Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zu zerlegen, zu transfizieren via Elektroporation und Kultur Maus Hippocampus und kortikalen Neuronen. Kurzfristige Kulturen können für die Untersuchung der Axon Auswuchs und Beratung verwendet werden, während die langfristigen Kulturen für ein Studium der Synaptogenese und dendritischen Dorn Analyse verwendet werden können.

Hippocampus- und kortikale Neuronen wurden ausgiebig verwendet, um die neuronale Polarisation des Zentralnervensystems, das Wachstum von Axondendriten sowie die Bildung und Funktion von Synapsen zu untersuchen, und der Vorteil der Kultivierung dieser Neuronen besteht darin, dass sie leicht polarisieren und charakteristische Axone und Dendriten auf einem zweidimensionalen Substrat bei sehr geringen Dichten bilden. Dieses Video demonstriert eine Technik zum Präparieren von Kultur und Transfizieren, embryonalen, Hippocampus- und kortikalen Neuronen der Maus über Nukleoaffektion, die die Expression von fluoreszenzmarkierten Fusionsproteinen in einem frühen Entwicklungsstadium etwa vier bis acht Stunden nach der Beschichtung ermöglicht. Die Expression der fluoreszenzmarkierten Proteine wird während der gesamten Lebensdauer des Neurons in Kultur für mehr als zwei Monate aufrechterhalten. Dies ermöglicht die Untersuchung der Proteinfunktion während früher Entwicklungsereignisse wie dem Axonwachstum und späteren Ereignissen wie Synaptogenese und synaptischer Plastizität.

Erste Gliazellen werden aus kortikalen Hemisphären der Postnatalität isoliert. Tag eins bis drei Maus knallt und wird in Flaschen plattiert. Nach Erreichen einer Fließfähigkeit von 70 bis 100 % Co werden die Gliazellen dann wieder auf Glasabdeckgläsern plattiert.

Dann werden hippokampale oder kortikale Neuronen aus E 15,5-Mäusen isoliert und über Nukleoaffektion mit Plasmiden transfiziert, die für fluoreszierende Fusionsproteine wie das rot fluoreszierende Protein kodieren. Die transfizierten Neuronen werden dann in bildgebenden Kammern für Kurzzeitstudien plattiert. Für Langzeitkulturen werden Gliazellen auf Glasdeckgläsern über hippokampalen oder kortikalen Kulturen invertiert. Um trophische Unterstützung zu bieten, können dann einzelne Neuronen abgebildet werden, um die dynamische Lokalisierung von Fusionsproteinen in Axonen oder Dendriten von Neuronen zu zeigen.

Hallo, ich bin Eric Dent, Assistenzprofessor für Anatomie an der University of Wisconsin Madison. Heute werden drei meiner Studenten, Chris Wezelman, Jason Bwe und Derek Lombard, ein Verfahren zur Isolierung und Erhaltung von Kulturen von kortikalen und hippokampalen Neuronen für die kurz- und langfristige Kultur demonstrieren. Diese Kulturen können verwendet werden, um die Dynamik fluoreszierender Fusionsproteine während der gesamten neuronalen Entwicklung zu untersuchen, vom anfänglichen Neuritenwachstum über die Axon- und Dendritenentwicklung bis hin zur Synaptogenese.

Zur Vorbereitung der Kammern für die Bildgebung von embryonalen, mausförmigen, hippokampalen und kortikalen Neuronen. Beginnen Sie mit 35-Millimeter-Petrischalen mit 15-Millimeter-Löchern, die in den Boden gebohrt und alle Grate entfernt wurden. Schmilzt eine Paraffin-Vaseline-Mischung von drei zu eins in einem konischen Rohr, indem sie in ein kochendes Wasserbad gelegt wird.

Beschichten Sie dann mit einem kleinen Pinsel die Unterseite der Schale um das Loch herum. Achten Sie darauf, die Paraffin-Vaseline-Mischung zwischen den Kammern zu rühren, da sie sich dann trennt. Legen Sie den Deckglas über das Loch.

