Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hirnareale und kortikale Neuronen wurden umfassend genutzt, um die Polarisation des zentralen Nervensystems, das Auswachsen von Axonen und Dendriten sowie die Bildung und Funktion von Synapsen zu untersuchen. Ein Vorteil bei der Kultivierung dieser Neuronen liegt darin, dass sie sich leicht polarisieren und auf einem zweidimensionalen Substrat bei sehr geringer Dichte deutlich unterscheidbare Axone und Dendriten ausbilden. Dieses Video demonstriert eine Methode zur Dissektion, Kultivierung und Transfektion embryonaler, muriner hippocampaler und kortikaler Neuronen mittels Nukleofektion, die es ermöglicht, fluoreszenzmarkierte Fusionsproteine früh in der Entwicklung – etwa vier bis acht Stunden nach dem Ansäen – zu exprimieren. Die Expression der fluoreszenzmarkierten Proteine bleibt während der gesamten Lebensdauer des Neurons über zwei Monate in Kultur erhalten. Dies ermöglicht die Untersuchung der Proteinfunktion während früher Entwicklungsereignisse wie dem Axonwachstum sowie späterer Prozesse wie der Synaptogenese und synaptischen Plastizität.

Zunächst werden Gliazellen aus den kortikalen Hemisphären postnataler Mäuse vom ersten bis dritten Lebenstag isoliert und in Flaschen ausgesät. Nach Erreichen einer Konfluenz von 70 bis 100 % werden die Gliazellen anschließend auf Glasdeckgläser umgesät.

Dann werden hippokampale oder kortikale Neuronen von E 15,5-Mäusen isoliert und mittels Nukleofektion mit Plasmiden transfiziert, die fluoreszierende Fusionsproteine wie rotes fluoreszierendes Protein kodieren. Die transfizierten Neuronen werden anschließend in Imaging-Kammern für Kurzzeitstudien ausgesät. Für Langzeitkulturen werden Gliazellen auf Deckgläsern über hippokampale oder kortikale Kulturen invertiert, um trophische Unterstützung zu gewährleisten. Anschließend können einzelne Neuronen abgebildet werden, um die dynamische Lokalisation der Fusionsproteine entlang der Axone oder Dendriten der Neuronen darzustellen.

Hallo, ich bin Eric Dent, Assistenzprofessor für Anatomie an der University of Wisconsin Madison. Heute werden drei meiner Studierenden im Bachelorstudium, Chris Wezelman, Jason Bwe und Derek Lombard, eine Methode zur Isolierung, Ausplattierung und Kultivierung von kortikalen und hippokampalen Neuronen für kurz- und langfristige Kulturen demonstrieren. Diese Kulturen können verwendet werden, um die Dynamik von fluoreszierenden Fusionsproteinen während der gesamten neuronalen Entwicklung – von der initialen Neuritauswucherung über die Entwicklung von Axonen und Dendriten bis hin zur Synaptogenese – zu untersuchen.

Um die Kammer für die Bildgebung vorzubereiten, beginnen Sie mit embryonalen, hippocampalen und kortikalen Neuronen der Maus. Verwenden Sie 35-Millimeter-Petri-Schalen mit 15-Millimeter-Bohrungen im Boden, wobei sämtliche Grate entfernt wurden. Schmelzen Sie ein drei zu eins-Verhältnis aus Paraffin und Vaseline in einem konischen Röhrchen, indem Sie es in ein siedendes Wasserbad stellen.

Verwenden Sie dann einen kleinen Pinsel, um die Unterseite der Petrischale rund um das Loch zu beschichten. Achten Sie darauf, die Paraffin-Paraffinöl-Mischung zwischen den Kammern umzurühren, da sie sich absetzen kann. Legen Sie die Deckglasplatte über das Loch.

