Name: Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:50:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Lernen Sie die Nucleofektion und Primärkultur embryonaler Maus-Hippocampus- und kortikaler Neuronen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Axonwachstum, Synaptogenese und dendritischen Spines.

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Alle Verfahren wurden von der University of Wisconsin Ausschuss für Animal Care genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien. Wir danken Dr. Katherine Kalil für die großzügige Verwendung von ihr Nucleofector Gerät. Wir danken auch Mitglieder der Dent Labor für Kommentare zu Protokoll. Diese Arbeit wurde durch Stipendien NIH R01-NS064014, Dana Foundation und Whitehall Stiftung EWD unterstützt Christopher Viesselmann, Jason Ballweg und Derek Lumbard trugen gleichermaßen zu dieser Veröffentlichung.

1. Vorbereitung der Deckgläser und Chambers <ol><li> Vorbereitung von sauberen Deckgläschen und Kammern ist wichtig für gesunde Kulturen. Shortcuts sollten nicht auf jeder dieser Schritte unternommen werden. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser (12mm oder 22mm rund, deutsche Glas - Carolina Assistant Brand) über Nacht in konzentrierter Salpetersäure (HNO3) in einem speziellen Glas oder Becher. </li><li> Deckgläser abnehmen Salpetersäure und wäscht intensiv (5-7x) in destilliertem Wasser. </li><li> Trennen Sie die Deckgläser und trocken in einer Sterilbank oder Biosicherheitswerkbank. Nach dem Trocknen, Sterilisieren sie mit UV-Licht für 30 Minuten. Ort sterilisiert Deckgläschen in eine sterile Petrischalen für die Lagerung. Wenn plating Neuronen auf 12mm Deckgläser direkt Platz Deckgläser in einer sterilen 35-mm-Schale und fahren Sie mit Abschnitt 2. </li><li> Imaging Kammern sind durch Bohren eines 15mm-Loch in der Unterseite 35mm Petrischalen (entfernen Sie alle Grate) und Anbringen der gereinigten Deckgläser mit einem 3:1-Gemisch aus Paraffin und Vaseline gebaut. </li><li> Melt das Paraffin / Vaseline-Gemisch in einem konischen Rohr in einem siedenden Wasserbad. Mit einem kleinen Pinsel und Beschichtung der Unterseite der Schale um die 15mm Loch. Achten Sie darauf, immer schön rühren das Paraffin / Vaseline-Gemisch, wie es getrennt werden. Dies führt in der Regel Kammern zusammen mit einer höheren Konzentration von Vaseline, die viskosen werden wird, wenn Gerichte in den Inkubator gelegt, was in Deckglas Ablösung geklebt. Die restlichen Paraffin / Vaseline kann bei Raumtemperatur gelagert werden. </li><li> Die Schale nach oben auf eine flache Schale und legen Sie das Deckglas über dem Loch. Hitze in 80 ° C im Ofen, bis Paraffin-Gemisch geschmolzen ist (~ 10 Minuten). Entfernen Sie Speisen auf eine ebene Fläche und lassen Sie die Paraffin-Gemisch eingestellt. </li><li> Schalten Sie das Geschirr über und sterilisieren sowohl die Innenseiten der Deckel und die Böden der Kammern mit UV-Licht. </li><li> Coat Deckgläser oder Glas Regionen Kammern mit 1.0mg/mL Poly-D-Lysin (30-kDa) in Boratpuffer (0,1 M Natrium-Borat, pH 8,5) für eine Stunde. Spülen Sie 3-5 mal mit reichlich Gewebekultur grade deionisiertem Wasser. Vergewissern Sie sich, um alle Spuren von Borat-Puffer zu entfernen. Trockene und sofort verwenden oder lagern Kammern / Deckgläser für die spätere Verwendung. Wir verwenden normalerweise gereinigt Deckgläser innerhalb von einem Monat der Vorbereitung. </li></ol> 2. Vorbereitung der Neuronale Dissection und Kulturmedium <ol><li> Bereiten Sie die Dissektion (DM) durch Zugabe entsprechender Mengen von 10x HBSS und 100X HEPES auf Gewebekultur-Wasser. Lagerung bei 4 ° C. Keep on ice während der Präparation. </li><li> Am Tag vor der Dissektion Vorbereitung der Beschichtung Medium (PM) und Serum-freiem Medium (SFM). PM besteht aus Neurobasalmedium, B27 ergänzen, 2 mM Glutamin, 0,3% Glucose, 37,5 mM NaCl und 5% fötales Rinderserum (FBS). SFM besteht aus Neurobasalmedium, B27 ergänzen, 2 mM Glutamin, 0,3% Glucose und 37,5 mM NaCl. </li><li> Machen Sie nur so viel für die Zerlegung und Speicherung in einer Gewebekultur-Inkubator über Nacht mit der Kappe leicht geöffnet, so dass die Temperatur und CO 2-Gehalt des Mediums im Gleichgewicht. Wir fügen zusätzliche Glukose und erhöhen die Osmolalität auf rund 310mOsm mit NaCl. Wir finden die Kulturen besser zu einem mehr physiologischen Osmolalität (Neurobasal Osmolalität ist in