Name: Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 30 s
Description: Lernen Sie den Aufbau eines Flow-Cell-Systems zur Kultivierung und Analyse mikrobieller Biofilme mit konfokaler Laserscanning-Mikroskopie. Dieses Protokoll demonstriert die korrekte Montage und Dichtung der Zellen.

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1. Versammlung der Flow Cell System mit allen Komponenten Die versammelten Flow-System umfasst: autoklavierbar Schläuche, Blasenfallen, medium / Abfallflasche und Messzellen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Alle diese Teile können zwischen den Experimenten verwendet werden. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Die Durchflusszelle System-Setup (wesentliche Bestandteile des Setup). Die Messzelle besteht aus mehreren Komponenten: ein Medium-Flasche, eine Schlauchpumpe, Blasenfallen, die Messzelle, ein Abfallbehälter und diverse Teile der Schläuche mit verschiedenen Anschlüssen verbunden. Abbildung mit freundlicher Unterstützung von Rune Lyngklip zur Verfügung gestellt. 2. Versammlung der Durchflusszelle <ol><li> Die Messzelle (Abbildung 2a) ist mit dünnen Bahnen von Silikonkleber, mit einer Spritze (Abb. 3) behandelt. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf dem Silikon-Linien (Abbildung 3). Glasdeckgläschen als Substrat für P verwendet aeruginosa, während PVC Deckgläser für S. angewandt werden cerevisiae Biofilm. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Durchflusszelle und Blasenfalle 2. Detaillierte Beschreibung der Dimensionen für die Herstellung von a) Flusszelle b) Blasenfalle, DTU Systems Biology verwendet. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von John Wiley &amp; Sons, Inc. (DTU Systems Biology war früher berechtigt Biocentrum, wie in der Abbildung dargestellt) <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Illustration der Silikonkleber Anwendung Linien für die Befestigung des Glases Substrat. Die angegebenen Deckglas wird über den Silikon-Kleber platziert, um es auf die Messzelle anschließen. <ol start="3"><li> Schalten Sie die Durchflusszelle um und legen es auf eine ebene Fläche mit dem Deckglas nach unten. Drücken Sie vorsichtig auf die Rückseite der Messzelle auf das Deckglas auf der Basis der Flusszelle zu schieben. Schalten Sie die Messzelle über und untersuchen für Bereiche, die nicht durch das Silikon abgedichtet sind. Der Griff (Kolben) Teil einer Spritze kann als Werkzeug eingesetzt werden vorsichtig auf die Glas-und Flow-Zelle zusammen. </li></ol> 3. Medium Bottle <ol><li> Legen Sie eine Fütterung Silikonschlauch (2 mm Innendurchmesser) in einem Medium Flasche und legen Sie einen geraden Stecker am anderen Ende. </li><li> Add Medium, um die Flasche (für mittel-Inhalt finden Sie unter "Medien" Absatz) Cover-Anschluss und eine Flasche mit Metallfolie und Autoklaven des Mediums. Stellen Sie sicher, dass das Ende der Zuführrohr oberhalb des Flüssigkeitsspiegels in dem Medium Flasche oder ein Siphon-Effekt ist fest kann leer Medium Flasche beim Autoklavieren. </li></ol> 4. Anschließen der Blasenfalle, Durchflusszelle und Pump Montieren Sie alle Schläuche nach der Gliederung in Abbildung 1. Verwenden Sie Silikonschlauch mit Ausnahme des Teils, der durch die Schlauchpumpe wo Marprene Schläuchen angewendet geht. <ol><li> Um das Rohr aus dem Medium Flasche auf alle einzelnen Strömungskammern verbinden, teilen einen Schlauch in die erforderliche Anzahl von Eingängen in das Experiment eingesetzt. Verwenden Sie T-Anschlüsse, um die gewünschte Anzahl der Verbindungsschläuche aus dem Einfüllstutzen zu machen, um die Marprene Rohre in der Pumpe (siehe Abbildung 1, T-Stecker). Es ist generell eine gute Idee, um die gleiche Sequenz, um von Rohren und Messzellen im gesamten System zu halten, um die Identifizierung von Komponenten im Falle von Fehlern im System zu erleichtern. </li><li> Schließen Sie jedes einzelne Magensonde (2 mm im Durchmesser) zu Röhrchen in die Pumpe mit geraden Steckern Marprene. Schließen Sie das Marprene Schlauch an einer Blasenfalle (Abb. 2b) über die Zwischenstufe Silikonschlauch (1 mm im Durchmesser). Stellen Sie sicher, dass die