Nachdem alle Schalen vorbereitet wurden, stellen Sie sie in einen Ofen mit 80 Grad Celsius, bis die Paraffinmischung geschmolzen ist. Dies sollte etwa 10 Minuten dauern. Anschließend die Schalen herausnehmen und auf eine ebene Fläche stellen und die Paraffinmischung mindestens eine Minute lang erstarren lassen.

Drehen Sie die Schalen um und stellen Sie sie unter eine Haube. Schalten Sie das UV-Licht für 30 Minuten ein, um sowohl die Innenseiten der Deckel als auch die Unterseiten der Kammern zu sterilisieren. Als Nächstes Beschichtung.

Die Kammer-Deckgläser werden eine Stunde lang mit Poly-D-Lysin beschichtet. Anschließend die beschichteten Deckgläser drei bis fünfmal gründlich mit steriler, filtrierter, deionisierter Wasser spülen, um alle Rückstände des Borspülpuffers zu entfernen. Nach dem letzten Spülschritt die Kammern unter Vakuum trocknen. Diese können sofort verwendet oder später in einem Zellkulturrum gelagert werden.

Beschichtete Kammern sollten innerhalb einer Woche nach der Herstellung verwendet werden, wenn Langzeitkulturen angelegt werden. Kortikale gliale Füttererschichten müssen zwei bis drei Wochen vor Fortsetzung der kortikalen oder hippokampalen Dissektionen begonnen werden. Legen Sie die Gehirne von vier P eins bis P drei Mauswürfen in eine Schale mit kaltem Dissektionsmedium und stellen Sie diese unter das Stereomikroskop.

Entfernen Sie die Riechkugeln, die beiden Großhirnhemisphären und die Hirnhäute. Überführen Sie die Hemisphären in eine neue Schale, die kein Medium enthält. Zerkleinern Sie mit einem sauberen, sterilen Rasiermesser die Kortizes so fein wie möglich.

Überführen Sie dann das zerkleinerte Gewebe mit einer Plastikpipette in ein 50-Milliliter-Konischglas, das 12 Milliliter kaltes Dissektionsmedium enthält. Geben Sie Trypsin und DNAse hinzu, um Endkonzentrationen von 0,25 % bzw. 0,1 % zu erreichen. Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad unter gelegentlichem Schwenken.

Nach der Inkubation das Reagenzglas aus dem Wasserbad nehmen und es gründlich mit 70 % Ethanol reinigen, bevor es in die Gewebekulturhaube gebracht wird. Das kortikale Gewebe mehrmals auf- und abpipettieren.

Mit einer 10-Milliliter-Pipette etwa 10 bis 15 Mal oder bis die meisten Brocken verschwunden sind, kehren Sie das Gefäß für weitere 10 Minuten in das Wasserbad mit gelegentlichem Schwenken zurück. Reinigen Sie das Gefäß erneut gründlich mit 70 % Ethanol und bringen Sie es zurück in den Gewebekulturhaube.

Pipettieren Sie das kortikale Gewebe mehrmals auf und ab. Geben Sie erneut 15 Milliliter warmes Glia-Medium mit einer 5-Milliliter-Pipette hinzu und zentrifugieren Sie bei 1000 U/min für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 20 Milliliter frischem Glia-Medium.

Verwenden Sie ein Hämocytometer, um die Zellen zu zählen. Säen Sie dann fünf bis 7,5 Millionen Zellen in 15 Milliliter Glialmedium pro 75 Quadratzentimeter-Flasche aus. Stellen Sie die Zellen am Tag danach und alle zwei bis drei folgenden Tage in Kultur in den 37 °C-Brutschrank und lösen Sie lose Zellen ab, indem Sie die Flasche gegen die Oberfläche des Sicherheitswerksbank schlagen.

Entfernen Sie das Medium zusammen mit eventuell gelösten Zellen und ersetzen Sie es durch 15 Milliliter frisches Glia-Medium. Gliazellen können nach ein bis zweiwöchigem Wachstum in den Kolben geerntet werden, wenn sie etwa 100 % konfluent sind. Um einzelne Deckgläser mit Glia zu beschichten, beginnen Sie damit, sechs mit Salpetersäure gereinigte und sterilisierte Deckgläser zu platzieren.