der Regel 205-245mOsm). </li></ol> 3. Kortikale Glial Feeder-Layer Vorbereitung für Langzeit-Kulturen <ol><li> Wenn langfristig Kulturen hergestellt werden sollen, führen Sie diesen Teil des Protokolls zwei vor drei Wochen vor Fortsetzung der kortikalen oder Hippocampus Dissektionen. </li><li> Bereiten Gliazellen Medium (GM) mit MEM, 0,3% Glucose, Penicillin / Streptomycin und 10% Pferdeserum. </li><li> Euthanize P1-P3 Maus Welpen durch Kühlung auf Eis für 5 Minuten. Nehmen Sie jedes Jungtier aus dem Eis und Spray mit 70% Ethanol. Schnell köpfen mit einer Schere. Entfernen Sie das gesamte Gehirn eine Schüssel mit kaltem DM (Schritt 2,1). </li><li> Entfernen Sie die beiden Gehirnhälften und der Hirnhäute. Excise des Neokortex und zu entfernen, um ein neues Gericht, die keine Medien. Bereiten Kortex von 4 Gehirne insgesamt. </li><li> Mince den Kortex mit einem sauberen, sterilen Rasierklinge so fein wie möglich und entfernen gehackte Gewebe mit einer Kunststoff-Pipette auf eine 50 ml konische Röhrchen mit 12 ml kaltem DM. Add Trypsin und DNase, um Endkonzentrationen von 0,25% (1,5 ml) und 0,1% (1,5 ml) bzw.. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten mit intermittierendem Schwenken. </li><li> Entfernen Sie das Röhrchen mit dem kortikalen Gewebe und gründlich reinigen mit 70% Ethanol vor Inbetriebnahme der Gewebekultur Kapuze. Pipet kortikalen Gewebe nach oben und unten mit einer 10 ml Pipette ca. 10-15 mal, oder bis die meisten Stücke verschwinden. </li><li> Senden Sie das Rohr auf 37 ° C im Wasserbad für weitere 10 Minuten mit intermittierendem Schwenken. </li><li> Reinigen Sie das Rohr mit 70% Ethanol und bringen sie zurück in die Gewebekultur Kapuze. Pipettieren der kortikalen Gewebe nach oben und unten mit einem 5 mL Pipette ca. 10-15 mal, oder bis zum Brocken verschwinden. </li><li> 15 ml warmes GM und Zentrifuge bei 200xg (1000rpm) für 10 Minuten. </li><li> Überstand resuspendieren die pelletierten Zellen in 20 ml frisches GM und zählen mit einer Zählkammer. Platte 5-7.5x10 6 Zellen in 15 ml GM pro 75 cm 2-Kolben. </li><li> Nach einem Tag und alle 2-3 aufeinander folgenden Tagen in Kultur, zu vertreiben lose Zellen durch Klopfen der Flasche gegen die Hand. Entfernen Sie das Medium zusammen mit allen verdrängt Zellen und ersetzen mit 15 ml frischem GM. </li><li> Glia kann nach 1-2 Wochen des Wachstums in den Kolben geerntet werden, wenn sie ca. 70-100% konfluent sind. Zur Vorbereitung einzelner Deckgläser mit Glia beschichtet, gereinigt Platz 6 Salpetersäure und sterilisiert 25mm runden Deckgläschen in einer 10 cm Schüssel, und Platz 3 Punkte des 3:1-Gemisch aus Paraffin / Vaseline auf jedes Deckglas in einem dreieckigen Muster mit einem kleinen Pinsel . Gönnen offene Küche mit UV-Licht für 30 Minuten. Bestreichen Sie die Deckgläser mit 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin (30-kDa) in Borat-Puffer für eine Stunde, dann ausgiebig waschen (3-5x) mit steriler Gewebekultur grade VE-Wasser und trocknen lassen. </li><li> Entfernen Sie die Glia-haltigen Flasche aus Inkubator, entsorgen Sie die Medium und spülen mit 5 ml vorgewärmten Trypsin / EDTA-Lösung. Entfernen Sie das Trypsin / EDTA-Lösung aus dem Kolben und Pipette 3 ml frisches vorgewärmtes Trypsin / EDTA in die Flasche. Inkubieren Sie die Flasche für 1 Minute bei 37 ° C vor Zugabe von 5 ml GM die Trypsinierung stoppen. </li><li> Entfernen Sie die Glia von Kolben durch wiederholtes Pipettieren 10-15 Mal, und übertragen Sie dann die Medien zu einer 15 mL konischen Rohr. Zentrifuge bei 200xg (1000rpm) für 8 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und 10 ml GM, Zählen von Zellen, und die Platte 5x10 5 Zellen in 12,5 ml GM pro 10cm Schüssel mit dem Deckgläschen. </li><li> Austausch des Mediums mit frischem vorgewärmten GM alle 2-3 Tage. Am Tag vor dem Neuron Dissektion, entfernen Sie die GM und ersetzen mit SFM (Abschnitt 2.2). Mit dieser Gliazellen klimatisierten SFM in Schritt 4.12 Bei Überschwemmungen kortikalen oder Hippocampus Kulturen. </li></ol> 4. Kortikale und / oder Hippocampus Dissection und Elektroporation <ol><li> Entfernen entsprechender Mengen Nukleofektion Lösungen (Lonza), kombinieren und auf Raumtemperatur erwärmt, bevor das Sezieren. Da Nucleofection Lösung hat eine begrenzte Lebensdauer, wenn kombiniert, wir nur kombinieren die benötigte Menge für jedes Präparat (100 ul pro Transfektion). </li><li> Euthanize