In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E15 muriner Embryonen

Hallo, ich bin William Tis vom Krete Lab. Heute zeigen ich und andere Ihnen intrauterine Injektionen von E 15 Mausembryonen. Hallo, mein Name ist Laura Elias.

Heute zeige ich Ihnen, wie Sie die Mikroinjektionspipetten vorbereiten und die Pipetten für die intventrikulären Injektionen und die Elektroporation laden, die wir durchführen werden. Mein Name ist David Castaneda und heute werde ich bei in vivo in utero Injektionen von Mäuseembryonen assistieren. Wir werden Plasmid-DNA in den lateralen Ventrikel von sich entwickelnden Mäuseembryonen injizieren.

Wir zielen auf den CE-Kortex dieser Embryonen ab, so dass wir die Expression verschiedener Moleküle durch Gliazellen erhalten, die später in der Entwicklung zu Neuronen werden. Wenn Sie diese intrauterinen Injektionen durchführen, gibt es einige wichtige Werkzeuge, die Sie verwenden müssen, und ich werde sie Ihnen zeigen. Jetzt. Wir verwenden einen Freier, ein paar Addin-Pinzetten.

Eines, ein Paar, das gezackt ist, und ein anderes Paar, das am Ende einen kleinen Zahn hat. Wir verwenden ein Paar Hämostatika. Das ist eine Schere.

Und dann verwenden wir diese beiden Tacker. Das sind die größeren, die wir für Ratten verwenden. Dies ist die kleinere, die wir für Mäuse verwenden.

Verwendet eine Klammer der Größe sieben, und dies verwendet eine Klammer der Größe neun und sie sind nur federbelastet. Einige der Dinge, die wir hier verwenden, um die Operationen zu unterstützen, sind die Verwendung einer einfachen faseroptischen Lichtquelle mit einem Doppelkopf darauf. Wir verwenden ein beheiztes Pad, durch das nur warmes und erhitztes Wasser zirkuliert, um es warm zu halten.

Als Arbeitsfläche verwenden wir dieses Por-Elektroporationssystem von BTX. Wir haben ein paar verschiedene Größen von Paddeln, die wir verwenden, je nachdem, wie groß die Embryonen sind. Die blaue Seite ist die positive Seite.

Okay, also für die Mäuse verwenden wir einen Iso-Fluor-Verdampfer. Wir fanden heraus, dass es unsere Überlebensrate der Mutter und der Embryonen erhöht. Es ermöglicht uns auch, das Tier sehr schnell und auf sehr kontrollierte Weise in und aus dem Bewusstsein zu bringen.

Aus diesem Grund fanden wir es sehr nützlich. In Ordnung, jetzt werden wir unsere Injektionspipetten abschrägen. Und das ist sehr wichtig, damit Ihre, Ihre Pipette, eine ausreichend große Öffnung hat, damit Sie Ihre DNA laden können, aber auch, dass sie sehr, sehr scharf ist, damit sie den Embryo nicht beschädigt, wenn Sie injizieren.

Und wenn Sie den Embryo bei der Injektion beschädigen, werden Sie eine viel höhere Sterblichkeitsrate haben. Und das ist also nicht gut. Das ist also eigentlich ein sehr wichtiger Prozess wie bei dieser Operation.

Und zuerst werden wir einfach etwas Wasser auf diesen abgeschrägten Stein geben, der sich hier dreht. Und dann nehmen wir, mal sehen, nur einen, einen, einen Stock. Und wir werden unsere Pipette, die wir gerade mit etwas Klebeband auf diesen Stab gezogen haben, platzieren.

Und wir werden einen dieser Mikromanipulatoren verwenden, um die Pipette auf der Fase zu halten und sie hier abschrägen zu lassen. Also, und platzieren Sie es einfach und wir verwenden ein Mikroskop, um die Spitze der Pipette zu visualisieren. Und wir platzieren es einfach direkt im Wasser auf der Abschrägung, damit ein wenig Druck entsteht.

Und Sie können sehen, wie die Spitze gegen den Stein hier drückt. Und lassen Sie es einige Zeit für mindestens 15 Minuten abschrägen. Ich lasse sie gerne auch nur für eine Stunde stehen.

Manchmal sind sie einfach nur sehr, sehr scharf, aber es hängt definitiv von Person zu Person ab, wie lange sie ihre Pipetten abschrägen. In Ordnung, hier haben wir also, Sie können oben sehen, dass wir eine Pipette haben, die gezogen wurde, die noch nicht abgeschrägt wurde. Obwohl es also scharf ist, hat es keine Öffnung, durch die man seine DNA laden könnte.

