Name: Mikrodissektion von Black Widow Spider Silk-produzierenden Drüsen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:59:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Lernen Sie die Mikrodissektion von Seidendrüsen bei Schwarzen Witwen für molekularbiologische Studien. Diese Methode ermöglicht die effiziente Isolierung von sieben verschiedenen Drüsentypen.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium NSF RUI MCB-0950372 mit dem Titel Molekulare Charakterisierung von Black Widow Spinnenseidenproteinen unterstützt.

1. Betäubende die Spinne und die Isolierung des Bauches <ol><li> Übertragen Sie die Spinne aus einem Glas in einem Karton mit Kunststoff (Abbildung 1A) ausgekleidet. Wir sammeln in der Regel Spinnen aus Holzstapel, Garagen oder Büsche und Haus sie im Labor in Gläsern. Da die Spinne nicht klettern kann die Kunststoff-Futter, bietet es eine effiziente Methode, um die Spinne aus einem Glas oder Kaffee können Transfer in ein kleineres Gefäß für Anästhesie Zwecke. Beim Umgang mit der Spinne an diesem Punkt, sollten Sie das Tragen von zwei Paar Latex-Handschuhe oder Gartenhandschuhe aus Gründen der Sicherheit. </li><li> Während die Spinne ist in der Box mit Kunststoff ausgekleidet, nähern sich die Spinne von der Rückseite und lassen Sie die Spinne Abgleiten in die Kunststoff-Flasche Kultur. Nach der Spinne in die Flasche, sofort den Stecker over the top (Abbildung 1B). Wir empfehlen die Verwendung eines Fläschchens, dass etwa 101,6 mm x 31,75 mm (L x D) ist. Dies minimiert die Menge an Kohlendioxid für die Betäubung Schritt nötig. </li><li> Anesthetize die Spinne durch die Einführung von Kohlendioxid-Gas bei 5-10 Pfund pro Quadratzoll für 10 min (Abbildung 1C). Diese Gasmenge wird nur klopfen die Spinne für rund 5 min, so dass nach Betäubung müssen Sie sofort Schritte 1,4-1,5 gehen. </li><li> Setzen Sie den narkotisierten Spinne in einen kleinen Dissektion Schüssel und Verwendung einer Pinzette, um die Spinne Rückenseite nach oben (rote Sanduhr nach unten) positionieren. </li><li> Clip der Stiel (schmale Stiel Anschluss des Cephalothorax und das Abdomen), um den Bauch aus dem Rest der Spinne (Abbildung 1D) freizugeben. Bewahren Sie den Cephalothorax in der Tiefkühltruhe über Nacht in einer Petrischale und entsorgen nach gefrorenen am nächsten Tag. Seien Sie vorsichtig beim Bewegen der Cephalothorax wie die Zähne der Spinne präsentieren in diesem Segment sind. </li><li> Befestigen Sie den Bauch, um die Sylgard Material in den kleinen Dissektion Schüssel mit einem einzigen Insekten pin. Legen Sie das Insekt Stift durch das Loch aus dem Blütenstiel Clipping (Abb. 1E) gemacht. Dies kann leicht als der Ort, wo die Flüssigkeit aus dem Clipping des Stiels Schwellenländern identifiziert werden. Sicherstellen, dass die Düse (entgegengesetzten Ende des Stiels) ist nach unten orientiert (am nächsten zu Ihnen). </li></ol> 2. Die Entfernung des Exoskelett <ol><li> Sprechen Sie die erste Schnitt durch das Exoskelett mit einem Paar Mikroschere, beginnend mit dem Loch aus dem Blütenstiel Clipping. Cut seitlich bis zur Dorsalseite auf beiden Seiten (Abb. 1F) erreicht wird. Mit einer Pinzette, Ziehen Sie die vordere Exoskelett Segment und fügen Sie einen zweiten Stift an dieser Stelle. Nach dem Einlegen der zweiten Stift, drehen Sie das Sezieren Tablett kaudal (90 °-Winkel) von der ersten seitlichen Schnitten und weiter schneiden, bis die Düsen erreicht werden (Abbildung 1G). Dieser Schnitt wird senkrecht oder vertikal sein, um die ersten seitlichen Schnitt. Nicht durch die Düsen, wenn der vertikale Schnitt gemacht wird (posterior gegenüber dem Sanduhr und es hat einen kreisförmigen Aussehen) geschnitten. Nichtbeachtung der zweiten Stifteinsatz wird in den Bauch drehen, wenn die vertikale Schnitte durchgeführt werden, führen. </li><li> Tauchen Sie den Bauch in Sezieren Puffer-Lösung (0,1 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat, 0,1% Diethylpyrocarbonat). </li><li> Peel die restlichen Exoskelett wieder ab dem ersten, seitlichen Einschnitt. Wenn dies abgeschlossen