Wenn alle Gerichte zubereitet sind, stellen Sie sie in einen 80 Grad heißen Ofen, bis die Paraffinmischung geschmolzen ist. Dies sollte etwa 10 Minuten dauern. Dann das Geschirr auf eine ebene Fläche nehmen und die Paraffinmasse mindestens eine Minute lang fest werden lassen.

Drehen Sie das Geschirr um und stellen Sie es unter eine Haube. Schalten Sie das UV-Licht 30 Minuten lang ein, um sowohl die Innenseiten der Abdeckungen als auch die Böden der Kammern zu sterilisieren. Nächste Schicht.

Der Kammerdeckel wird eine Stunde lang mit Poly-D-Lycin besprüht. Spülen Sie dann die beschichteten Deckgläser drei- bis fünfmal gründlich mit sterilem Filterwasser aus, um alle Spuren von Bohrungspuffer zu entfernen. Nach der letzten Spülung trocknen Sie die Kammern mit einem Vakuum. Diese können sofort verwendet oder für später in einem Gewebekulturraum aufbewahrt werden. Gebrauchen.

Beschichtete Kammern sollten innerhalb einer Woche nach der Zubereitung verwendet werden, wenn Langzeitkulturen hergestellt werden. Die kortikalen Glia-Feeder-Schichten müssen zwei bis drei Wochen begonnen werden, bevor mit den kortikalen oder hippokampalen Dissektionen fortgefahren wird. Legen Sie die Gehirne von vier P eins bis P drei Mäuseknallen in eine Schale mit kaltem Seziermedium und legen Sie sie unter das Präparierfernrohr.

Entfernen Sie die Riechkolben, die beiden Gehirnhälften und die Hirnhäute. Übertragen Sie die Halbkugeln in eine neue Schale, die kein Medium enthält. Mit einer sauberen, sterilen Rasierklinge die Kortika so fein wie möglich zerkleinern.

Übertragen Sie dann das gehackte Gewebe mit einer Plastikpipette in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 12 Millilitern Kaltdissektion. Mittel. Fügen Sie Trypsin und DNA zu Endkonzentrationen von 0,25 % bzw. 0,1 % hinzu. Inkubieren Sie 10 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad mit intermittierendem Schwenken.

Nehmen Sie nach der Inkubation den Schlauch aus dem Wasserbad und reinigen Sie ihn gründlich mit 70% Ethanol, bevor Sie ihn in das Gewebe einbringen. Kulturhaube. Pipettieren Sie das kortikale Gewebe auf und ab.

Mit einer 10-Milliliter-Pipette etwa 10 bis 15 Mal oder bis die meisten Brocken verschwunden sind, bringen Sie das Röhrchen für weitere 10 Minuten unter intermittierendem Schwenken in das Wasserbad zurück. Reinigen Sie die Tube erneut gründlich mit 70%igem Ethanol und bringen Sie sie zurück zum Taschentuch. Kulturhaube.

Pipettieren Sie das kortikale Gewebe auf und ab. Wie zuvor mit einer Fünf-Milliliter-Pipette 15 Milliliter warmes Glia, Medium hinzufügen und 10 Minuten bei 1000 U/min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 20 Millilitern frischem Gliamedium.

Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. Dann werden fünf bis 7,5 Millionen Zellen in 15 Milliliter Gliamedium pro 75 Zentimeter quadratischem Kolben plattiert. Legen Sie die Zellen nach einem Tag und alle zwei bis drei folgenden Kulturtage in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator und entfernen Sie alle losen Zellen, indem Sie den Kolben gegen die Oberfläche der Haube schlagen.