Jetzt wurde die untere Pipette abgeschrägt und Sie können diese schöne abgewinkelte Öffnung sehen, die es Ihnen ermöglicht, Ihre DNA zu laden, aber sie hat immer noch eine scharfe Spitze, damit Sie injizieren können, ohne Schäden zu verursachen. Gut, jetzt füllen wir unsere Injektionspipetten mit DNA. Daher ist es wichtig, dass Sie Ihre DNA auf endotoxinfreie Weise vorbereiten, damit Sie bei der Injektion Ihrer DNA keine der Lipopolysaccharide injizieren.

Wir werden also unsere DNA nehmen und hier unsere Paraform vorbereiten. Ihr werdet also einfach hier eure Paraform machen und eure DNA sammeln und sie einfach als kleinen Punkt auf diesem Para-Film platzieren wollen. Und dann nehmen wir, also nehme ich normalerweise pro 10 Mikroliter meiner DNA, die ich normalerweise mit etwa 1,5 bis 1,7 Mikrogramm aus einem Mikroliter verwende.

Ich werde etwa einen Mikroliter dieses schnellen grünen Farbstoffs verwenden. Und das dient nur dazu, uns zu helfen, unsere Injektion zu lokalisieren und sicherzustellen, dass wir erfolgreich in den Ventrikel injiziert haben. Also mische ich diesen schnellen grünen Farbstoff einfach mit meiner DNA.

Und dann nehmen Sie Ihre Injektionselektrode und wir füllen einfach die Pipette, indem wir den Kolben zurückziehen. Und Sie können hier sehen, ob es, wenn die Pipette richtig abgeschrägt ist und eine ausreichend große Öffnung hat, der DNI ziemlich leicht laden sollte. Manchmal müssen Sie den Kolben einfach hin und her bewegen, damit er richtig geladen wird.

Und dann können Sie die Pipette so beladen. Und so haben wir die DNA vollständig in diese Pipette geladen und sie ist bereit für die Injektion. Okay, ich werde das Tier jetzt mit Alkohol und Jod waschen, aber zuerst möchte ich natürlich eine Zehenkneifung machen, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig unter Wasser ist und gut aussieht.

Also kann ich loslegen und anfangen. Und ich beginne mit genau wie bei den Ratten, wir machen eine Reihe von drei davon, beginnend mit dem Ethanol. Okay, Jod.

Um das Infektionsrisiko zu minimieren, beachten Sie bitte, dass William beim Öffnen der Tücher das Tier mit dem Teil reinigt, der nicht von seinen Fingern berührt wurde. Um das Maximum daran zu erreichen, ist der Bereich sauber. Zweitens wischt er sich nur einmal ab, um zu vermeiden, dass sich Keime auf der Bauchoberfläche verteilen.

Okay, großartig. Jetzt werde ich ein bisschen aufräumen und wir werden ein paar OP-Handschuhe anziehen. Okay.Okay.Okay.Okay. Also werde ich jetzt die Maus öffnen und die Gebärmutterhörner herausnehmen, und ich beginne damit, dass ich die Haut ein wenig zusammenklebe.

Lass mich hier noch einmal in die Zehen kneifen, nur um sicherzugehen, dass sie ganz unten ist und das ist gut. Also kneife ich die Haut zusammen und mache dort nur eine kleine Welle, die nach oben ragt, was mir das Schneiden erleichtert. Und auch hier wollen wir den Schnitt genau entlang der Mittellinie des Tieres machen, um Blutgefäße zu vermeiden.

Normalerweise schneide ich die Haut so, trenne sie und lege den Muskel frei. Und wenn du das getan hast, kannst du die Mittellinie dort im Muskel leicht erkennen. Es ist sehr definiert.

Ich werde mir dort ein paar Muskeln schnappen, schnippeln. Und das ist ein guter Schnitt. Ich würde wirklich nicht größer gehen wollen. Und dann benutze ich diesen Freer, um den Muskel und die Haut anzuheben, ihn zur Seite zu ziehen, und dann mache ich eine sehr sanfte Sonde hier hinein und versuche, den Freer zwischen den beiden Embryonen zu positionieren, zwischen zwei Embryonen, so dass ich sie einfach sanft herausziehen kann, ohne sie überhaupt zu beschädigen.

Manchmal ist es einfacher als andere. Na bitte. Also ziehe es einfach sanft durch und wenn ich es durchhabe, kann ich sie einfach irgendwie anstupsen.

Es ist wichtig, die Embryonen niemals zu kneifen, sondern man möchte sie einfach nur führen, sie einfach irgendwie anstupsen. Und wenn man sie einmal rausgeholt hat, möchte ich sicher sein, dass sie immer sehr nass bleiben. Du willst sie nicht austrocknen lassen.

