. Nun, 24 Stunden später, werde ich die Ratten untersuchen und prüfen, ob eine Entzündung vorliegt.

Ich erwarte daher Entzündungen nur an der KLH-Stelle, und Entzündungen zeigen sich als Rötung und Schwellung. Sobald ich eine Entzündung festgestellt habe, werde ich den entzündeten Bereich messen, indem ich einfach den Durchmesser der betroffenen Stelle bestimme. Hier handelt es sich also um die injizierte KLH-Stelle, und Sie können problemlos erkennen, dass eine starke Entzündung vorliegt.

Es ist im Vergleich zu normaler Haut sehr rot und geschwollen. Wenn wir uns nun die andere Stelle ansehen, die Albumin erhalten hat, können Sie die Injektionsstelle genau hier erkennen, aber es besteht keine nennenswerte Rötung oder Schwellung. Der negative Kontrollversuch war somit erfolgreich.

Jetzt werde ich die Entzündungsstelle vermessen. Dazu verwende ich ein gewöhnliches Lineal und messe in Millimetern. Dieses Maß beträgt sechs Millimeter, und ich nehme eine zweite Messung vor.

Dies wiegt fünf Millimeter. Es gibt kaum Rötungen, ich werde eine Messung vornehmen, aber es ist kaum ein Millimeter. Das, was ich Ihnen hier gezeigt habe, ist die Vorbereitung einer Emulsion mit einem Antigen, die Immunisierung von Ratten mit dieser Emulsion sowie die erneute Herausforderung eine Woche später mit dem für die Immunisierung verwendeten Antigen und auch mit einem relevanten Antigen, sowie die Visualisierung und Messung des Entzündungsgrads im verwendeten und im Chan-Labor.

Wir verwenden diese Technik ziemlich routinemäßig als einfachen Test, um die Wirkung von Kaliumkanalblockern auf die Entzündung bei Ratten zu messen.