eine schwangere Maus E15.5 mit CO 2 (Tag der Stecker E0.5) und entfernen die Gebärmutter auf eine 10cm Petrischale. Entfernen Föten und zu enthaupten ins kalte DM (Abschnitt 2.1). </li><li> Entfernen Sie das gesamte Gehirn in eine separate Schüssel kaltes DM und mit einem gebogenen Wolframnadel, entfernen Sie beide neocortices. Entfernen Sie die Hirnhäute mit microforceps und Ort Kortex in neue Schüssel kaltes DM. Mit einer kleinen Blende oder Wecker Schere, entfernen Sie die Rinde oder Hippocampus und in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 1,0 ml kaltem DM gefüllt. Bewahren Sie diese Röhrchen auf Eis. </li><li> Nach seziert alle Rinden oder hippocampi, fügen Sie 110 ul 2,5% Trypsin, die Eppendorf-Röhrchen mit dem Gewebe und Ort Rohr in einem 37 ° C Inkubator für 20 Minuten. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und wäscht Kortex oder hippocampi mit 1,0 mL PM (Abschnitt 2.2) durch vorsichtiges Umdrehen des Eppendorf-Röhrchen. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal, so dass 1 ml PM in die Röhre. </li><li> Man reibt die Stücke 15 Mal mit einem P1000 Pipette, und entfernen Sie überstehende / Zellen zu einem neuen 15 ml konische Röhrchen mit 4 ml PM, so dass keine Klumpen, die bleiben in Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Drehen Sie die 15 ml Tube bei 20xg (350rpm) für 7 Minuten mit der Bremse ausgeschaltet. Überstand verwerfen und 100 ul der vorgemischten, Raumtemperatur Nukleofektion Lösung (Lonza) für jede Transfektion. Man reibt 5 mal mit einem sanften Auf-und Abbewegung des P1000 Pipette. </li><li> Nehmen Sie 100 ul der Nukleofektion Lösung / Zellgemisch auf jede neue Eppendorf-Röhrchen und fügen Sie die entsprechende Menge an DNA. Für die langfristige Kulturen, die wir verwenden in der Regel 1-2μg DNA pro Transfektion. Dies ist jedoch nur eine kleine Etiketten &lt;10% Anteil der Neuronen in der Kultur. Wir verwenden in der Regel 5-10 ug DNA pro Transfektion, wenn höhere Transfektionseffizienz für kurzfristige Kultur wollen. Wir haben bis zu einem Gesamtbetrag von 40μg DNA verwendet werden, wenn die Transfektion mit zwei verschiedenen Plasmiden. Plasmide sind in TE-Puffer bei 1 g / ul gespeichert. </li><li> Add Zellsuspension / DNA in die Küvette (Lonza) und elektroporieren die Zellen in der Nucleofector (Lonza), mit dem Programm O-005 (Maus ZNS-Neuronen). </li><li> Arbeiten schnell, 500 ul vorgewärmtes und äquilibriert PM in die Küvette und entfernen Lösung / Zellen in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Fügen Sie genug PM, um die Lautstärke der einzelnen Transfektion bis 1,0 mL zu bringen. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer und Platte bei 3-5x10 3 Zellen / cm 2 für junge Kulturen, oder 5-10x10 3 Zellen / cm 2 für die langfristige Kulturen. &lt;/ Li&gt; </li><li> Für kurzfristige Kulturen, Überschwemmung des 35-mm-Kulturschalen mit 2,0 ml erwärmt, CO 2-Gleichgewicht SFM nach einer Stunde Beschichtung. Bei Verwendung von Deckgläsern, wir die Hälfte entfernen des PM und ersetzen sie durch SFM, dann noch zweimal wiederholen. Entweder Überflutung der Imaging-Kammern oder Waschen der Deckgläschen führt zu einer sehr niedrigen Serum-Gehalt (&lt;0,5%). Kurzfristige Kulturen brauchen nicht mit einer glialen Feeder-Schicht kultiviert werden und müssen nicht wieder zugeführt werden. </li><li> Für die langfristige Kulturen, entfernen wir eine Glia gedeckt Deckglas mit drei Punkten aus Paraffin / Vaseline und invertieren sie über das 15mm Loch in die Schale 35mm, 1 Stunde nach der ersten Beschichtung. Zwei Milliliter der konditionierten SFM aus der Glia-Schüssel wird dann auf den Imaging-Kammer aufgenommen. Zur Speisung der langfristigen Kulturen, entfernen wir ein Drittel des SFM alle 2-3 Tage und ersetzen sie durch frische, vorgewärmte und CO 2-Gleichgewicht SFM. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Wohnen Hippocampus-Neuronen in aufeinanderfolgenden Stadien der Entwicklung. Gepaart Bilder von repräsentativen Wohn Hippocampus-Neuronen sind nicht nur als ein Differential-Interferenz-Kontrast Bild und eine entsprechende Fluoreszenzaufnahme gezeigt. Jede dieser Zellen hat mit EGFP-Tubulin und DsRed2 in pCAX Vektoren transfiziert wurden. Stufe 1 (1cm), Stufe 2 (1cm), Stufe 3 (2DIV), Stage 4 (11DIV) und Stufe 5 (32DIV): Die Neuronen wurden in den folgenden Tagen in vitro (DIV) abgebildet. Scale-Bar ist 20 um.