Pumpe mit dem Eingang befindet sich am höchsten Teil der Blasenfalle verbunden. </li><li> Schließen Sie die resultierende Auslaufrohr der Blasenfallen der Durchflusszelle Einlass (1 mm im Durchmesser), stellen Sie sicher, dass die Länge dieser Schläuche der Messzelle auf die Bühne des konfokalen Mikroskops (typischerweise 1 m) bewegt werden können. </li><li> Platz 5 ml-Spritzen auf der Oberseite des Blasenfallen. Schließen Sie die Tops mit passenden Kappen. </li><li> Auf der Messzelle Steckdose anschließen einer kurzen, ca. 40 mm Stück (1 mm im Durchmesser), Schläuche und die Nutzung einer "Reduzierung" straight-Anschluss zu einem Abfall Rohr befestigen (2 mm im Durchmesser) der benötigten Länge. Legen Abfall Rohre in den Abfallbehälter. </li><li> Wichtig ist, dass die Abfallbehälter stets auf dem gleichen Niveau wie der Fluss-Zellen gelegt werden, nie unter flow-Zell-Ebene. Stellen Sie außerdem sicher, dass das Ende der Ablaufschlauch über dem erwarteten Niveau von Abfällen Flüssigkeit wird fest mit flush-back zu vermeiden durch einen Siphon-Effekt beim Umgang mit dem Flow-Zellen. </li></ol> 5. STERILISATION und Waschen des FLOW SYSTEM <ol><li> Entfernen Blasenfalle Kappen und legen Sie sie in 70% Ethanol sie steril zu halten. </li><li> Run auf höchstem Pumpendrehzahl, um das System mit 0,5% (v / v) Natriumhypochlorit in Wasser zu füllen. &lt;/ Li&gt; </li><li> Legen Sie die Blasenfalle Kappen wieder auf, wenn die Blasenfallen vollständig ausgefüllt sind. </li><li> Tippen Sie auf den Fluss Zellen zu Blasen in der Strömung Kammer zu entfernen. Achten Sie darauf, die fragile Deckglas Schäden. </li><li> Lassen Sie das System für 3-4 h bei einer Flussrate von 3 ml / h / Kanal (0,2 mm / s linear flow rate) zu sterilisieren. </li><li> Wash System 2-3 mal zu waschen alle Hypochlorit. Füllen und Entleeren der Anlage mit sterilem Wasser. Blasenfallen muss vollständig zwischen jedem Waschen entleert werden. Dies kann durch Einpumpen von Luft bis Blasenfallen geleert worden erfolgen. Nach der Entleerung zu entfernen Kappen von den Blasenfallen vor dem Nachfüllen des Systems. Ersetzen Kappen nach dem Blasenfallen wurden vollständig mit Flüssigkeit gefüllt. Wiederholen Sie je nach Bedarf. </li><li> Run sterilem Wasser durch das System zu einem niedrigen Durchfluss (1-3 ml / h / Kanal) über Nacht oder gehen Sie zum nächsten Schritt. </li><li> Schließen Sie das Medium Flasche mit dem Einlass und spülen Sie das System mit Medium über Nacht bei niedrigen Durchfluss (3 ml / h / Kanal) bei der Temperatur in dem das Experiment durchgeführt werden soll. Hinweis: Blasenfallen müssen für Wasser entleert werden, bevor das System mit Medium gefüllt ist. </li></ol> 6. Impfung des FLOW CELL <ol><li> Von einer Übernacht-Kultur eine Verdünnung auf eine gewünschte optische Dichte (für P. aeruginosa zB 0,001 OD 600nm und 0,1 OD 600nm für S. cerevisiae). </li><li> Verwenden Sie eine 0,5 ml Spritze mit einer 27G Nadel, um genügend Inokulum laden, um die Kammer zu füllen. 250 ul ist ausreichend für die Strömungskammern mit den Abmessungen in dieser Arbeit angegeben (Abbildung 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm). </li><li> Stoppen Sie die Schlauchpumpe. </li><li> Clamp off der Silikonschlauch führt zu der Durchflusszelle zurück zu verhindern fließen in das System. </li><li> Sterilisieren der Impfstelle auf dem Silikonschlauch durch Abwischen mit 70% Ethanol. </li><li> Legen Sie die Nadel in den Silikonschlauch und stellen die Spitze in den Einlass der Durchflusszelle. Spritzen Sie das Inokulum in die Kammer (darauf achten, nicht, um Luftblasen zu injizieren). </li><li> Entfernen Sie die Nadel und wischen Sie die Injektionsstelle mit 70% igem Ethanol durch sofortige Abdichtung der Bohrung mit Silikonkleber auf die Injektionsstelle gefolgt. </li><li> Drehen Sie die Durchflusszelle und lassen Sie sich die Mikroorganismen an der Unterlage haften für 1 Stunde ohne Durchströmung der Durchflusszelle. </li><li> Schalten Sie die Messzelle, starten Sie das Medium Pumpe (3 ml / h / Kanal) und nehmen Sie die Klemme aus dem Silikonschlauch. </li><li> Das System ist für den Brutschrank bei 37 ° C im Fall von P. aeruginosa und 30 ° C im Fall von S. cerevisiae. </li><li> Biofilm in den Fluss Kammern können nun visualisiert werden CLSM. </li></ol> 7. Färbung von BIOFILM Für die Mikroskopie <ol><li> Machen Sie eine Verdünnung der entsprechenden Färbung (z. B. 1:1000 Syto 9 live für S. cerevisiae-Färbung) </li><li> Stoppen Sie die Schlauchpumpe. </li><li> Clamp der Silikonschlauch führt zu der Durchflusszelle. </li><li> Sterilisieren Impfstelle auf der Silikonschlauch durch Abwischen mit 70% Ethanol. </li><li> Verwenden Sie eine 0,5 ml Spritze mit einer 27G Nadel, genug Färbelösung laden, um die Kammer zu füllen. 