ist, sollte das Fettgewebe deutlich sichtbar (Abbildung 1H). </li></ol> 3. Die Isolierung der Seiden-produzierenden Drüsen <ol><li> Mit einer Pinzette beginnen Hänseleien entfernt die Fettschicht (Abbildung 1H). Das Fett hat eine weißliche bis gelbliche Erscheinung. Fahren Sie bis das meiste Fett wird entfernt und die Spinndrüsen sind deutlich sichtbar. Die tubuliform Drüse besteht aus drei Paaren von sehr langen, zylindrischen Röhren, die reichlich in der Bauchhöhle sind. Die großen Ampullendrüse, die paarweise gefunden wird, ist eine große, halbmondförmige Ampulle mit einem langen gewundenen distalen Schwanz und einem proximalen Kanal, der in der Breite abnimmt, wie es der Spinne Spinndüsen Ansätze. Die kleine Ampullendrüse ist sehr ähnlich in Morphologie der großen Ampullendrüse, aber es ist deutlich kleiner. Die flagelliform Drüse, auch auftreten in Paaren, ist rund und multilobular mit einem kleinen zylindrischen Zick-Zack-Kanal, der nach unten erstreckt auf die Spinndüsen. Das Aggregat Drüse (gefunden in Paaren) ist ein sehr großes, multilobular Drüse, die eine sehr große Ausführungsgang, die große, unregelmäßige Lappen hat auf sie hat. Die aciniform Drüsen kommen in großer Zahl und ähneln kurze, kleine fingerlike Projektionen. Die birnenförmig Drüse ist die kleinste Drüse in der Bauchhöhle und hat viele verdichtet, zylindrischen Kanäle, die ein Fan mit vielen kleinen Ausführungsgänge, die bis hinab zu den Spinndüsen ähneln. </li><li> Wir empfehlen, die Drüsen in der folgenden Reihenfolge: tubuliform, großen Ampullendrüse, flagelliform, kleinere Ampullendrüse, aggregieren aciniform, und dann die birnenförmig (Abbildung 2A-B). </li><li> Beginnend mit dem tubuliform, necken diese Drüsen aus der übrigen the Drüsen - sie sollten auf der anderen Drüsen (Abbildung 2A) zu sitzen. Es gibt drei Paare von tubuliform Drüsen in einer einzigen Spinne. Lassen Sie sie zu schweben frei, sondern bleiben an ihren Spinnwarzen durch ihre Leitungen. </li><li> Next, necken sich die großen Ampullendrüse Drüsen. Es gibt zwei große Ampullendrüse Drüsen in einer Spinne. Während das Verfahren zur Entfernung sicher, dass die Leitungen verbunden bleiben die Drüsen (Abbildung 2A). </li><li> Fahren Sie mit dem Rest der Drüsen von einander entfernt zu necken, arbeiten sorgfältig, so dass jeder Punktion der Drüsen, vor allem das Aggregat und flagelliform Drüsen. Jede Drüse sollte frei schwimmenden alle den Weg zu seinem Ausgangspunkt in das Exoskelett der Spinndüsen. Diese Drüsen sind auch paarweise gefunden. Entfernen Sie jede Drüse durch Einklemmen des Kanals mit einer Pinzette und vorsichtiges Ziehen, bis er von der Ausfahrt entfernt Pointbreaks. Die großen Ampullendrüse, flagelliform, kleinere Ampullendrüse und aggregieren Drüsen sind in Paaren gefunden. Die aciniform und birnenförmig Drüsen kommen in vielen mehr Paare. </li><li> Entfernen Sie jede Drüse durch Einklemmen des Kanals mit einer Pinzette und vorsichtiges Ziehen, bis er bricht, die Ausfahrt nach unten durch die Düse. Wir in der Regel speichern die Drüsen nass, aber wir wissen nicht zusätzliche Puffer. </li><li> Da die Drüsen entfernt werden, legen Sie sie in sterile pre-markierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Individuelle Drüsen sind in Abbildung 3A-G gezeigt. Bewahren Sie diese Drüsen auf Eis und dann Flash-frieren sie in flüssigem Stickstoff. Nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff, legen Sie sie bei -80 ° C für die Lagerung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Beim Entfernen der verschiedenen Drüsen, sollten extreme Vorsicht walten beim Umgang mit dem flagelliform und aggregieren Drüsen werden, da diese beiden Strukturen leicht durchstoßen werden können und beschädigt mit der Zange. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass morphologisch die flagelliform und aggregieren Drüsen sehr ähnlich vor ihrer Entfernung betrachten und sie sind oft miteinander verwoben. Um zu verhindern Kreuzkontamination dieser Gewebe bei der Entnahme sollte das Dissektor sorgfältig tease diese Strukturen auseinander. Außerdem auf der ersten Exposition der Seiden-produzierenden Drüsen, die aciniform und birnenförmig Drüsen der schwierigsten sofort visualisieren aufgrund ihrer geringeren Größe und anatomische Lage sein. Oft gibt es die Anwesenheit von vielen Eiern. Darüber hinaus muss zusätzlich darauf geachtet werden, beim Entfernen des birnenförmig Drüse werden, da dieses Gewebe ist extrem klebrig und wird oft zu Ihrem Zange halten. Wenn dieses Verfahren richtig gemacht wird, ist es möglich, alle sieben Seide produzierenden Drüsen von einer einzigen Spinne in hochreiner Form zu erhalten. In der Regel kann man wieder Mikrogramm-Mengen von Gesamt-RNA und Protein aus einer einzigen Spinne Dissektion. Ein Beispiel für die Verwendung der Gesamt-RNA für die qPCR zum mRNA-Spiegel einer tubuliform beschränkt Fibroin Gen, TuSp1 zu untersuchen, wird angezeigt (Abbildung 4). Vertreter Experimente, die an Protein aus den Drüsen Lysaten gesammelt beinhalten z. B. in-Lösung tryptischen Verdauung durch MS-Analyse (könnte auch für MS / MS-Analyse verwendet werden) oder eine Aminosäure-Zusammensetzung Analyse wird angezeigt (Abbildung 5-6, jeweils) gefolgt. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Abbildung 1e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1e"> Abbildung 1. Handling, betäuben, und die Entfernung des Exoskelett aus dem Bauch einer weiblichen Spinne der schwarzen Witwe. A) Transfer von der Spinne in einem Karton mit Kunststoff ausgekleidet, um zu erleichtern bewegt die Spinne in einen kleineren Kunststoff-Fläschchen. B) Spider platziert in eine Kunststoff-Flasche mit Stecker. C) betäuben die Spinne mit Kohlendioxid-Gas. D) Die Trennung der Cephalothorax aus dem Bauch mit Mikroschere. E) Immobilisierung des Bauches in der Anatomie Tablett mit Insekten Pins. F) anzeigen nach einem seitlichen Einschnitt mit der Schere und ein Teil des Exoskelett ist zurück mit einer Pinzette geschält wird. G) Einschnitte senkrecht zur ersten seitlichen Schnitt. H) Die Entfernung der Exoskelett und Exposition der Fettschicht. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Visualisierung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, während intakte in den Bauch der Spinne sowie das umgebende Gewebe. A) Bilder von der tubuliform, großen Ampullendrüse, flagelliform, aggregieren kleinere Ampullendrüse Gewebe mit 12facher Vergrößerung. B) Bild des aciniform und birnenförmig Drüsen mit 12facher Vergrößerung. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Abbildung 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Abbildung 3e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3e"> Abbildung 3. Photographs der sieben Seide produzierenden Drüsen nach ihrer Entnahme aus dem Bauch. Alle Bilder wurden bei 20-facher Vergrößerung mit Ausnahme der aciniform und birnenförmig Drüsen, die bei 40x getan wurden gefangen genommen. A) großenAmpullendrüse; B) Dur-und Moll Ampullendrüse (rechts) zum Größenvergleich; C) tubuliform; D) flagelliform; E)-Aggregat; F) aciniform; G) birnenförmig. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse des Expressionsmusters der Seide Gen, TuSp1 nach Vermessung der TuSp1 mRNA-Spiegel in den verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen (mit Ausnahme der birnenförmig Drüse) mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) nach der Isolierung von Gesamt-RNA aus die Drüsen. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Beispiel von MS-Analyse von Protein-Extrakten aus der birnenförmig Drüse folgenden in-Lösung tryptischen Verdau erhalten. Hinweis: x2 für 2-fache Vergrößerung des Spektrums Intensität. Spectrum Peptid-Ionen-Massen, die Regionen der PySp1 Fibroin entsprechen, sind mit dem Symbol # angezeigt. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Typisches Ergebnis der Aminosäure-Zusammensetzung Profil der Proteine ​​aus dem tubuliform Drüse extrahiert. Hinweis: ASX = Asp und Asn; GLX = Glu und Gln. Blaufärbung zeigt Aminosäuren mit polaren Seitenkette Gruppen während rote Färbung stellt Aminosäurereste mit unpolaren Seitenkette Gruppen.