25 mm runde Deckgläser in eine 10 cm Schale geben und mit einem kleinen Pinsel drei Tropfen der dreifach-zu-einfach-Mischung aus Paraffin und Vaseline in einem dreieckigen Muster auf jedes Deckglas auftragen. Zwei Tropfen an den Rändern des Deckglases platzieren, um es an der Schale zu befestigen.

Behandeln Sie offene Schalen 30 Minuten lang mit UV-Licht. Beschichten Sie die Deckgläser eine Stunde lang mit Poly-D-Lysin. Anschließend waschen Sie sie mehrfach drei bis fünfmal mit steriler, filtrierter, deionisierter Wasser und lassen Sie trocknen. Entfernen Sie die glialen Zellen aus dem Inkubator.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie mit fünf Millilitern präwarmer Trypsin-Lösung. Geben Sie drei Milliliter Trypsin zum Kolben hinzu und inkubieren Sie eine Minute bei 37 Grad Celsius. Sobald sich die Zellen gelöst haben, geben Sie fünf Milliliter Gliomedium hinzu, um die Trypsinwirkung zu stoppen.

Entfernen Sie die GL aus dem Kolben, indem Sie sie 10 bis 15 Mal auf- und abpipettieren. Anschließend überführen Sie das Medium in ein 15-Milliliter-Konizglas und zentrifugieren es acht Minuten lang bei 1000 U/min. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter Glialmedium.

Danach die Zellen zählen und fünf mal zehn hoch fünf Zellen in 12,5 Milliliter Glialmedium pro 10-Zentimeter-Dish mit Deckgläsern ansäen. Das Medium alle zwei bis drei Tage wechseln, am Tag vor der Neuronendissektion frisches, vorgewärmtes Glialmedium zugeben. Das Glialmedium entfernen und durch serumfreies Medium ersetzen.

Verwenden Sie dieses gliale Konditionierungsmilieu später serumfrei. Beim Überfluten von kortikalen oder hippokampalen Kulturen wird ein C bis zu einer Endkonzentration von fünf Mikromolar zugegeben. Um die Proliferation glialer Zellen zu verhindern, fügen Sie die Nukleofektionsreagenzien pro Transfektion gemäß den Herstelleranweisungen hinzu und erwärmen Sie die Lösung anschließend auf Raumtemperatur.

Legen Sie eine Schale mit E-15,5-Mausgehirnen in kaltem Dissektionsmedium. Entfernen Sie unter dem Dissektionsmikroskop mit einer gebogenen Wolframeinele beide Neokortizes. Anschließend entfernen Sie mit feinen Pinzetten die Hirnhäute und geben die Kortizes in eine neue Schale mit kaltem Dissektionsmedium.

Das Hippocampus und der Cortex sind an der medialen Seite des Großhirnhemisphäre mit kleinen Iris-Scheren sichtbar. Entfernen Sie vorsichtig das Hippocampus. Entfernen Sie anschließend den verbleibenden Cortex.

Wiederholen Sie die Dissektion an Gehirnen aus dem gesamten Wurf. Geben Sie die Hippocampus-Kortizes in separate 1,5-mL-Mikroröhrchen, die mit je einem Milliliter kaltem Dissektionsmedium gefüllt sind. Stellen Sie die Röhrchen auf Eis, nachdem alle Kortizes aus den Hippocampi disseziert wurden.

Fügen Sie 110 Mikroliter 2,5 %iger Trypsinlösung in die Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Gewebe hinzu und stellen Sie die Röhrchen 20 Minuten lang in einen 37 °C warmen Inkubator. Entfernen Sie mithilfe einer P-1000-Pipette so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Röhrchen. Geben Sie dann je ein Milliliter Plattenmedium in jedes Röhrchen und waschen Sie das Gewebe, indem Sie das Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig umstülpen.

Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. Nach dem letzten Waschen geben Sie ein Milliliter Plattierungsmedium hinzu. Pipettieren Sie die Gewebestücke 15-mal mit einer P-1000-Pipette um. Überführen Sie dann den Überstand und die Zellen in ein neues kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen, das vier Milliliter Plattierungsmedium enthält, und lassen Sie verbleibende Gewebestücke im Mikrozentrifugenröhrchen zurück.

Zentrifugieren Sie das 15-Milliliter-Röhrchen bei 350 U/min für sieben Minuten ohne Bremsung; danach verwerfen Sie den Überstand und geben 100 Mikroliter vorgemischte, bei Raumtemperatur gehaltene Nucle-Affektionslösung pro Transfektion hinzu. Pipettieren Sie fünfmal auf und ab, um die Lösung zu mischen. Übertragen Sie anschließend 100 Mikroliter der Nucle-Affektionslösung-Zellmischung in jedes neue Mikrozentrifugenröhrchen, das eine geeignete Menge DNA enthält – ein bis zwei Mikrogramm DNA pro Transfektion. Bei Langzeitkulturen werden weniger als 10 % der Neuronen in der Kultur markiert.

Obwohl fünf bis zehn Mikrogramm DNA pro Transfektion eine höhere Transfektionseffizienz für die Kultur bewirken, fügen Sie die Zellsuspension und die DNA-Mischung einem Elektroporationsvete hinzu. Dann platzieren Sie das Vete in den Electro. Für Maus-CNS-Neuronen stellen Sie das Nukleo-Effektor-Programm auf oh 0 0 5 ein; arbeiten Sie schnell, geben Sie 500 Mikroliter des vorgewärmten und equilibrierten Plattiermediums zum Qve hinzu und überführen Sie die Zelllösung in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen.

Geben Sie ausreichend Plattenmedium hinzu, um das Volumen jeder Transfektion auf ein Milliliter aufzufüllen. Nach der Zellzählung werden für junge Kulturen drei bis fünf mal 10 hoch drei Zellen pro Quadratzentimeter oder für Langzeitkulturen fünf bis zehn mal 10 hoch drei Zellen pro Quadratmeter, im Allgemeinen fünf mal 10 hoch fünf oder ein mal 10 hoch sechs Zellen pro Transfektion, verwendet, um Kurzzeitkulturen anzulegen.

Ein Stunde nach dem Ansäen überschwemmen Sie die 35-Millimeter-Kulturschalen mit zwei Millilitern warmem, mit Kohlendioxid equilibriertem, serumfreiem Medium. Die Abbildungskammern führen zu einem sehr geringen Gehalt an Serum, weniger als 0,5 %. Kurzzeitkulturen müssen nicht mit einer Gliazellschicht kultiviert werden und müssen nicht umgesät werden. Um Langzeitkulturen vorzubereiten, geben Sie ein Milliliter gliales Konditionierungsmedium zum serumfreien Medium hinzu.

Entfernen Sie einen mit GL beschichteten Deckgläsern, der drei Tropfen Paraffin-Petroljelly enthält, und setzen Sie ihn verkehrt herum über das 15 Millimeter große Loch in der 35er Schale. Geben Sie anschließend ein weiteres Milliliter Medium zu, um die Langzeitkulturen zu versorgen. Ersetzen Sie alle zwei bis drei Tage ein Drittel des serumfreien Mediums.

Nach fünf bis sieben Tagen in Kultur wird Cytosin-Arabinosid (Ara C) in einer Endkonzentration von fünf Mikromolar hinzugefügt, um die Proliferation von Gliazellen zu verhindern. Die folgenden Paare von repräsentativen lebenden hippocampalen Neuronen zeigen jeweils ein Bild im Differential-Interferenz-Kontrast und das entsprechende fluoreszierende Mikrofoto. Jede dieser Zellen wurde mit EGFP, Tubulin und DS Red zwei in PA-Vektoren transfiziert.