250 ul ist ausreichend für die Strömungskammern hier verwendeten. </li><li> Legen Sie die Nadel in den Silikonschlauch und stellen die Spitze in den Einlass der Durchflusszelle. Langsam injizieren die Färbelösung in die Kammer (darauf achten, nicht zu Blasen spritzen). </li><li> Entfernen Sie die Nadel und wischen Sie die Injektionsstelle mit 70% igem Ethanol durch sofortige Abdichtung der Injektionsstelle gefolgt. </li><li> Verlassen Sie die Messzelle ohne Strömung für 15 Minuten. </li><li> Nehmen Sie die Klemme und starten Sie den Strom (3 ml / h / Kanal) </li><li> Erfassung von Daten mit dem CLSM </li></ol>

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<li>Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaagensen%2C+JA+%22High+Resolution+Microbial+Single+Cell+Analytics+Advances+in+Biochemical+Engineering+and+Biotechnology%22">High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology</a>. Müller, S., Bley, T. , Springer. (2010).</li>
</ol>

Wir haben eine Durchflusszelle System, das ein mächtiges Werkzeug in Biofilm Untersuchungen stellt unter Beweis gestellt. In Kombination mit 3D-Bildgebung durch konfokale Mikroskopie, hat das System eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu anderen Methoden der Analyse von mikrobiellen Biofilmen mit Hilfe von traditionellen mikroskopischen Techniken. Dieses System ermöglicht 3D-Visualisierung von lebenden mikrobiellen Biofilm Gemeinden ohne Störung der Gemeinschaft. Die Lichtmikroskopie wird keine detaillierten Informationen über Nischen des Biofilms und während der Elektronenmikroskopie bietet nanoskaliger Auflösung des Biofilms, es nicht zulassen, Live Cell Imaging. Mit dem beschriebenen Strömungskanal System, das wir zuvor die räumliche Verteilung der Bakterienzellen empfindlich auf verschiedene Antibiotika 5-8 (Abbildung 4a), die Verteilung der extrazellulären Verbindungen aufgeklärt, wie zB DNA 9-11 und die Verteilung der beweglichen und unbeweglichen Zellen der gleichen Art innerhalb einer bakteriellen Gemeinschaft 4,6,9 (Abbildung 4c). Wir sehen, dass die Messzelle System verwendet werden, um Aspekte der Hefe Biofilme zu untersuchen. Dies kann die räumlich zeitliche Verteilung der Hefe Biofilm als Reaktion auf Umweltfaktoren wie Fungizide sowie die Identifizierung von Genen in Hefe Biofilm Entwicklung einbezogen werden. Obwohl Hefe nicht bekannt ist, in bewegliche und unbewegliche Zellen differenzieren können auch andere Aspekte des Biofilms Diversifizierung Studien wie die morphologische Übergang von der Hefe bis zum pseudohyphal Zellen und die Verlagerung von haploid zu diploiden Zellen werden. Wir haben ein System, das mit mehreren mikrobielle Spezies entsprechen und wird mit mehreren Färbetechniken Arbeit gezeigt. Eine Vielzahl unterschiedlicher Färbung Sonden und fluoreszierende Proteine, wie GFP, ermöglichen es, bestimmte Nische Untersuchungen in den Entwicklungsländern Biofilm und ist ein effizientes Werkzeug für die Analyse der Wirkung von Antibiotika oder anderen Umweltfaktoren. Die Informationen, die gesammelt werden können, ist sehr detailliert (Abbildung 4) und verfügt in den Biofilm kann mit Computerprogrammen wie COMSTAT 12,13 quantifiziert werden. Insgesamt ist der wichtigste Aspekt des Protokolls der Tatsache, dass es ein zeitaufwändiger Prozess ist. Es ist auch eine Einschränkung, dass die Zellen müssen in der Lage, auf einem nicht-fluoreszierenden, transparenten Oberfläche wachsen. . Da der Biofilm gebildet wird analysiert mit einem konfokalen Mikroskop, die Tiefe, dass