Entfernen Sie das Medium zusammen mit allen abgelösten Zellen und ersetzen Sie es durch 15 Milliliter frisches Glia. Mittlere Gliazellen können nach ein bis zwei Wochen Wachstum in den Kolben geerntet werden, wenn sie etwa zu 100 % zusammenfließen. Um einzelne Deckgläser herzustellen, die mit Glia beschichtet sind, legen Sie zunächst sechs Salpetersäure-gereinigte und sterilisierte Salpetersäure ein.

25 Millimeter runde Deckblätter in eine 10 Zentimeter große Schale schieben und mit einem kleinen Pinsel drei Punkte der drei zu eins Mischung aus Paraffinvaseline platzieren. Auf jedes Deckglas in einem dreieckigen Muster. Platzieren Sie zwei Punkte an den Rändern des Eindeckglases, um es an der Schale zu verankern.

Behandeln Sie offene Speisen 30 Minuten lang mit UV-Licht. Die Deckgläser eine Stunde lang mit Poly-D-Lysin bestreichen. Waschen Sie dann drei- bis fünfmal ausgiebig mit sterilem Filterwasser und lassen Sie die Gliazellen aus dem Inkubator trocknen.

Medien entsorgen und mit fünf Millilitern vorwarmem Trypsin waschen. Geben Sie drei Milliliter Trypsin in den Kolben und inkubieren Sie eine Minute lang bei 37 Grad Celsius. Sobald die Zellen abgelöst sind, füge fünf Milliliter Gliamedium hinzu, um die Auslösung zu stoppen.

Nehmen Sie das GL aus dem Kolben, indem Sie es 10 bis 15 Mal auf und ab pipettieren. Anschließend wird das Medium acht Minuten lang in eine konische 15-Milliliter-Röhrchenzentrifuge bei 1000 U/min überführt. Nach der Zentrifugation reus werden die Zellen in 10 Millilitern Gliamedium suspendiert.

Dann, nach dem Zählen der Zellenplatte, fünfmal 10 bis zu den fünften Zellen in 12,5 Milliliter Gliamedium pro 10-Zentimeter-Schale, die die Deckschicht enthält, einschieben. Tauschen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage am Tag vor der Neuronendissektion durch frisches, vorwarmes Gliamedium aus. Entfernen Sie das Gliamedium und ersetzen Sie es durch serumfreies Medium.

Verwenden Sie dieses serumfreie Medium für Gliaerkrankungen später. Bei der Überflutung, kortikalen oder hippokampalen Kulturen wird ein C zu einer Endkonzentration von fünf Mikromolaren hinzugefügt. Um eine gliale Proliferation der Reagenzien für die Nukleoschädigung pro Transfektion zu verhindern, wie in den Anweisungen des Herstellers angegeben, erwärmen Sie die Lösung auf Raumtemperatur.

Eine Schale mit E 15,5 Mäusegehirnen in kaltes Präpariermedium stellen. Verwenden Sie unter dem Präpariermikroskop eine gebogene Wolframnadel, um beide Neokortike zu entfernen. Entfernen Sie dann mit einer Mikrozange die Hirnhäute und legen Sie die Kortikale in eine neue Schale mit kaltem Dissektionsmedium.

Der Hippocampus und der Kortex sind entlang der medialen Seite der Gehirnhälfte mit einer kleinen Irisschere sichtbar. Entferne vorsichtig den Hippocampus. Entfernen Sie als Nächstes den restlichen Kortex.

Wiederholen Sie die Sektion an Gehirnen aus dem gesamten Wurf. Legen Sie die Nilpferd-Camp-Kortexe in separate 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen, die mit einem Milliliter Kaltdissektion gefüllt sind. Mittel. Legen Sie die Röhren auf Eis Nachdem Sie alle Kortikale in Nilpferd-Campi präpariert haben.