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</ol>

Unsere Methodik für die Mikrodissektion der Seiden-produzierenden Drüsen aus der schwarzen Witwe bietet ein wirksames Mittel zu hoch gereinigten Seide produzierenden Drüsen zu erhalten. Dissektionen können in 1,5 bis 3 Stunden abgeschlossen sein, was zu einem kompletten Satz der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen aus cobweavers. Beziehen hochgereinigtes Seide-Drüse Proben ermöglicht Forschern die Möglichkeit, ein breites Spektrum an biochemischen Untersuchungen, einschließlich der Identifizierung von neue...

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0420-1</td><td>0,1 M in Wasser</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758 - 5 ml</td><td>0,1 % (v/v)</td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804 - 1 kg</td><td>0,015 M in Wasser</td></tr><tr><td>Präparationsmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Digitale Mikroskopkamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC320</td><td>Software – Leica Application Suite v2.8.1</td></tr><tr><td>Vannas-Schere</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlpinzette</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501764</td><td>Mini Dumont #M5S</td></tr><tr><td>Insektennadeln</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-2</td><td>Insektennadeln #2</td></tr><tr><td>Kleine oder große Präparationschalen</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S oder DD-90-S</td><td>52 mm Durchmesser × 18 mm Höhe (Sylgard-Tiefe ~6 mm) oder 93 mm × 22 mm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;-Kulturgefäße</td><td>Carolina Biological</td><td>FR-17-3076</td><td>Durchmesser 31,75 mm × 101,6 mm</td></tr></tbody></table>