Und mal sehen, ich benutze meinen Freer hier wieder, sondiere herum. Na bitte. Das ist geil.

Und deshalb möchte ich immer sicherstellen, dass ich sie alle raushabe, denn es ist leicht, einen drin zu lassen, wenn man nicht nach den Eierstöcken sucht. Also ziehe ich sie immer ganz vorsichtig wieder raus, aber ich suche und schaue die Eierstöcke am Ende, die genau da sind. Und es sieht nur aus wie eine kleine Masse rotes Gewebe in diesem Tier.

Und dann drehe ich sie um, komme zurück und überprüfe die andere Seite und ich kann sie dort sehen. Achten Sie also nur darauf, dass sie hydriert bleiben Und schon kann es losgehen. Etwas, auf das ich hinweisen möchte, ist, dass Sie das nicht tun, Sie sollten die Embryonen sehr vorsichtig greifen und nur die Embryonen greifen.

Greifen Sie nicht dorthin, wo sich die Blutgefäße befinden, denn sie können sehr leicht beschädigt werden, und das wird der Fall sein, das Tier wird eine Blutung haben und die Überlebensrate wird dramatisch sinken. Das erste, was wir also bestimmen wollen, ist, wo sich der Kopf in dem Embryo befindet, dem wir die DNA injizieren wollen. Wir tun dies, indem wir das Tier sanft drehen und auf den ventralen Teil schauen, jeden ventralen Teil.

In diesem speziellen Beispiel haben wir also einen Kopf, der sich zu meiner Rechten und der Schwanz nahe zu meiner Linken befindet. Die Mittellinie befindet sich in dieser Position und William wird den Embryo entsprechend positionieren, damit ich ihn wie bei den Ratten injizieren kann. Ich positioniere sie immer mit dem Kopf nach oben, die rechte Seite der Mutter zu mir.

Und damit fange ich jetzt an. Okay, du kannst die linke Bodenstange dort sehen, bewege dich nur ein wenig und du kannst definitiv die Mittellinie genau dort sehen. Ich werde versuchen, es ein wenig nach oben zu drehen, damit es für David in einer guten Position ist.

Okay, und jetzt werde ich mit der Injektion des linken Ventrikels fortfahren. Wir können hier sehen, dass der linke Ventrikel vollständig, vollständig mit DNA gefüllt ist. Wir können sehen, dass sich ein Absterben auf den rechten Ventrikel ausgebreitet hat und hier auch auf den dritten und vier Ventrikel.

Das ist ein guter Indikator für eine gute Injektion. Jetzt werden wir also damit fortfahren, die DNA in die Zellen zu elektronisieren. Die wichtige Überlegung hier ist, zu wissen, welche Elektrode die positive Seite ist.

Wir wissen, dass die Elektrode mit dem blauen Griff hier die positive Elektrode ist, und diese Seite sollte in die Seite gehören, in die wir die DNA elektroporieren möchten. Da wir also das haben, haben wir den linken Ventrikel mit dem größten Teil der DNAI injiziert, positionieren die positive Elektrode auf der linken Seite so, und dann legen wir fünf Impulse an und das war's. Es ist wichtig, dass die Elektroden in PBS vollständig nass sind, damit der Kontakt zwischen den Elektroden und der Gebärmutter gut ist und die Übertragung der elektrischen Impulse angemessen ist.

Okay, jetzt, da die Erkundung abgeschlossen ist, werde ich die Hörner wieder einsetzen. Und wie ich das mache, bewege ich ganz sanft die Hörner zur Seite, greife hier runter und greife den Muskel und die Haut und dann irgendwie sanft, sanft und leichter wieder hinein. In Ordnung, nett.

Seien Sie vorsichtig mit der Blase. Ich kann die andere Seite machen. Und dann schütteln wir sie ein wenig, um sie irgendwie zu beruhigen.

Kann den Freer ein wenig verwenden, um sie sanft zu glätten. Und dann werde ich mit drei mil antibiotischem Antimykotikum spülen. Lass uns einen Zeh kneifen, um sicherzustellen, dass sie komplett draußen ist, bevor ich mit dem Nähen beginne.

Und das sieht auch gut aus. Ich werde Henry Shine verwenden. Nummer sechs, chirurgische Naht.

Am liebsten mache ich Blockstiche. Ich denke, sie halten besser stand. Und wir fangen damit an, indem wir die Nadel dort hindurchstecken, sie durchziehen, dreimal umwickeln, das Ende greifen und durchziehen.

