In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E15 muriner Embryonen

Hallo, ich bin William Tis aus dem Krete-Labor. Heute werden ich und andere Ihnen intrauterine Injektionen an E15-Maus-Embryonen demonstrieren. Hallo, mein Name ist Laura Elias.

Heute werde ich Ihnen zeigen, wie man die Mikroinjektionspipetten vorbereitet und belädt, um die intraventrikulären Injektionen und Elektroporationen durchzuführen, die wir durchführen werden. Mein Name ist David Castaneda, und heute werde ich bei in-vivo-in-utero-Injektionen an Mausembryonen assistieren. Wir werden Plasmid-DNA in das Seitenventrikel von sich entwickelnden Mausembryonen injizieren.

Wir zielen auf die CE-Rinde dieser Embryonen ab, um die Expression verschiedener Moleküle durch Gliazellen zu erzielen, die später in der Entwicklung zu Neuronen werden. Bei diesen intrauterinen Injektionen benötigen Sie einige wichtige Werkzeuge, die ich Ihnen nun zeigen werde. Wir verwenden einen Freer-Haken und ein paar Adson-Stopfer.

Eine, ein Paar mit Sägezahnkante und ein weiteres Paar, das am Ende einen kleinen Zahn aufweist. Wir verwenden ein Paar anatomische Pinzetten. Dies ist ein Paar Scheren.

Und dann verwenden wir diese beiden Klammernvorrichtungen. Dies ist die größere, die wir für Ratten verwenden. Dies ist die kleinere, die wir für Mäuse verwenden.

Verwendet eine Heftklammer der Größe sieben, und dies verwendet eine Heftklammer der Größe neun, und beide sind einfach federbelastet. Einige der Hilfsmittel, die wir hier zur Unterstützung der Operationen verwenden, sind eine einfache faseroptische Lichtquelle mit Doppelkopf. Wir verwenden eine beheizte Unterlage, die warmes Wasser zirkulieren lässt, um sie warm zu halten.

Die Arbeitsfläche, wir verwenden dieses Elektroporationssystem von BTX. Je nach Größe der Embryonen verwenden wir verschiedene Größen von Elektroden. Die blaue Seite ist die positive Seite.

Okay, für die Mäuse verwenden wir einen Isofluranverdampfer. Wir haben festgestellt, dass dies die Überlebensrate der Mutter und der Embryonen erhöht. Außerdem ermöglicht es uns, das Tier sehr schnell und in sehr kontrollierter Weise ein- und aus der Bewusstlosigkeit zu bringen.

Aus diesem Grund haben wir es als sehr nützlich empfunden. Gut, jetzt werden wir unsere Injektionspipetten anfeilen. Das ist sehr wichtig, damit Ihre Pipette eine ausreichend große Öffnung aufweist, um Ihre DNA aufzunehmen, aber gleichzeitig auch sehr, sehr scharf ist, sodass sie das Embryo bei der Injektion nicht beschädigt.

Und wenn Sie den Embryo beschädigen, während Sie injizieren, wird die Sterblichkeitsrate deutlich höher sein. Das ist daher nicht vorteilhaft. Dieser Schritt ist deshalb ein sehr wichtiger Prozess bei diesem chirurgischen Eingriff.

Und zuerst geben wir etwas Wasser auf diesen Schleifstein, der sich hier dreht. Dann nehmen wir, schauen wir mal, einfach einen Stab. Und wir befestigen unsere soeben gezogene Pipette mit etwas Klebeband an diesem Stab.

Und wir werden einen dieser Mikromanipulatoren verwenden, um die Pipette an der Schräge zu halten und sie hier zu schleifen. Dann platzieren wir sie einfach, und wir benutzen ein Mikroskop, um die Pipettenspitze sichtbar zu machen. Wir setzen sie direkt ins Wasser auf die Schräge, sodass ein leichter Druck entsteht.

Sie können sehen, wie die Spitze hier gegen den Stein drückt. Lassen Sie sie für einige Zeit schleifen, mindestens etwa 15 Minuten. Ich lasse sie manchmal sogar etwa eine Stunde lang stehen.

Manchmal werden sie einfach wirklich, wirklich scharf, aber es hängt definitiv von Person zu Person ab, wie lange sie ihre Pipetten schleifen. Gut, hier sehen Sie oben eine Pipette, die gezogen, aber noch nicht geschliffen wurde. Obwohl sie scharf ist, besitzt sie noch keine Öffnung, durch die man die DNA aufnehmen könnte.

Jetzt ist die untere Pipettenspitze abgeschrägt, und Sie können diese schöne winklige Öffnung sehen. Dadurch können Sie Ihre DNA beladen, während die Spitze weiterhin scharf bleibt, sodass Sie injizieren können, ohne Schäden zu verursachen. Gut, jetzt füllen wir unsere Injektionspipetten mit DNA. Es ist wichtig, dass Sie Ihre DNA endotoxinfrei aufbereiten, damit Sie beim Injizieren keine Lipopolysaccharide einspritzen.