mikrodissektion von black widow spider silk-produzierenden drüsen

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Moderne Spinnen High-Performance-Seidenfasern mit einer breiten Palette von biologischen Funktionen, einschließlich Fortbewegung, Beutefang und zum Schutz der Entwicklung der Nachkommen 1,2. Spiders diese Aufgaben durch Spinnen mehrere verschiedene Fasertypen, dass diverse mechanische Eigenschaften aufweisen. Eine solche Spezialisierung der Fasertypen hat durch die Entwicklung der verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, die als kleine Biofabrik Funktion aufgetreten ist. Diese Biofabrik Herstellung und Lagerung von großen Mengen von Seidenproteinen für Faserproduktion. Durch eine komplexe Reihe von biochemischen Vorgängen, sind diese Seidenproteine ​​von einer Flüssigkeit in einem festen Material nach der Extrusion umgewandelt. Mechanische Untersuchungen haben gezeigt, dass Spinnenseide stärker als hochfestem Stahl 3 sind. Analysen, um die Beziehung zwischen der Struktur und Funktion der Spinnenseide Themen verstehen haben ergeben, dass Spinnenseide zum größten Teil aus Proteinen oder Fibroine, dass Block wiederholt haben im Rahmen ihrer Proteinsequenzen 4 besteht. Gemeinsame molekulare Signaturen, die die unglaubliche Zugfestigkeit und Dehnbarkeit von Spinnenseide beitragen werden durch die Analysen der übersetzten Seide cDNAs entwirrt. Angesichts der außergewöhnlichen Materialeigenschaften von Spinnenseide sind Forschungslabors auf der ganzen Welt Rennen zu verstehen und zu imitieren das Spinnverfahren für synthetische Seidenfasern für kommerzielle, militärische und industrielle Anwendungen. Eine der größten Herausforderungen für die Spinnerei künstliche Spinnenseide im Forschungslabor beinhaltet ein vollständiges Verständnis der biochemischen Prozesse, die während der Extrusion der Fasern von der Seiden-produzierenden Drüsen auftreten. Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von den sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen aus der cobweaving Schwarze Witwe, die die großen und kleinen Ampullendrüse Drüsen enthält [fertigt dragline und Gerüste Seide] 5,6, tubuliform [synthetisiert Eihülle Seide] 7 , 8, flagelliform [unbekannter Funktion in cob-Weber], aggregieren [macht Leim Seide], aciniform [synthetisiert Beute Verpackung und Eihülle Themen] 9 und birnenförmig [produziert Befestigung Disc Seide] 10. Dieser Ansatz basiert auf betäuben die Spinne mit Kohlendioxid-Gas, anschließende Trennung der Cephalothorax aus dem Bauch, und Mikrodissektion des Bauches, die Seiden-produzierenden Drüsen zu erhalten basiert. Nach der Trennung der verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, können diese Gewebe verwendet, um verschiedene Makromoleküle für verschiedene biochemische Analysen, einschließlich der quantitativen real-time PCR, Northern-und Western-Blot analysiert Massenspektrometrie (MS oder MS / MS) zu identifizieren abgerufen werden New Silk Protein-Sequenzen, Suche nach Proteinen, die in die Seide Montage Weg zu beteiligen, oder verwenden Sie das intakte Gewebe für die Zellkultur oder histologische Untersuchungen.

Hier beschreiben wir eine effiziente Strategie, um die Seide produzierenden Drüsen aus dem Bauch der weiblichen Schwarzen Witwen zu entfernen. Dieses Verfahren ermöglicht die schnelle Trennung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen in hochreiner Mode, ein wichtiger Prozess für die Ermittler Studium Spinnenseide Produktion und Faserverbund.