1, 2, 3, schneiden Sie den Überschuss ab. Sie möchten also einfach weiter die Linie entlang gehen, gleichmäßig verteilen und festziehen. Und Sie möchten genau über die Stelle hinausgehen, an der der Schnitt aufhört, und wieder abbinden.

Und dem nähere ich mich jetzt. Ziehe das Taschentuch oder die Haut ein wenig zurück. Da blutet ein bisschen.

Es sollte in Ordnung sein. Wir haben einen Kauterizer bei uns, falls wir Blutungen bekommen, was gelegentlich vorkommt. Und sein Kauterizer funktioniert gut, um das zu stoppen.

Also, okay, ich bin über den Schnitt hinaus. Ich höre hier auf. Durchziehen, eine Schlaufe machen, dreimal drehen, die Schlaufe greifen und nach unten ziehen.

Drehen Sie sich dreimal, greifen Sie die Schlaufe, ziehen Sie sie durch und schalten Sie den Überschuss aus. Stecken Sie die Nadel in die scharfen Nadeln. Und dann werden wir einen Tacker verwenden.

Wir werden bei diesem Tier Klammern der Größe sieben verwenden. Wir verwenden sieben für Mäuse. Neun für Ratten.

Nehmen Sie einfach die Haut, ziehen Sie sie ein wenig nach oben und beginnen Sie mit dem Scheren. Greifen Sie den Clip erneut. Wir wollen gleichmäßig bis hinunter zum Einschnitt gehen, und das ist gut.

Tun Sie anschließend ein Alkoholtupfer über den gesamten Bereich. Und dann werden wir ihr eine Injektion von Buprenorphin geben, nur um sicherzustellen, dass sie Schmerzen hat. Und wir werden sie in den nächsten Tagen weiter überwachen, um sicherzustellen, dass sie gesund bleibt und keine Schmerzen hat.

Okay, jetzt, da wir ihr eine Injektion mit Buprenorphin gegeben haben, werden wir sie wieder in ihren ursprünglichen Käfig setzen, damit sie sich beim Aufwachen wohl fühlt, ihn in den Inkubator legen und sie dort etwa 20 Minuten lang bleiben lassen, bis sie vollständig wach und getrocknet ist. Wir haben Ihnen gezeigt, wie Sie in vivo in utero, Elektroporation von Plasma, DNA durchführen können. Wir können jedes Molekül injizieren.

Es könnte Plaid D sein oder es könnten Drogen sein. Wachstumsfaktoren stirbt. Wenn Sie diese Moleküle in die Zellen abgeben müssen und sie nicht durch passive Diffusion gehen, benötigen Sie eine Elektroporation und dafür müssen die Moleküle aufgeladen werden.

Aber im Grunde sind die Möglichkeiten grenzenlos. Ein Beispiel für einen alternativen Vektor für die Verabreichung von Genen in die Zelle. Unsere Viren.

Und in der Vergangenheit haben wir Retroviren verwendet, um gls mit DNA zu markieren und zu zeigen, wie sie sich teilen und zu Neuronen werden, um schließlich in den Kortex zu wandern, nachdem man die Zellen mit einem Virus markiert oder Elektroporation verwendet hat, oder wenn man Medikamente oder andere Moleküle injiziert, um die Entwicklung des Gehirns zu beeinflussen. Sie können dies mit verschiedenen Techniken untersuchen. Eine davon ist der Zeitraffer, bei dem Sie organotypische Schnittkulturen durchführen werden.

Und dann verfolgen Sie das Schicksal der Zellen mit einem Mikroskop. Wie Sie hier sehen können, ist die Zeit 0,0. Wir beginnen mit einer Ansammlung von Zellen, die sich sehr nahe an der Seitenkammer befinden.

Und mit der Zeit können wir sehen, dass die Zellen beginnen, aus der ventrikulären Zone in Richtung der kortikalen Platte zu wandern. Darüber hinaus fixieren wir die Embryonen und betreiben Immunhistochemie, um die Verteilung der verschiedenen Moleküle zu untersuchen oder das Schicksal dieser verschiedenen Zellen zu bestimmen. Eine andere Möglichkeit ist die Elektrophysiologie.

Wir identifizieren die Markierungszellen und untersuchen dann ihre elektrischen Eigenschaften. Nun, danke, dass Sie heute bei uns sind. Wir hoffen, dass Ihnen unsere Vorführungen gefallen und dass es Ihnen gelingt, Ihre Experimente durchzuführen.

Wenn Sie Fragen haben, zögern Sie nicht, uns zu kontaktieren. Ihr wisst schon, viel Glück.