<ol><li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Goslin, K., Banker, G. , The MIT Press. 339-370 (1998).</li>
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</ol>

Dieses Protokoll zur Kultivierung von embryonalen hippokampalen und kortikalen Neuronen der Maus wurde als eine Modifikation der Banker-Protokoll, das Rattenneuronen 1,2 verwendet entwickelt. Wir haben dieses Protokoll zur Kultivierung von Maus und Hamster Neuronen verwendet sowie 3,4,5,6,7. Dieses Protokoll funktioniert genauso gut für beide Hippocampus und Neokortex Neuronen und ist vergleichbar mit einem Protokoll, das von Meberg und Miller 8 veröffentlicht. Generell verwenden wir Hippocampus-Neuronen für die langfristige Kultur, weil sie gut charakterisiert sind und ein etabliertes Modell-System. Darüber hinaus sind sie wahrscheinlich zu einer homogenen Population von Neuronen als Neocortex enthalten. Allerdings kultivierten Neuronen Neokortex mit diesem Protokoll auch überleben und differenzieren ähnlich (unveröffentlichte Daten). Wir verwenden routinemäßig Hippocampus und Neokortex Neuronen für kurzfristige Kultur. Präparation des Neokortex führt auch zu wesentlich mehr Neuronen (1.5x10 6 Neuronen pro Paar Kortex) als Hippocampus Dissektion (2.5x10 5 Neuronen pro Paar hippocampi), das es eine bessere Auswahl des Materials für Western-Blot, zum Beispiel macht. Wie bei allen primären Kultur, ist es wichtig, die Zeit, die vom Tod des Tieres, um die Plattierung der Zellen zu minimieren. Es dauert in der Regel 10-20 Dissektionen zu werden konstant schnell zu Dissektion und Beschichtung. Auch beim Arbeiten mit der Lonza Nucleofector, ist es wichtig, schnell zu arbeiten während der Elektroporation Verfahren, wie die Lebensfähigkeit der Nervenzellen schnell abnimmt, wenn sie in der Nukleofektion Puffer übrig sind. Ein Großteil unserer Bildgebung ist mit einem inneren Reflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) durchgeführt. Diese Art der Mikroskopie ist nur in der Lage Bildgebung mehreren hundert Nanometern über dem Deckglas. Daher werden die Bereiche der Neuronen, die wir häufig image, müssen die axonale Wachstum Kegel und dendritischen Dornen, direkt an das Deckglas eingehalten werden. So verwenden wir low density Kulturen, die Gliazellen Fütterung benötigen für die langfristige Kultur. Wir haben eine höhere Dichte Kulturen eingesetzt (&gt; 2x10 4 Zellen / cm 2), ohne Gliazellen Feeder Schichten, für die langfristige Kulturen und festgestellt, dass sie sehr gut überleben mit wenig füttern. Allerdings sind die dendritischen Dornen dieser Neurone oft zu weit weg vom Substrat zum Bild in TIRFM, obwohl sie leicht mit Weitwinkel-Mikroskopie oder der konfokalen Mikroskopie nachgewiesen werden. In den meisten unserer Studien haben wir transfizieren Neuronen vor dem Ausplattieren und abgebildet fluoreszenzmarkierten Proteine ​​für bis zu drei Monate in Kultur. Diese langfristige Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen gibt uns die Zuversicht, dass durch niedrige Konzentrationen von DNA (1-2μg) sind wir nicht produzieren Überexpression Artefakte in den Neuronen. Allerdings kann dieses Verfahren auch zur Überexpression von Proteinen untersucht werden, ob große Mengen von DNA verwendet werden (10-20mg) werden. Die Plasmide, die wir verwenden, um Neuronen transfizieren enthalten in der Regel EGFP oder mCherry Fusionsproteine, obwohl wir auch Label das neuronale Zytoplasma mit DsRed2 oder EGFP allein. Diese Elektroporation Technik funktioniert gut mit einer Reihe von Vektoren. Wir bevorzugen Plasmide, die eine β-Aktin-Promotor mit einer CMV-Enhancer und β-Globin enthalten poly-A-Schwanz (pCAGGs oder pCAX Plasmide) 9, aufgrund der relativ hohen Niveau des Ausdrucks, und die Tatsache, dass sie gut von den Neuronen geduldet in kurz-und langfristige Kultur. Im Allgemeinen beginnt Proteine ​​innerhalb von ca. 4 Stunden plating auszudrücken und erreichen Werte ausreichend für die Bildgebung in 10-24h 10. Wir haben erfolgreich CMV-Promotor getriebene Plasmide in kurzfristige Kulturen verwendet, haben aber festgestellt, dass sie ein hohes Maß an Überexpression dazu führen, dass zu töten Nervenzellen in langfristige Kultur. Trotzdem haben wir festgestellt, dass die Gliazellen Konditionierung von low density Kulturen mit dem Überleben von Neuronen mit CMV-Promotor angetrieben Plasmiden transfiziert hilft, im Vergleich zu höheren Dichte (non-Glia-fed) Kulturen.

* Die meisten Reagenzien, dass wir bei -80 ° C auf -20 ° C gelagert werden können als gut. Speichern sie bei -80 ° C verlängert sich ihre Haltbarkeit und die Ergebnisse in etwas mehr konsistente Kulturen.