Mikrodissektion von Black Widow Spider Silk-produzierenden Drüsen

Moderne Spinnen spinnen hochleistungsfähige Seidenfasern mit einer breiten Palette biologischer Funktionen, einschließlich Fortbewegung, Beutefang und Schutz von ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die sieben verschiedenen Seiden produzierenden Drüsen aus dem Hinterleib der Spinne zu isolieren und diese Gewebe für molekulare und biochemische Untersuchungen zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Spinne anästhesiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Kopf, Thorax und Hinterleib zu trennen und den Hinterleib mit Insektennadeln in einer kleinen Präparierschale festzustecken.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Einschnitte im Exoskelett vorzunehmen, um die Seiden produzierenden Drüsen freizulegen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Entfernung der verschiedenen seidenproduzierenden Drüsen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass die unterschiedlichen seidenproduzierenden Drüsen spezifische Seiden-mRNAs oder -proteine exprimieren, was durch molekulare und biochemische Methoden wie quantitative Echtzeit-PCR bzw. Massenspektrometrie nachgewiesen werden kann.Diese Methode liefert wichtige Erkenntnisse für die Spinnenbiologieforschung und macht Proteine sichtbar, die in den Seiden produzierenden Drüsen gespeichert sind. Diese Proteine haben Anwendungen in den Bereichen Militär und Medizin sowie zahlreiche kommerzielle und industrielle Anwendungen. Die Idee zu dieser speziellen Studie entstand, als wir mehr über die Proteine erfahren mussten, die in den Seiden produzierenden Drüsen gespeichert sind.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass weibliche Schwarze-Witwe-Spinnen sehr große Abdomen besitzen, wodurch die Isolierung der Seiden produzierenden Drüsen sehr einfach ist. Personen, die neu in dieser Methode sind, können Schwierigkeiten haben, da die Drüsen während der Dissektion oft reißen. Es gibt außerdem bestimmte anatomische Strukturen, die schwer zu isolieren sind.Die visuelle Demonstration ist entscheidend für eine gute Präparation. Die Durchführung des Verfahrens wird von Kobe LaMattina, Tiffany Tootin, Blasingame und Y Shaw vor Beginn der Präparation gezeigt. Bereiten Sie 500 Milliliter Pufferlösung für die Präparation vor, die aus 0,1 molarem Natriumchlorid, 0,015 molarem Natriumcitrat und 0,1 % Ethylbicarbonat besteht.Bereiten Sie dann einen Karton mit Kunststoffauskleidung vor, um die Spinne zu verstauen und daran zu hindern, herauszukrabbeln. Gewöhnlich beschaffen wir schwarze Witwen-Spinnen aus Holzstapeln, Schuppen oder Garagen und verwenden im Labor Glasgefäße zur Unterbringung. Sobald die Spinne beschafft ist, überführen Sie sie unter Handhabung aus einem Glasgefäß in den Karton.Tragen Sie zur Sicherheit zwei Paar Latex- oder Gartenhandschuhe. Nähern Sie sich dann mit einem kleinen Kunststoffkulturgefäß von hinten an die Spinne heran, schieben Sie die Spinne in das Gefäß und verschließen Sie dieses sofort. Leiten Sie fünf bis zehn Minuten lang Kohlendioxidgas mit einem Druck von fünf bis 10 PSI in das Gefäß ein, um die Spinne zu betäuben. Die erste Dissektion des Abdomens von der Cephalothrax sollte innerhalb von fünf Minuten erfolgen, während die Spinne noch unter Narkose steht.Legen Sie die betäubte Spinne in eine kleine Präparierschale. Schneiden Sie den Stiel, den schmalen Fortsatz, der das cephalische Thorax mit dem Hinterleib verbindet, ab, um den Hinterleib zu lösen. Das cephalische Thorax enthält die Giftzähne der Spinne und muss ordnungsgemäß entsorgt werden.Entfernen Sie vorsichtig den cephalischen Thax, der in eine Petrischale gelegt wurde, und frieren Sie ihn über Nacht ein. Bevor Sie ihn entsorgen, lokalisieren Sie die Öffnung im Abdomen der Spinne, die durch das Abschneiden der Pedes-Zelle entstanden ist, indem Sie die Stelle identifizieren, an der Flüssigkeit aus dem Abdomen austritt. Führen Sie mit einer einzelnen Präpariernadel die Nadel durch die Öffnung und in das Abdomen, um das Abdomen am Präparierröhrchen zu befestigen, und positionieren Sie die Spinne so, dass der Sockel am weitesten vom Präparierenden entfernt ist und die Spitze am nächsten zum Präparierenden liegt.Beginnen Sie mit einer Mikroschere an der Öffnung der Pedes-Zelle und schneiden Sie seitlich auf jeder Seite durch das Exoskelett, bis die dorsale Seite erreicht ist. Heben Sie mit einer Pinzette das vordere Exoskelettsegment an und setzen Sie an dieser Stelle eine zweite Nadel ein. Drehen Sie als Nächstes das Präparationsbrett um 90 Grad gegenüber den ursprünglichen seitlichen Schnitten.Fortfahren mit dem Schneiden, bis die Spints erreicht sind. Der Einschnitt verläuft senkrecht oder vertikal zur ursprünglichen lateralen Schnittführung. Die Spints liegen unterhalb der Sanduhr und haben ein kreisförmiges Aussehen. Schneiden Sie beim Anlegen des vertikalen Schnitts nicht durch die Spinten. Tauchen Sie den Hinterleib in die Dissektionspufferlösung ein. Lösen Sie das verbleibende Exoskelett ab, beginnend