untersucht wird, um ein paar hundert Mikrometer 14 begrenzt werden kann, gibt es weitere technische Beschränkungen, die in das Design: Das System ist nicht für das Hochdurchsatz-Screening geeignet, da ein erfahrener Forscher können höchstens 15 Kanäle pro Experiment, das wiederum mehrere Tage dauern kann zur Vorbereitung zu behandeln. Allerdings können Antibiotika oder Mutanten, die als relevant für die Biofilm-Studien werden zunächst Masse mit anderen Methoden wie Kristallviolettfärbung abgeschirmt vor den interessantesten Kandidaten für die Flusszelle System übertragen werden. Der Deckel Glasscheiben sind sehr dünn und brechen leicht, und darauf zu achten, bei der Handhabung der Systeme. Neben den Schlauch sollte täglich während der Laufzeit eines Experiments untersucht werden, als erhebliche "back-Wachstum" in den Einlaßrohre kurz vor der Strömung Zellen auftreten können. Solche Verunreinigungen können durch das Entfernen von mehreren Zentimetern von Silikon-Schlauch von der Eingangsseite der Strömung Zellen gelöst werden, indem sterile Technik. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4 a) 4 Tage alte PAO1 -. GFP Biofilm für 24 Stunden mit Colistin und Propidiumiodid behandelt tot-Färbung (rot angefärbt) b) 3D-Darstellung eines 3 Tage alten P. aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa Wildtyp) - GFP Biofilm 6 c) 3D-Bild-Darstellung eines PAO1 - CFP pila Mutante (blau) mit einem PAO1 Wildtyp YFP (gelb) d) 5 Tage alten PAO1 - GFP Biofilm als 3D vorgestellt Bild e) 26 h S. cerevisiae (ptr3 Mutanten in CEN.PK Hintergrund) Biofilm mit Syto-9 15 gefärbt.

<ul><li> Blasenfallen, Polyethylen (DTU Systems Biology, Technical University of Denmark, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument% 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx) </li><li> Klare Polypropylen-Kunststoff-Anschlüsse und T-Anschlüsse (Cole Parmer, 1 / 8 Zoll (3,175 mm) und 1 / 16 in. (1.588 mm)) </li><li> Clamps </li><li> Konfokalen Mikroskops (Zeiss, Meta LSM510) </li><li> Deckgläser, Glas (Knittel Gläser) 50 x 24 mm </li><li> Deckgläser, PVC Deckgläser (Rinzl) 50 x 24 mm </li><li> Flow-Zellen, Polyethylen (DTU Systems Biology, Technical University of Denmark, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument% 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx </li><li> Medium-Flaschen (Schott) </li><li> Schlauchpumpen (Watson-Marlow, 205S) </li><li> Rollwagen für Durchfluss-Systeme und Pumpen </li><li> Silikon-Kleber (3M Super Silicondichtungsmasse Clear) </li><li> Spritze 5 ml (Terumo) </li><li> Syto 9 (Molecular Probes) </li><li> 0,5 ml Spritzen mit Kanülen (27G, Terumo LU-100) </li><li> Abfallbehälter </li></ul> Tubing: <ul><li> Silikon, 3 mm Außendurchmesser, 1 mm Innendurchmesser (Ole Dich) </li><li> Silikon, 4 mm Außendurchmesser, 2 mm Innendurchmesser (Ole Dich) </li><li> Marprene, 3 mm Außendurchmesser, 1 mm Innendurchmesser (Watson-Marlow) </li></ul> Medien <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> P. aeruginosa Medium </td></tr><tr><td> A10 </td><td> g / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO4 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 X 2H 2 O </td><td> 6,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> FB </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> 1 mL 1 M CaCl 2 </td><td> 0,01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 ul / L Trace Metalle (P. aeruginosa-Biofilme) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix A10 und FB in einem Verhältnis von 1:10. </td></tr><tr><td colspan="2"> Add Kohlenstoffquelle auf eine gewünschte Konzentration. </td></tr></tbody></table> <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> S. cerevisiae synthetische vollständige (SC)-Medium </td></tr><tr><td></td><td> g / L </td></tr><tr><td> Adeninsulfat </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Tryptophan </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Histidin-HCL </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Arginin-HCL </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-Methionin </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Tyrosin </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-Leucin </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-Isoleucin </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-Lysin-HCL </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-Phenylalanin </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-Asparaginsäure </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-Glutaminsäure </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> L-Threonin </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> L-Serin </td><td> 0,40 </td></tr><tr><td> Hefe Nitrogen Basis w / o Aminosäuren und Ammonium (Bacto) </td><td> 1,6 </td></tr><tr><td> Ammoniumsulfat </td><td> 5,0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6,0 </td></tr><tr><td> Bernsteinsäure </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> Glucose (getrennt autoklaviert) </td><td> 0,20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa und saccharomyces cerevisiae biofilm im flow cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Viele mikrobielle Zellen haben die Fähigkeit, sessile mikrobielle Gemeinschaften wie Biofilmen, die physiologischen und pathologischen Eigenschaften verändert haben im Vergleich zu frei lebenden Mikroorganismen definierte Form. Biofilme in der Natur sind oft schwer zu untersuchen und unter schlecht definierten Bedingungen 1 befinden. Mit einem transparenten Substrat ist es möglich, Gerät ein System, wo einfache Biofilmen in eine nicht-destruktive Weise in Echtzeit untersucht werden kann: hier zeigen wir die Montage und den Betrieb einer Durchflusszelle Modellsystem für in vitro 3D-Untersuchungen der mikrobiellen Biofilmen Erzeugung hoher Reproduzierbarkeit unter genau definierten Bedingungen 2,3. Das System besteht aus einer Flow-Zelle, die als Klimakammer für die Biofilm dient. Die Messzelle ist mit Nährstoffen und Sauerstoff aus einem Medium Kolben über eine peristaltische Pumpe zugeführt und verbrauchte Medium wird in einem Abfallbehälter gesammelt. Dieser Aufbau des Flow-System ermöglicht eine kontinuierliche Zufuhr von Nährstoffen und Verwaltung von zB Antibiotika mit minimaler Störung der Zellen in der Strömungskammer gewachsen. Darüber hinaus ermöglichen die Strömungsverhältnisse innerhalb der Durchflusszelle Studien von Biofilm ausgesetzt Schubspannung. Eine Blase Auffangeinrichtung Grenzen Luftblasen aus dem Schlauch, die sonst der Biofilm-Struktur in der Durchflusszelle stören könnten. Die Durchflusszelle System ist kompatibel mit konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) und kann dadurch eine sehr detaillierte 3D-Informationen zur Entwicklung von mikrobiellen Biofilmen. Cells im Biofilm kann mit fluoreszierenden Sonden oder Proteine ​​mit CLSM-Analyse bezeichnet werden. Dies ermöglicht Online-Visualisierung und ermöglicht Untersuchungen von Nischen in den Entwicklungsländern Biofilm. Mikrobielle Zusammenhang, Untersuchung von antimikrobiellen Wirkstoffen oder die Expression bestimmter Gene, sind die vielen Versuchsaufbauten, die in der Durchflusszelle System untersucht werden kann.

Protokoll beschreibt die Anwendung einer Messzelle für wachsende und Analyse von mikrobiellen Biofilmen für konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Hallo, ich bin Matt Ma Niton von der Technischen Universität Dänemark. Hallo, und ich bin Reba von der Universität Kopenhagen. Wir arbeiten an Hefe- und bakteriellen Biofilmen in Flusszellensystemen Und in diesem Film zeigen wir Ihnen, wie Sie ein Flusszellensystem einrichten und einen Biofilm durch konvertierbares Mikrofon visualisieren.Sollen wir das jetzt tun? Ja, klar. Lass es uns tun.Verkleben der Durchflusszellen. Die Durchflusszellen befinden sich zwischen der Blasenfalle und der Abfallflasche. Jetzt zeigen wir Ihnen, wie Sie anbringen.Dies ist die Schicht zur Durchflusszelle. Dies geschieht durch die verschiedenen Komponenten, die Sie in der Tabelle sehen. Eine 200-Mikroliter-Spitze wird in zwei Stücke geschnitten.Das dünne Teil wird nun in eine Spritze eingeführt, die zum perfekten Werkzeug zum Auftragen dünner Silikonlinien wird. Um das Schichtglas mit der Durchflusszelle zu