nucleofection und primärkultur von embryonalen maus-hippocampus und kortikalen neuronen

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippokampalen und kortikalen Neuronen wurden ausgiebig auf das zentrale Nervensystem (ZNS) neuronalen Polarisation, Axon / Dendriten Auswuchs, und Synapsenbildung und Funktion Studie verwendet. Ein Vorteil der Kultivierung dieser Neuronen ist, dass sie leicht zu polarisieren, bilden markante Axonen und Dendriten, auf einer zweidimensionalen Substrat bei sehr geringen Dichten. Diese Eigenschaft hat sie extrem nützlich für die Bestimmung viele Aspekte der neuronalen Entwicklung. Darüber hinaus, indem sie Gliazellen Klimaanlage für diese Neuronen werden sie weiter zu entwickeln, bilden funktionelle synaptische Verbindungen und Überleben für einige Monate in Kultur. In diesem Protokoll skizzieren wir eine Technik zu sezieren, Kultur und Transfektion von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen. Die Transfektion wird durch Elektroporation von DNA in die Neuronen vor dem Ausplattieren über Nukleofektion erreicht. Dieses Protokoll hat den Vorteil, auszudrücken Fluoreszenz-markierten Fusionsproteine ​​früh in der Entwicklung (~ 4-8h nach dem Ausplattieren), um die Dynamik und Funktion von Proteinen während der Polarisation, Axon Auswuchs und Verzweigung zu studieren. Wir haben auch entdeckt, dass diese einzelne Transfektion vor dem Ausplattieren Fluoreszenz-markierten Fusionsproteins Ausdruck unterhält auf einem Niveau angemessen für die Bildgebung während der gesamten Lebensdauer des Neurons (&gt; 2 Monate in Kultur). Somit ist diese Methode zur Untersuchung von Protein-Lokalisation und Funktion im gesamten ZNS-Entwicklung mit wenig oder gar keine Störung der neuronalen Funktion.

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zu zerlegen, zu transfizieren via Elektroporation und Kultur Maus Hippocampus und kortikalen Neuronen. Kurzfristige Kulturen können für die Untersuchung der Axon Auswuchs und Beratung verwendet werden, während die langfristigen Kulturen für ein Studium der Synaptogenese und dendritischen Dorn Analyse verwendet werden können.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampale und kortikale Neuronen wurden ausgiebig verwendet, um die neuronale Polarisation im zentralen Nervensystem (ZNS), das Axon- und Dendritenwachstum sowie ... zu untersuchen.

Hirnareale und kortikale Neuronen wurden umfassend genutzt, um die Polarisation des zentralen Nervensystems, das Auswachsen von Axonen und Dendriten sowie die Bildung und Funktion von Synapsen zu untersuchen. Ein Vorteil bei der Kultivierung dieser Neuronen liegt darin, dass sie sich leicht polarisieren und auf einem zweidimensionalen Substrat bei sehr geringer Dichte deutlich unterscheidbare Axone und Dendriten ausbilden. Dieses Video demonstriert eine Methode zur Dissektion, Kultivierung und Transfektion embryonaler, muriner hippocampaler und kortikaler Neuronen mittels Nukleofektion, die es ermöglicht, fluoreszenzmarkierte Fusionsproteine früh in der Entwicklung – etwa vier bis acht Stunden nach dem Ansäen – zu exprimieren. Die Expression der fluoreszenzmarkierten Proteine bleibt während der gesamten Lebensdauer des Neurons über zwei Monate in Kultur erhalten. Dies ermöglicht die Untersuchung der Proteinfunktion während früher Entwicklungsereignisse wie dem Axonwachstum sowie späterer Prozesse wie der Synaptogenese und synaptischen Plastizität.Zunächst werden Gliazellen aus den kortikalen Hemisphären postnataler Mäuse vom ersten bis dritten Lebenstag isoliert und in Flaschen ausgesät. Nach Erreichen einer Konfluenz von 70 bis 100 % werden die Gliazellen anschließend auf Glasdeckgläser umgesät.Dann werden hippokampale oder kortikale Neuronen von E 15,5-Mäusen isoliert und mittels Nukleofektion mit Plasmiden transfiziert, die fluoreszierende Fusionsproteine wie rotes fluoreszierendes Protein kodieren. Die transfizierten Neuronen werden anschließend in Imaging-Kammern für Kurzzeitstudien ausgesät. Für Langzeitkulturen werden Gliazellen auf Deckgläsern über hippokampale oder kortikale Kulturen invertiert, um trophische Unterstützung zu gewährleisten. Anschließend können einzelne Neuronen abgebildet werden, um die dynamische Lokalisation der Fusionsproteine entlang der Axone oder Dendriten der Neuronen darzustellen.Hallo, ich bin Eric Dent, Assistenzprofessor für Anatomie an der University of Wisconsin Madison. Heute werden drei meiner Studierenden im Bachelorstudium, Chris Wezelman, Jason Bwe und Derek Lombard, eine Methode zur Isolierung, Ausplattierung und Kultivierung von kortikalen und hippokampalen Neuronen für kurz- und langfristige Kulturen demonstrieren. Diese Kulturen können verwendet werden, um die Dynamik von fluoreszierenden Fusionsproteinen während der gesamten neuronalen