bei dem ursprünglichen seitlichen Schnitt. Wenn dies abgeschlossen ist, sollte das fettige Gewebe, das weißlich bis gelblich erscheint, mit der Pinzette deutlich sichtbar sein. Beginnen Sie damit, die Fettschicht vorsichtig zu lösen, bis der größte Teil des Fettgewebes entfernt ist und die Seidendrüsen deutlich sichtbar werden. Falls Eier vorhanden sind, sollten diese entfernt werden.Zerlegen Sie die Drüsen nun in der folgenden Reihenfolge: tubuläre Form, große Ate-Flagellen-Form, aggregierte kleine Ate-Assif-Form und anschließend die birnenförmige Form. Jede Drüse wird in der Reihenfolge der Zerlegung beschrieben. Die röhrenförmigen Drüsen liegen oberhalb aller anderen Drüsen und weisen drei Paare sehr langer, zylindrischer Röhren auf, die reichlich in der Bauchhöhle vorhanden sind. Lösen Sie diese Drüsen vorsichtig von den übrigen Drüsen ab. Lassen Sie sie frei schweben, aber weiterhin über ihre Ausführungsgänge mit den Spinnfäden verbunden.Als Nächstes lösen Sie die beiden großen Ampullen-Drüsen, die sich ebenfalls in den Birnen befinden. Diese Drüsen sind groß und halbmondförmig mit langen, gewundenen distalen Ausläufern und proximalen Gängen, die in der Breite abnehmen. Wenn Sie sich den Spinnenbeinen nähern, entfernen Sie die großen Ampullen-Drüsen und geben Sie sie in sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie die Drüsen nach der Entnahme auf Eis. Entfernen Sie anschließend die Geißeln von der Drüse. Die Geißeldrüse ist ebenfalls birnenförmig vorhanden.Es handelt sich um eine mehrlappige Struktur mit einem kleinen, zylindrischen, zickzackförmigen Kanal, der sich nach der Entnahme und Platzierung auf Eis in Richtung der Spints erstreckt. Danach zeigt das kleine Alet eine der Morphologie des großen Alets sehr ähnliche, jedoch deutlich kleinere Gestalt. Die paarig angeordnete Sammel-Drüse ist groß und mehrlappig und weist einen sehr großen Ausscheidungskanal mit großen, unregelmäßigen Lappen auf.Die Sino-Formm-Drüsen treten in großer Zahl auf und ähneln kurzen, kleinen fingerartigen Ausstülpungen. Die piriforme Drüse ist die kleinste Drüse im Abdomen und weist viele dicht gepackte zylindrische Ausführungsgänge auf, die einem Fächer ähneln, mit zahlreichen kleinen Ausscheidungsgängen, die bis zu den Spints reichen. Da nun die tubuläre Formm-Drüse die einzige verbliebene frei schwebende Drüse ist, entfernen Sie sie, indem Sie den Ausführungsgang mit einer Pinzette anfassen und vorsichtig ziehen, bis er sich an der Austrittsstelle am Spint löst. Nach der Dissektion gefrieren Sie alle isolierten Drüsen sofort ein, indem Sie das Reagenzglas in flüssigen Stickstoff tauchen, bis es gefroren ist, und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius zur Aufbewahrung.Alternativ können die Drüsen unmittelbar nach ihrer eigenständigen Entnahme während des Präparationsverfahrens eingefroren werden. Diese Abbildung zeigt die Isolierung des Seidengens, der TUSP-eins-mRNA-Spiegel in den verschiedenen Seiden produzierenden Drüsen – mit Ausnahme der piriformen Drüse – mittels quantitativer Echtzeit-PCR-Analyse nach Isolierung der Gesamt-RNA aus den Drüsen. Die tubulären Drüsen enthalten die höchste Menge an TUSP-eins-mRNA.Diese Abbildung zeigt ein typisches Ergebnis des Aminosäurezusammensetzungsprofils der aus der piriformen Drüse extrahierten Proteine. Die blaue Färbung kennzeichnet Aminosäuren mit polaren Seitenketten, während die rote Färbung Aminosäurereste mit unpolaren Seitenketten darstellt. Diese Abbildung zeigt die Massenspektrometrie-Analyse von Proteinextrakten, die aus der piriformen Drüse nach der Insolution-Triptyche gewonnen wurden.Die Verdauung hier mit Faktor zwei steht für eine zweifache Vergrößerung der Spektrumintensität. Spektrum-Peptid-Ionenmassen, die mit dem Symbol # gekennzeichnet sind, weisen auf Peptide hin, die aus dem Seidenfibroin PYSP1 nach dessen Entwicklung stammen. Diese Technik ebnete den Forschern in der Gemeinschaft der Soak-Biologie den Weg.Es wurde verwendet, um chemische und molekulare Prozesse bei der Herstellung von Spinnenseide, der Assemblierung von Seidenfasern und der Extrusion zu untersuchen. Wenn diese Technik korrekt durchgeführt wird, kann sie in eineinhalb bis drei Stunden abgeschlossen werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, zwei Paar Handschuhe zu tragen, bis die Spinnenbeißwerkzeuge entfernt wurden.Am Ende dieses Verfahrens können die Seiden produzierenden Drüsen verwendet werden, um RNA und Protein zu isolieren. Diese Materialien eignen sich für nachgeschaltete Anwendungen wie die quantitative Echtzeit-PCR sowie die Massenspektrometrie. Die Informationen, die aus diesen Studien gewonnen werden können, werden uns helfen, den Prozess der Seidenassemblierung und den Weg der Seidenextrusion besser zu verstehen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die sieben verschiedenen Seidendrüsen der weiblichen Schwarzen Witwe isoliert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Isolierung lebensfähiger mehrzelliger Drüsen aus Gewebe der fleischfressenden Pflanze Nepenthes