Geben Sie 110 Mikroliter 2,5%iges Trypsin in die Mikrofuge-Röhrchen, die das Gewebe enthalten, und legen Sie die Röhrchen für 20 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Entfernen Sie mit einer Pipette P 1000 so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Röhrchen. Geben Sie dann einen Milliliter Beschichtungsmedium in jedes Röhrchen und waschen Sie das Gewebe, indem Sie das Mikrofuge-Röhrchen vorsichtig umdrehen.

Wiederholen Sie die Wäsche zweimal Nach der letzten Wäsche fügen Sie einen Milliliter Beschichtungsmedium hinzu. Verwenden Sie eine P 1000 Pipette, um die Stücke 15 Mal zu bewerten. Übertragen Sie dann den Überstand und die Zellen in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit vier Millilitern Beschichtungsmedium, wobei alle verbleibenden Brocken in einem Mikrofurchenröhrchen verbleiben.

Drehen Sie das 15-Milliliter-Röhrchen sieben Minuten lang bei 350 U/min, wobei die Pause nach der Zentrifugation erfolgt, entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 100 Mikroliter vorgemischte Raumtemperatur hinzu. Nucle Affection Solution für jede Transfektionspipette fünfmal auf und ab gehen, um den nächsten Transfer zu mischen. 100 Mikroliter der nuklearen Affektionslösung und der Zellmischung in jedes neue Mikrofuge-Röhrchen, das eine angemessene Menge an DNA enthält, ein bis zwei Mikrogramm DNA pro Transfektion für Langzeitkulturen markieren weniger als 10 % der Neuronen in der Kultur.

Während fünf bis 10 Mikrogramm DNA pro Transfektion zu einer höheren Transfektionseffizienz für die Kultur führen, sollten Sie die Zellsuspension und die DNA-Mischung zu einem Elektroporationstest hinzufügen. Setze dann den Vete in den Elektro ein. Für ZNS-Neuronen der Maus stellen Sie das Nukleoeffektorprogramm auf oh 0 0 5 ein, fügen Sie dem qve 500 Mikroliter des Vorkriegs- und äquilibrierten Plattierungsmediums hinzu und überführen Sie die Zelllösung in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen.

Fügen Sie so viel Beschichtungsmedium hinzu, dass das Volumen jeder Transfektion auf einen Milliliter gebracht wird. Nach dem Zählen der Zellplatte drei- bis fünfmal 10 mal 10 cm zum Quadrat für junge Kulturen, oder fünf bis 10 mal 10 zu den dritten Zellen, Prozent des Quadratmeters für Langzeitkulturen, im Allgemeinen fünfmal 10 bis zur fünften oder einmal 10 bis zur sechsten. Zellen werden pro Transfektion verwendet, um Kurzzeitkulturen herzustellen.

Eine Stunde nach dem Plattieren fluten die 35-Millimeter-Kulturschalen mit zwei Millilitern warmem Kohlendioxid im Gleichgewicht, serumfreies Medium und fluten eser. Die Bildgebungskammern führen zu einem sehr niedrigen Serumgehalt von weniger als 0,5 %Kurzzeitkulturen müssen nicht mit einer Glia-Feeder-Schicht kultiviert werden und müssen nicht gepeelt werden. Um Langzeitkulturen vorzubereiten, fügen Sie einen Milliliter Gliazustand zu dem serumfreien Medium hinzu.

Entfernen Sie ein mit GL überzogenes Deckglas, das drei Punkte Paraffinvaseline enthält, und drehen Sie es über das 15-Millimeter-Loch in der 35er Schale. Fügen Sie dann einen weiteren Milliliter Medium hinzu, um die Langzeitkulturen zu füttern. Ersetzen Sie alle zwei bis drei Tage ein Drittel des freien Serummediums.

Nach fünf bis sieben Tagen in Kultur wird Cytosin Arab IDE oder aee zu einer Endkonzentration von fünf Mikromolaren hinzugefügt, um die Proliferation der Gliazellen zu verhindern. Die folgenden gepaarten Bilder repräsentativer lebender Hippocampus-Neuronen zeigen sowohl ein differentielles Interferenzkontrastbild als auch eine entsprechende Fluoreszenzmikroskopaufnahme. Jede dieser Zellen wurde mit EGFP, Tubulin und DS rot zwei in PA-Vektoren transfiziert.