verkleben, schieben Sie die dünne Spitze aus der Spritze. Um nun das Auftragen des Silikons auf den Boden der Durchflusszelle zu erleichtern, schneiden Sie den äußersten Teil der Spitze ab, nehmen Sie den Kolben heraus und geben Sie eine entsprechende Menge Silikon in die Spritze.Setzen Sie den Kolben wieder in die Spritze ein und drücken Sie ein wenig Silikon heraus, um sicherzustellen, dass alle Blasen verschwunden sind. Beginnen Sie nun mit dem Auftragen dünner Linien aus Silikon auf die Durchflusszelle. Versuchen Sie, glatte und ununterbrochene Silikonlinien zur Durchflusszelle herzustellen.Dadurch wird sichergestellt, dass sich das Silikon gleichmäßig am Substrat anhaftet, wenn Silikon in die entgegengesetzte Richtung aufgetragen wird. Achten Sie darauf, die bereits hergestellten Leitungen nicht auszukratzen, sondern versuchen Sie, die Spitze vorsichtig anzuheben, während Sie hinübergehen, und stellen Sie auf diese Weise sicher, dass keine Öffnungen in den Silikonleitungen zu Leckagen zwischen den Kammern oder aus der Durchflusszelle führen. Nehmen Sie ein Deckglas und legen Sie es vorsichtig auf die Silikonleitungen an der Durchflusszelle.Wie hier zu sehen, haftet das Deckglas leicht an dem Silikonkleber. Drehen Sie die Durchflusszelle um und drücken Sie mit den Fingern vorsichtig auf die Rückseite der Durchflusszelle. Dadurch wird sichergestellt, dass das Deckglas entsprechend der ebenen Oberfläche des Tisches flach befestigt wird.Um nun eine perfekte Abdichtung zu erzielen oder zu versuchen, die Entsiegelung von Bereichen zu korrigieren, drücken Sie vorsichtig mit einem Instrument als Kolben aus einer Spritze nach unten. Tun Sie dies sehr vorsichtig. Da ein Deckglas leicht zerbrechen kann.Auf diese Weise können Sie eine noch bessere Abdichtung herstellen und möglicherweise problematische Zonen korrigieren, um Leckagen bei der Inspektion der Durchflusszellen zu vermeiden. Um ein erfolgreiches Experiment zu haben, ist es wichtig, Ihre Durchflusszellen zu inspizieren, nachdem sich das Silizium verfestigt hat. Hier zeigen wir eine Durchflusszelle mit einer nicht perfekten Abdichtung, die zweifellos zu Leckagen bei der Montage der Blasenfallen und der Befestigung der Schläuche führen wird.Die Blasenfallen befinden sich zwischen der Pumpe und den Durchflusszellen. Hier zeigen wir die verschiedenen Komponenten für den Einsatz der DTU Bio Bubble Traps. Sie sind so hergestellt, dass sichergestellt wird, dass die Blasen im System eingeschlossen werden und nur Medien ohne Blasen in die Durchflusszellen gelangen.Auf jede der Spezialdüsen werden fünf Milliliter-Spritzen aufgesetzt. Bei der Blasenfalle ist eine dichte Abdichtung durch die alten Ringe gewährleistet. Setzen Sie auf jede Düse eine Kappe auf jede der Spritzen.Da dies nun der Anschluss für die Durchflusszellen sein wird, stellen Sie sicher, dass Sie die langen Schläuche für die Durchflusszelle anbringen, um ein konfokales Mikroskop erreichen zu können. Diese Schläuche sollten an den Blasenfallen befestigt werden, wo die untere Kante der Düse ihren Auslass hat. Da die Eintrittskante in der Blasenfalle höher ist als die Austrittsleiste, können die Blasen die Spritze nicht verlassen und in die Flusszellenbefestigung der Durchflusszellen an den Blasenfallen gelangen.Die Durchflusszellen befinden sich zwischen den Blasenfallen und der Abfallflasche. Hier ist es erforderlich, lange Schläuche zu haben, damit die Durchflusszelle das konfokale Mikroskop erreichen kann. Achten Sie auch hier darauf, dass der Durchfluss mit der richtigen Seite des Blasenfalls verbunden ist. Hier.Beachten Sie die langen Schläuche, die zum Fluss aus der Blasenfalle führen. Dies kann natürlich bei der Konstruktion eines Setups variieren. Befestigen Sie nun alle Schläuche fest an der Durchflusszelle Montage des Systems Blasenfallen an der Pumpe und den T-Anschlüssen.Für die Medienzuführsonden. Für die Schlauchpumpe verwenden wir die RIN-Schläuche. Diese spezielle Art von Schläuchen ist in der Lage, dem mechanischen Druck der Pumpe standzuhalten.Richten Sie für jede der Kammern in Ihren Durchflusszellen ein Rohr ein. Hier zeigen wir nun, wie die Schläuche, die