Entwicklung – von der initialen Neuritauswucherung über die Entwicklung von Axonen und Dendriten bis hin zur Synaptogenese – zu untersuchen.Um die Kammer für die Bildgebung vorzubereiten, beginnen Sie mit embryonalen, hippocampalen und kortikalen Neuronen der Maus. Verwenden Sie 35-Millimeter-Petri-Schalen mit 15-Millimeter-Bohrungen im Boden, wobei sämtliche Grate entfernt wurden. Schmelzen Sie ein drei zu eins-Verhältnis aus Paraffin und Vaseline in einem konischen Röhrchen, indem Sie es in ein siedendes Wasserbad stellen.Verwenden Sie dann einen kleinen Pinsel, um die Unterseite der Petrischale rund um das Loch zu beschichten. Achten Sie darauf, die Paraffin-Paraffinöl-Mischung zwischen den Kammern umzurühren, da sie sich absetzen kann. Legen Sie die Deckglasplatte über das Loch.Nachdem alle Schalen vorbereitet wurden, stellen Sie sie in einen Ofen mit 80 Grad Celsius, bis die Paraffinmischung geschmolzen ist. Dies sollte etwa 10 Minuten dauern. Anschließend die Schalen herausnehmen und auf eine ebene Fläche stellen und die Paraffinmischung mindestens eine Minute lang erstarren lassen.Drehen Sie die Schalen um und stellen Sie sie unter eine Haube. Schalten Sie das UV-Licht für 30 Minuten ein, um sowohl die Innenseiten der Deckel als auch die Unterseiten der Kammern zu sterilisieren. Als Nächstes Beschichtung.Die Kammer-Deckgläser werden eine Stunde lang mit Poly-D-Lysin beschichtet. Anschließend die beschichteten Deckgläser drei bis fünfmal gründlich mit steriler, filtrierter, deionisierter Wasser spülen, um alle Rückstände des Borspülpuffers zu entfernen. Nach dem letzten Spülschritt die Kammern unter Vakuum trocknen. Diese können sofort verwendet oder später in einem Zellkulturrum gelagert werden.Beschichtete Kammern sollten innerhalb einer Woche nach der Herstellung verwendet werden, wenn Langzeitkulturen angelegt werden. Kortikale gliale Füttererschichten müssen zwei bis drei Wochen vor Fortsetzung der kortikalen oder hippokampalen Dissektionen begonnen werden. Legen Sie die Gehirne von vier P eins bis P drei Mauswürfen in eine Schale mit kaltem Dissektionsmedium und stellen Sie diese unter das Stereomikroskop.Entfernen Sie die Riechkugeln, die beiden Großhirnhemisphären und die Hirnhäute. Überführen Sie die Hemisphären in eine neue Schale, die kein Medium enthält. Zerkleinern Sie mit einem sauberen, sterilen Rasiermesser die Kortizes so fein wie möglich.Überführen Sie dann das zerkleinerte Gewebe mit einer Plastikpipette in ein 50-Milliliter-Konischglas, das 12 Milliliter kaltes Dissektionsmedium enthält. Geben Sie Trypsin und DNAse hinzu, um Endkonzentrationen von 0,25 % bzw. 0,1 % zu erreichen. Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad unter gelegentlichem Schwenken.Nach der Inkubation das Reagenzglas aus dem Wasserbad nehmen und es gründlich mit 70 % Ethanol reinigen, bevor es in die Gewebekulturhaube gebracht wird. Das kortikale Gewebe mehrmals auf- und abpipettieren.Mit einer 10-Milliliter-Pipette etwa 10 bis 15 Mal oder bis die meisten Brocken verschwunden sind, kehren Sie das Gefäß für weitere 10 Minuten in das Wasserbad mit gelegentlichem Schwenken zurück. Reinigen Sie das Gefäß erneut gründlich mit 70 % Ethanol und bringen Sie es zurück in den Gewebekulturhaube.Pipettieren Sie das kortikale Gewebe mehrmals auf und ab. Geben Sie erneut 15 Milliliter warmes Glia-Medium mit einer 5-Milliliter-Pipette hinzu und zentrifugieren Sie bei 1000 U/min für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 20 Milliliter frischem Glia-Medium. Verwenden Sie ein H&auml;mocytometer, um die Zellen zu z&auml;hlen. S&auml;en Sie dann f&uuml;nf bis 7,5 Millionen Zellen in 15 Milliliter Glialmedium pro 75 Quadratzentimeter-Flasche aus. Stellen Sie die Zellen am Tag danach und alle zwei bis drei folgenden Tage in Kultur in den 37 &deg;C-Brutschrank und l&ouml;sen Sie lose Zellen ab, indem Sie die Flasche gegen die Oberfl&auml;che des Sicherheitswerksbank schlagen.Entfernen Sie das Medium zusammen mit eventuell gelösten Zellen und ersetzen Sie es durch 15 Milliliter frisches Glia-Medium. Gliazellen können nach ein bis zweiwöchigem Wachstum in den Kolben geerntet werden, wenn sie etwa 100 % konfluent sind. Um einzelne Deckgläser mit Glia zu beschichten, beginnen Sie damit, sechs mit Salpetersäure gereinigte und sterilisierte Deckgläser zu platzieren.25 mm runde Deckgläser in eine 10 cm Schale geben und mit einem kleinen Pinsel drei Tropfen der dreifach-zu-einfach-Mischung aus Paraffin und Vaseline in einem dreieckigen Muster auf jedes Deckglas auftragen. Zwei Tropfen an den Rändern des Deckglases platzieren, um es an der Schale zu befestigen.Behandeln Sie offene Schalen 30 Minuten lang mit UV-Licht. Beschichten Sie die Deckgläser eine Stunde lang mit Poly-D-Lysin. Anschließend waschen Sie sie mehrfach drei bis fünfmal mit steriler, filtrierter, deionisierter Wasser und lassen Sie trocknen. Entfernen Sie die glialen Zellen aus dem Inkubator.Entfernen Sie das Medium und waschen Sie mit fünf Millilitern präwarmer Trypsin-Lösung. Geben Sie drei Milliliter Trypsin zum Kolben hinzu und inkubieren Sie eine Minute bei 37 Grad Celsius. Sobald sich die Zellen gelöst haben, geben Sie fünf Milliliter Gliomedium hinzu, um die Trypsinwirkung zu stoppen.Entfernen Sie die GL aus dem Kolben, indem Sie sie 10 bis 15 Mal auf- und abpipettieren. Anschließend überführen Sie das Medium in ein 15-Milliliter-Konizglas und zentrifugieren es acht Minuten lang bei 1000 U/min. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter Glialmedium.Danach die Zellen zählen und fünf mal zehn hoch fünf Zellen in 12,5 Milliliter Glialmedium pro 10-Zentimeter-Dish mit Deckgläsern ansäen. Das Medium alle zwei bis drei Tage wechseln, am Tag vor der Neuronendissektion frisches, vorgewärmtes Glialmedium zugeben. Das Glialmedium entfernen und durch serumfreies Medium ersetzen.Verwenden Sie dieses gliale Konditionierungsmilieu später serumfrei. Beim Überfluten von kortikalen oder hippokampalen Kulturen wird ein C bis zu einer Endkonzentration von fünf Mikromolar zugegeben. Um die Proliferation glialer Zellen zu verhindern, fügen Sie die Nukleofektionsreagenzien pro Transfektion gemäß den Herstelleranweisungen hinzu und erwärmen Sie die Lösung anschließend auf Raumtemperatur.Legen Sie eine Schale mit E-15,5-Mausgehirnen in kaltem Dissektionsmedium. Entfernen Sie unter dem Dissektionsmikroskop mit einer gebogenen Wolframeinele beide Neokortizes. Anschließend entfernen Sie mit feinen Pinzetten die Hirnhäute und geben die Kortizes in eine neue Schale mit kaltem Dissektionsmedium.Das Hippocampus und der Cortex sind an der medialen Seite des Großhirnhemisphäre mit kleinen Iris-Scheren sichtbar. Entfernen Sie vorsichtig das Hippocampus. Entfernen Sie anschließend den verbleibenden Cortex. Wiederholen Sie die Dissektion an Gehirnen aus dem gesamten Wurf. Geben Sie die Hippocampus-Kortizes in separate 1,5-mL-Mikroröhrchen, die mit je einem Milliliter kaltem Dissektionsmedium gefüllt sind. Stellen Sie die Röhrchen auf Eis, nachdem alle Kortizes aus den Hippocampi disseziert wurden.Fügen Sie 110 Mikroliter 2,5 %iger Trypsinlösung in die Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Gewebe hinzu und stellen Sie die Röhrchen 20 Minuten lang in einen 37 °C warmen Inkubator. Entfernen Sie mithilfe einer P-1000-Pipette so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Röhrchen. Geben Sie dann je ein Milliliter Plattenmedium in jedes Röhrchen und waschen Sie das Gewebe, indem Sie das Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig umstülpen.Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. Nach dem letzten Waschen geben Sie ein Milliliter Plattierungsmedium hinzu. Pipettieren Sie die Gewebestücke 15-mal mit einer P-1000-Pipette um. Überführen Sie dann den Überstand und die Zellen in ein neues kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen, das vier Milliliter Plattierungsmedium enthält, und lassen Sie verbleibende Gewebestücke im Mikrozentrifugenröhrchen zurück.Zentrifugieren Sie das 15-Milliliter-Röhrchen bei 350 U/min für sieben Minuten ohne Bremsung; danach verwerfen Sie den Überstand und geben 100 Mikroliter vorgemischte, bei Raumtemperatur gehaltene Nucle-Affektionslösung pro Transfektion hinzu. Pipettieren Sie fünfmal auf und ab, um die Lösung zu mischen. Übertragen Sie anschließend 100 Mikroliter der Nucle-Affektionslösung-Zellmischung in jedes neue Mikrozentrifugenröhrchen, das eine geeignete Menge DNA enthält – ein bis zwei Mikrogramm DNA pro Transfektion. Bei Langzeitkulturen werden weniger als 10 % der Neuronen in der Kultur markiert.Obwohl fünf bis zehn Mikrogramm DNA pro Transfektion eine höhere Transfektionseffizienz für die Kultur bewirken, fügen Sie die Zellsuspension und die DNA-Mischung einem Elektroporationsvete hinzu. Dann platzieren Sie das Vete in den Electro. Für Maus-CNS-Neuronen stellen Sie das Nukleo-Effektor-Programm auf oh 0 0 5 ein; arbeiten Sie schnell, geben Sie 500 Mikroliter des vorgewärmten und equilibrierten Plattiermediums zum Qve hinzu und überführen Sie die Zelllösung in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen.Geben Sie ausreichend Plattenmedium hinzu, um das Volumen jeder Transfektion auf ein Milliliter aufzufüllen. Nach der Zellzählung werden für junge Kulturen drei bis fünf mal 10 hoch drei Zellen pro Quadratzentimeter oder für Langzeitkulturen fünf bis zehn mal 10 hoch drei Zellen pro Quadratmeter, im Allgemeinen fünf mal 10 hoch fünf oder ein mal 10 hoch sechs Zellen pro Transfektion, verwendet, um Kurzzeitkulturen anzulegen.Ein Stunde nach dem Ansäen