In Phase eins heften sich die Neuronen zunächst an und bilden innerhalb eines Tages blattartige Lamellipodien sowie fingerartige Filopodien am Zellkörperumfang aus. In Phase zwei differenzieren sich die anfänglichen Ausstülpungen in mehrere vom Zellkörper ausgehende Neuriten, die gewöhnlich etwa 30 bis 50 Mikrometer Länge beibehalten. In Phase drei beginnt stochastisch einer der Neuriten, sich rasch zu verlängern und wird dadurch zum Axon.

Die übrigen Neuriten bleiben kurz und werden als minor Prozesse bezeichnet. Die meisten hippocampalen und kortikalen Neurone erreichten innerhalb von zwei bis drei Tagen in Kultur das Stadium drei. Während Stadium vier, das sich über die nächsten ein bis zwei Wochen erstreckt, verdicken sich die minor Prozesse, verlängern sich und verzweigen sich, um zu Dendriten zu werden; diese sind hier grün dargestellt. Inzwischen verjüngt sich das Axon, während es weiterwächst und sich verzweigt, innerhalb von zwei bis drei Wochen.

In der Kultur differenzieren sich Dendriten durch die Bildung von dendritischen Dornen, kleinen Ausstülpungen entlang der Dendriten. Neurone im Stadium fünf variieren in ihrer Form und Größe, aber die meisten sollten diese Reihe von Entwicklungsstadien durchlaufen. Transfizierte Neurone durchlaufen diese Stadien möglicherweise nicht, wenn die Überexpression von Proteinen die neuronale Entwicklung stört.

Außerdem können Neuronen möglicherweise nicht alle Entwicklungsstadien durchlaufen. Wenn die Deckgläser nicht ordnungsgemäß gereinigt werden oder das Polylysin nicht richtig haftet, können Gliazellen ebenfalls stark proliferieren, insbesondere wenn kein C verwendet wird. Dies ist ein Phasenkontrastbild einer zwei Wochen alten Kultur, bei der die Gliazellen die Kultur in Langzeitkulturen überwuchert haben.

Ein zu häufiger oder zu seltener Mediumwechsel kann ebenfalls die Lebensfähigkeit der Neuronen beeinträchtigen. Dies ist ein Phasenkontrastbild einer Kultur, bei der die Mehrheit der Neuronen abgestorben ist und die verbliebenen Neuronen verkleinerte Zellkörper sowie gekörnte Fortsätze aufweisen. Zum Vergleich: Dies ist ein Phasenkontrastbild gesunder hippokampaler Neuronen nach zwei Wochen in Kultur. Beachten Sie die größeren Zellkörper und das Fehlen von gekörnten Fortsätzen.

Außerdem haben die dendritischen Fortsätze an dieser Stelle an Dicke zugenommen, und es ist ein ausgedehntes Netzwerk aus axonalen Fortsätzen sichtbar. Sobald die Technik beherrscht ist, können die Isolierung, Transfektion und Aufzucht des gesamten Wurfes von Feten aus embryonalem Kortex innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden, sofern alles korrekt durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass hippocampale und kortikale Neuronen äußerst empfindlich gegenüber mechanischen Störungen sind.

Außerdem ist es wichtig, die Lösungen während der Isolierung der Neuronen so kalt wie möglich zu halten, um die metabolische Aktivität gering zu halten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Live-Cell-Imaging und die physiologische Aufzeichnung der Aktivität durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie fluoreszierende Fusionsproteine des Interesses sich auf verschiedene Bereiche des Neurons verteilen. Ob die Proteinsortierung mit Veränderungen in der synaptischen Aktivität assoziiert ist, oder wie die Funktionen dieser Proteine durch unterschiedliche pharmakologische Behandlungen beeinflusst werden.