von der Medienflasche zur Pumpe führen, zusammengebaut werden. Schneiden Sie den Silikonschlauch in entsprechend große Stücke und verbinden Sie diese mit den T-Verbindern.Montieren Sie die Schläuche so, dass für jeden der Mar-Gehirnschläuche in der Pumpe ein Anschluss vorhanden ist. Achten Sie darauf, für jede der Kammern in der Durchflusszelle ein Rohr herzustellen. Versuchen Sie, Ihre Rohre so kurz wie möglich zu halten, um einen besseren Überblick über Ihre Anschlüsse zu haben.Nun von der Mitte aus an den T-Anschlüssen befestigten kurzen Schläuchen, die an den ING-Schläuchen in der Pumpe befestigt werden können. Achten Sie darauf, dass die Silikonschläuche fest mit den Verbindern verbunden sind. Mit den Medienzuführschläuchen auf der linken Seite der Pumpe befestigen wir nun den Rest des Systems an der Pumpe.Hier sind die Schläuche, die zu den Bubble Trays führen, die an den Spülschläuchen an der Pumpe befestigt sind. Auch hier erleichtern Sie den Überblick über Ihr Experiment. Wenn Sie wissen, welche Schläuche zu welchem Anschluss in der Pumpe führen, ist die Länge dieser Schläuche nicht so entscheidend wie die Schläuche auf der anderen Seite der Blasenfalle.Führende Medien zu den Durchflusszellen, Wir haben Ihnen nun gezeigt, wie Sie erfolgreich ein System mit einer Blasenfalle und einer Durchflusszelle am Austrittspunkt der Durchflusszelle montieren. Wir haben Schläuche verbunden, die lang genug sind, um in einen Abfallbehälter zu gehen, um das System zu sterilisieren und eine 0,5-Lösung Natriumhydrochlorid herzustellen. Legen Sie die Zuführschläuche der Pumpe in die Hydrochloridlösung.An dieser Stelle ist es äußerst wichtig, das gesamte System mit der Hydrochloridlösung zu füllen. Ermöglicht es, dass sich die Spritzen der Blasenfallen beim Befüllen vollständig mit Hydrochlorid füllen, setzen Sie die Verschlüsse wieder auf, die in der Zwischenzeit in Ethanol eingelegt sein sollten. Ein wichtiger Schritt bei der Sterilisation des Systems ist die Entfernung von Blasen aus den Durchflusszellen.Solche Blasen sind in den hier gezeigten Durchflusszellen leicht zu erkennen, aber der hohe Erfolg der Blasenentfernung dreht die Pumpe auf ihre höchste Umdrehung pro Minute. Dies führt zu einem höheren Flüssigkeitsfluss in den Durchflusszellen, der mit der Zeit dazu beiträgt, die Blasen loszuwerden, die Durchflusszelle anzuheben und die Schläuche anzuheben, die zur Durchflusszelle führen, und die Durchflusszelle fest auf den Tisch zu klopfen, um die Blasen zu lösen und sie auszuspülen. Mit dem Flüssigkeitsfluss dauert dieser Vorgang manchmal lange, aber Sie werden auf diese Weise in der Lage sein, die Blasen loszuwerden.Wenn Sie nun Patient sind, lassen Sie die Durchflusszellen drei bis vier Stunden lang bei einem Fluss von etwa 0,2 Millimetern pro Sekunde sterilisiert. Waschen Sie das System zuerst in das System, indem Sie Luft das Hydrochlorid aus dem gesamten System drücken lassen. Da das System nun das Hydrochlorid entleert hat, legen Sie die zentrale Ernährungssonde in eine sterile Flasche mit Wasser und decken Sie die Oberseite ab.Das System muss nun zwei- bis dreimal gewaschen werden, indem eine Lücke im System mit sterilem Wasser gefüllt, das Medium angeschlossen und die Schläuche über Nacht gesättigt werden. Beim Anschluss der Medienblase an das System muss das System von Wasser entleert werden. Füllen Sie wie beim Hypochlorat den Blasenmüll mit Medien, bevor Sie die Verschlüsse wieder aufsetzen.Achten Sie beim Anschließen der Medien sehr darauf, dass alles steril bleibt. Halten Sie Ethanol seitlich an der Verbindungsstelle bereit. Legen Sie die beiden Röhrchen in das Ethanol, kurz bevor Sie die Röhrchen verbinden.Jetzt, da das Medium an das System angeschlossen ist, ist es bereit für die Sättigung oder Impfung über Nacht. Abhängig von der Wahl des Mediums wird die Durchflusszelle inokuliert. In den DTU Bio-Flow-Zellen haben Sie drei Impfstellen für die drei einzelnen Wachstumskammern.Als erstes wird die Impfstelle aus einer Übernachtkultur sterilisiert. Machen Sie es eine Anspielung, um die gewünschte optische Dichte zu erreichen. Verwenden Sie eine 500-Mikroliter-Spritze