überschwemmen Sie die 35-Millimeter-Kulturschalen mit zwei Millilitern warmem, mit Kohlendioxid equilibriertem, serumfreiem Medium. Die Abbildungskammern führen zu einem sehr geringen Gehalt an Serum, weniger als 0,5 %. Kurzzeitkulturen müssen nicht mit einer Gliazellschicht kultiviert werden und müssen nicht umgesät werden. Um Langzeitkulturen vorzubereiten, geben Sie ein Milliliter gliales Konditionierungsmedium zum serumfreien Medium hinzu.Entfernen Sie einen mit GL beschichteten Deckgläsern, der drei Tropfen Paraffin-Petroljelly enthält, und setzen Sie ihn verkehrt herum über das 15 Millimeter große Loch in der 35er Schale. Geben Sie anschließend ein weiteres Milliliter Medium zu, um die Langzeitkulturen zu versorgen. Ersetzen Sie alle zwei bis drei Tage ein Drittel des serumfreien Mediums.Nach fünf bis sieben Tagen in Kultur wird Cytosin-Arabinosid (Ara C) in einer Endkonzentration von fünf Mikromolar hinzugefügt, um die Proliferation von Gliazellen zu verhindern. Die folgenden Paare von repräsentativen lebenden hippocampalen Neuronen zeigen jeweils ein Bild im Differential-Interferenz-Kontrast und das entsprechende fluoreszierende Mikrofoto. Jede dieser Zellen wurde mit EGFP, Tubulin und DS Red zwei in PA-Vektoren transfiziert.In Phase eins heften sich die Neuronen zunächst an und bilden innerhalb eines Tages blattartige Lamellipodien sowie fingerartige Filopodien am Zellkörperumfang aus. In Phase zwei differenzieren sich die anfänglichen Ausstülpungen in mehrere vom Zellkörper ausgehende Neuriten, die gewöhnlich etwa 30 bis 50 Mikrometer Länge beibehalten. In Phase drei beginnt stochastisch einer der Neuriten, sich rasch zu verlängern und wird dadurch zum Axon.Die übrigen Neuriten bleiben kurz und werden als minor Prozesse bezeichnet. Die meisten hippocampalen und kortikalen Neurone erreichten innerhalb von zwei bis drei Tagen in Kultur das Stadium drei. Während Stadium vier, das sich über die nächsten ein bis zwei Wochen erstreckt, verdicken sich die minor Prozesse, verlängern sich und verzweigen sich, um zu Dendriten zu werden; diese sind hier grün dargestellt. Inzwischen verjüngt sich das Axon, während es weiterwächst und sich verzweigt, innerhalb von zwei bis drei Wochen. In der Kultur differenzieren sich Dendriten durch die Bildung von dendritischen Dornen, kleinen Ausstülpungen entlang der Dendriten. Neurone im Stadium fünf variieren in ihrer Form und Größe, aber die meisten sollten diese Reihe von Entwicklungsstadien durchlaufen. Transfizierte Neurone durchlaufen diese Stadien möglicherweise nicht, wenn die Überexpression von Proteinen die neuronale Entwicklung stört.Außerdem können Neuronen möglicherweise nicht alle Entwicklungsstadien durchlaufen. Wenn die Deckgläser nicht ordnungsgemäß gereinigt werden oder das Polylysin nicht richtig haftet, können Gliazellen ebenfalls stark proliferieren, insbesondere wenn kein C verwendet wird. Dies ist ein Phasenkontrastbild einer zwei Wochen alten Kultur, bei der die Gliazellen die Kultur in Langzeitkulturen überwuchert haben.Ein zu häufiger oder zu seltener Mediumwechsel kann ebenfalls die Lebensfähigkeit der Neuronen beeinträchtigen. Dies ist ein Phasenkontrastbild einer Kultur, bei der die Mehrheit der Neuronen abgestorben ist und die verbliebenen Neuronen verkleinerte Zellkörper sowie gekörnte Fortsätze aufweisen. Zum Vergleich: Dies ist ein Phasenkontrastbild gesunder hippokampaler Neuronen nach zwei Wochen in Kultur. Beachten Sie die größeren Zellkörper und das Fehlen von gekörnten Fortsätzen.Außerdem haben die dendritischen Fortsätze an dieser Stelle an Dicke zugenommen, und es ist ein ausgedehntes Netzwerk aus axonalen Fortsätzen sichtbar. Sobald die Technik beherrscht ist, können die Isolierung, Transfektion und Aufzucht des gesamten Wurfes von Feten aus embryonalem Kortex innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden, sofern alles korrekt durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass hippocampale und kortikale Neuronen äußerst empfindlich gegenüber mechanischen Störungen sind.Außerdem ist es wichtig, die Lösungen während der Isolierung der Neuronen so kalt wie möglich zu halten, um die metabolische Aktivität gering zu halten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Live-Cell-Imaging und die physiologische Aufzeichnung der Aktivität durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie fluoreszierende Fusionsproteine des Interesses sich auf verschiedene Bereiche des Neurons verteilen. Ob die Proteinsortierung mit Veränderungen in der synaptischen Aktivität assoziiert ist, oder wie die Funktionen dieser Proteine durch unterschiedliche pharmakologische Behandlungen beeinflusst werden.

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Forschung

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