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Extraktion von Gift von Spinnen mit Elektrostimulation, um 1) durchzuführen Proteom Charakterisierung, 2) stimulieren Giftdrüse Genexpression, und 3) durchführen funktionelle Studien von Giften. Dies wird durch eine Beschreibung der Giftdrüse Mikrodissektionen für Genexpressionsstudien gefolgt.

Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen

Ein Protokoll für die mikrofluidischen Spinning und Charakterisierung der Mikrostruktur regenerierten Seide Fibroin Monofilament wird vorgestellt.

Mikrofluidische trocken-Spinnen und Charakterisierung von regenerierten Seide Fibroin Fasern

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung des gesamten, intakte Maus Milchdrüsen um Ausdruck der extrazellulären Matrix (ECM) und duktale Morphologie zu untersuchen. Maus #4 Bauch-Drüsen wurden von ca. 8-10 Wochen alten weiblichen nulliparous Mäusen, in neutral gepuffertem Formalin fixiert, geschnitten und gefärbt mit Immunohistochemistry für ECM Proteine extrahiert.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

Obwohl viele Insekten in der Unterordnung Heteroptera (Insecta: Hemiptera) sind giftig, deren Venom-Zusammensetzung und die Funktionen ihrer Venom-Toxine sind meist unbekannt. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum Heteropteran Gifte für weitere Charakterisierung, mittels Elektrostimulation, Belästigung und Drüse Dissektion zu ernten.

Ernte Venom Giftstoffe aus Assassin Bugs und andere Heteropteran Insekten

Schlunddrüsen Drüse Acinus Größe ist ein robustes Maß der Krankenschwester Honig Biene Ernährung. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum sezieren, Beizen, imaging und Krankenschwester Biene schlunddrüsen Drüse Azini zu messen.

Messung der Schlunddrüsen Drüse Acinus Größe in Honigbiene (Apis Mellifera) Arbeitnehmer

Hier stellen wir ein Protokoll zur Herstellung wasserlöslicher rekombinanter Spinnenseidenproteinlösungen und der aus diesen Lösungen entstandenen Materialformen vor.

Materialbildung von Rekombinanten Spider-Seiden durch wässrige Lösung mit Wärme und Druck

Die ausgewachsene Mückenspeicheldrüse (SG) ist für die Übertragung aller durch Mücken übertragenen Krankheitserreger auf ihre menschlichen Wirte, einschließlich Viren und Parasiten, erforderlich. Dieses Video zeigt die effiziente Isolierung der SGs von den Larven (L4) Anopheles gambiae-Mücken und die Vorbereitung der L4-SGs für die weitere Analyse.

Dissektion und Immunfärbung von Larven-Speicheldrüsen von Anopheles gambiae Mücken

Lernen Sie die Mikrodissektion von Seidendrüsen bei Schwarzen Witwen für molekularbiologische Studien. Diese Methode ermöglicht die effiziente Isolierung von sieben verschiedenen Drüsentypen.

Mikrodissektion von Black Widow Spider Silk-produzierenden Drüsen

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