mit einer 27-G-Nadel, um die Probe zu impfen.Ein Inokulum von 250 Mikrolitern ist für die DTU Bio Durchflusszellen ausreichend. Nun wird die Impfstelle mit dem Netto-Ethanol-Wisch abgewischt und die Impfseite mit Silikonkleber verschlossen. Drehen Sie nun die Durchflusszelle auf den Kopf und lassen Sie sie in dieser Position eine Stunde lang ohne Medienfluss.Nachdem die Durchflusszelle eine Stunde lang auf dem Kopf stand, nehmen Sie die Klappe wieder ab, starten Sie den Medienfluss und stellen Sie eine Durchflusszelle wieder auf den Kopf. Starten Sie nun die Inkubation des Systems. Die Inkubationszeit und die Wahl der Temperatur variieren je nach Auswahl, Stämmen und Versuchsanordnungen, Färbung eines Hefe-Biofilms und Visualisierung durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie.Um den Hefe-Biofilm mit einem konfokalen Mikroskop sichtbar zu machen, färben wir ihn mit dem grün fluoreszierenden Nukleinsäure-Farbstoff CY nine. Hier verwenden wir eine Verdünnung von eins bis tausend. Zuerst werden die Schläuche, die von den Durchflusszellen zurück zu den Blasenfallen führen, abgerissen.Dadurch wird ein Rückfluss aus dem Fluss während des Färbevorgangs verhindert. Stoppen Sie nun den Medienfluss zur Blasenfalle. Verwenden Sie eine 500-Mikroliter-Spritze wie für die Inokulation, um den Cyto-Neun-Fleck in die Durchflusskammer zu injizieren.Verwenden Sie auch hier ein Ethanol-Tuch, um die Impfstelle zu sterilisieren. Injizieren Sie hier 250 Mikroliter in die Kammer. Seien Sie sehr vorsichtig und sanft.Bei der Inokulation sollte die Impfgeschwindigkeit sehr niedrig sein, um den Biofilm nicht zu stören. Verschließen Sie das Impfloch mit Silikonkleber. Lassen Sie die Flecken 15 Minuten lang ohne Fluss einwirken.Nehmen Sie die Klemme ab und starten Sie den Durchfluss erneut. Sie sind nun bereit für die Analyse des verfärbten Biofilms. Bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie verfügt die Durchflusszelle über spezielle Leisten, die es ermöglichen, sie in den Halterungen auf dem Mikroskoptisch zu platzieren.Wenn die Durchflusszelle in den Mikroskoptisch gestellt wird, wird ein Tropfen Öl auf das Glas der Schicht gegeben. Um das Ölimmersionsobjektiv zu verwenden, schalten Sie das weiße Licht ein und senken Sie das Objektiv ab, damit es mit dem Öl in Kontakt kommt und die Zellen in der Kammer lokalisiert. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie ein Glas Stratum verwenden, da es leicht zerbrechen kann.Hier zeigen wir einen Hefe-Biofilm, wie er mit dem weißen Licht im Mikroskop gesehen wird. Wenn das Fluoreszenzlicht eingeschaltet ist, kann man leicht die Cyto-Neun-Färbung der Zellen erkennen. Die Cyto-Neun-Färbung ermöglicht nun das Scannen des Biofilms mit einem konfokalen Mikroskop.Für eine weitere Analyse mit der Amer-Software lokalisieren Sie mit dem Mikroskop die gewünschte Position in der Durchflusskammer. Denken Sie daran, die unterschiedlichen Umgebungen zu berücksichtigen, die im Laufe der Zeit in der Durchflusskammer erzeugt werden. Schalten Sie nun bei der Standortwahl das Mikroskop von der Okularvisualisierung auf die Scanning-Laservisualisierung um.Mit der Size LM Software können Sie nun die entscheidenden Einstellungen für das Scannen Ihrer Proben anwenden. Ein schnelles Scannen Ihrer Proben gibt Ihnen Aufschluss über die strukturelle Zusammensetzung des Biofilms in den Wachstumskammern. Bevor wir mit dem zeitaufwändigeren hochauflösenden Scannen hier beginnen, haben wir gesagt: Was ist die erste und was ist die letzte Position des Scanvorgangs, und damit wie groß wird der Stapel sein?Wir sind in der Lage, die verschiedenen Frequenzen zu scannen, da im Mikroskop unterschiedliche Laser installiert sind. Dies wird die Untersuchung zahlreicher verschiedener Subpopulationen ermöglichen. Hier sehen wir den grünen Schatten mit neun Flecken, der im Fenster aus den verwendeten Wellenlängen präsentiert wird.Jeder der Scan-Stacks kann nun in Softwareprogrammen als Fehler analysiert werden.

pseudomonas-aeruginosa-saccharomyces-cerevisiae-biofilm-flow

Research

Forschung

JoVE Journal

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