Während des ersten Stadiums heften sich die Neuronen zunächst an und über einen Zeitraum von etwa einem Tag ragen blattartige la melo podia und fingerartige Filip-Podien um die Peripherie des Zellkörpers heraus. Im zweiten Stadium differenzieren sich die anfänglichen Vorsprünge in mehrere Neuriten, die vom Zellkörper ausgehen und in der Regel etwa 30 bis 50 Mikrometer lang bleiben. Im dritten stochastischen Stadium beginnt sich einer der Neuriten schnell auszudehnen und zum Axon zu werden.

Die anderen Neuriten bleiben kurz und werden als Nebenprozesse bezeichnet. Die meisten hippokampalen und kortikalen Neuronen entwickelten sich im vierten Stadium, das in den nächsten ein bis zwei Wochen stattfindet, in das Stadium drei nach zwei Tagen in Kultur, verdicken sich, verlängern und verzweigen sich, um zu den Dendriten zu werden, die hier grün dargestellt sind. In der Zwischenzeit wird das Axon dünner, während es weiter wächst und sich um zwei bis drei Wochen verzweigt.

In Kultur differenzieren sich Dendriten, indem sie dendritische Stacheln bilden, kleine Ausstülpungen entlang der Dendriten. Neuronen im fünften Stadium variieren in ihrer Form und Größe, aber die meisten sollten diese Reihe von Entwicklungsstadien durchlaufen. Transfizierte Neuronen durchlaufen diese Stadien möglicherweise nicht, wenn die Überexpression von Proteinen die neuronale Entwicklung stört.

Außerdem durchlaufen Neuronen möglicherweise nicht alle Entwicklungsstadien. Werden die Deckgläser nicht richtig gereinigt oder haftet das Polylysin nicht richtig, können sich Gliazellen auch großflächig vermehren, vor allem wenn kein C verwendet wird. Dies ist ein Phasenkontrastbild einer zwei Wochen alten Kultur, in der die Gliazellen die Kultur in den Langzeitkulturen überwuchert haben.

Ein zu häufiger oder nicht häufiger Wechsel des Mediums kann ebenfalls die Lebensfähigkeit der Neuronen beeinträchtigen. Dies ist ein Phasenkontrastbild einer Kultur, in der die meisten Neuronen abgestorben sind und die restlichen Neuronen geschrumpfte Zellkörper und Perlenfortsätze aufweisen Zum Vergleich ist dies ein Phasenkontrastbild von gesunden Hippocampus-Neuronen nach zwei Wochen in Kultur. Beachten Sie die größeren Zellkörper und das Fehlen von Schlägen in den Prozessen.

Außerdem haben sich in diesem Stadium die dendritischen Prozesse verdickt und es gibt ein umfangreiches Filigran von axonalen Fortsätzen. Sobald die Embryonal-, Kortikal- und Dissektion, Transfektion und Plattierung des gesamten Wurfs von Föten in zwei Stunden durchgeführt werden können, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Hippocampus- und kortikale Neuronen sehr empfindlich auf mechanische Störungen reagieren.

Außerdem ist es wichtig, Lösungen während der Isolierung von Neuronen so kalt wie möglich zu halten, um die Stoffwechselaktivität gering zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Bildgebung von lebenden Zellen und die physiologische Aufzeichnung der Aktivität durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie sich fluoreszierende Fusionsproteine von Interesse in verschiedene Regionen des Neurons aufteilen. Ob die Proteinlokalisierung mit Veränderungen der synaptischen Aktivität verbunden ist oder wie die Funktionen dieser Proteine durch verschiedene pharmakologische Behandlungen beeinflusst werden.