Wir nehmen nun unsere DNA und bereiten hier zunächst unser Parafilm vor. Dazu bereiten Sie das Parafilm vor und sammeln Ihre DNA, um sie als kleinen Tropfen auf dieser Parafolienoberfläche abzulegen. Danach nehmen wir – ich nehme normalerweise pro 10 Mikroliter meiner DNA, die ich üblicherweise in einer Menge von etwa 1,5 bis 1,7 Mikrogramm pro Mikroliter verwende – entsprechend vor.

Ich verwende etwa einen Mikroliter dieses Fast-Green-Farbstoffs. Dies dient lediglich dazu, uns die Lokalisation der Injektion zu erleichtern und sicherzustellen, dass die Injektion erfolgreich in den Ventrikel erfolgt ist. Anschließend mische ich diesen Fast-Green-Farbstoff einfach mit meiner DNA.

Danach nehmen Sie Ihre Injektionselektrode und füllen die Pipette, indem Sie den Kolben zurückziehen. Wie hier zu sehen ist, sollte die DNI ziemlich leicht eindringen, wenn die Pipette korrekt abgeschrägt ist und eine ausreichend große Öffnung aufweist. Manchmal müssen Sie den Kolben lediglich hin und her bewegen, um das korrekte Befüllen zu unterstützen.

Und so können Sie die Pipette dann auf diese Weise beladen. Wir haben die DNA vollständig in diese Pipette aufgenommen, und sie ist bereit zur Injektion. Gut, jetzt werde ich das Tier mit Alkohol und Jod abwaschen, aber zuerst möchte ich natürlich einen Zehenquetschtest durchführen, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig narkotisiert ist, und das sieht gut aus.

Ich kann also fortfahren und beginnen. Und ich beginne genauso wie bei den Ratten mit einer Serie von drei, wobei ich zunächst mit Ethanol beginne. Okay, Iod.

Um das Infektionsrisiko zu minimieren, beachten Sie bitte, dass William beim Öffnen der Tücher das Tier mit dem Teil abwischt, der nicht mit seinen Fingern in Berührung gekommen ist, um sicherzustellen, dass die Fläche möglichst sauber bleibt. Zweitens führt er nur ein einziges Abwischen durch, um eine Verteilung von Keimen auf der Bauchoberfläche zu vermeiden.

In Ordnung, gut. Jetzt werde ich etwas aufräumen und dann chirurgische Handschuhe anziehen. In Ordnung. In Ordnung. In Ordnung. Nun werde ich die Maus öffnen, die Uterushörner entnehmen und damit beginnen, indem ich eine kleine Hautfalte anhebe.

Lassen Sie mich hier noch einmal einen Zehenzwicktest durchführen, nur um sicherzustellen, dass sie vollständig narkotisiert ist – das ist gut. Ich zwicke nun die Haut und erzeuge eine kleine Welle, die sich leicht nach oben wölbt, was es mir erleichtert, einen Schnitt zu setzen. Auch hier sollten wir den Einschnitt entlang der Mittellinie des Tieres vornehmen, um Blutgefäße zu vermeiden.

Ich schneide die Haut normalerweise so und trenne sie, um den Muskel freizulegen. Und sobald Sie das getan haben, können Sie leicht die Mittellinie im Muskel erkennen. Sie ist sehr deutlich ausgeprägt.

Ich werde dort etwas Muskelgewebe ergreifen und einschneiden. Das ist eine geeignete Schnittgröße. Größer sollte es eigentlich nicht werden. Dann benutze ich diesen Freer, um Muskel und Haut leicht anzuheben, beiseite zu ziehen und führe hier vorsichtig eine Sonde ein, um den Freer zwischen den beiden Embryonen zu positionieren, sodass ich sie sanft herausziehen kann, ohne sie zu beschädigen.

Manchmal ist es einfacher als andernfalls. So, gut. Einfach vorsichtig hindurchziehen, und sobald ich es durchgezogen habe, kann ich sie einfach so herausdrücken.

Es ist wichtig, die Embryonen niemals zu quetschen, sondern sie lediglich zu führen und sanft zu schieben. Und sobald Sie sie herausgeholt haben, sollten Sie darauf achten, sie stets sehr feucht zu halten. Sie dürfen nicht zulassen, dass sie austrocknen.

Und mal sehen, ich verwende hier wieder meinen Freer, taste mich vor. So, das ist gut.

Und daher möchte ich immer sicherstellen, dass ich sie vollständig entfernt habe, da es leicht ist, eine zurückzulassen, wenn man nicht gezielt nach den Eierstöcken sucht. Ich ziehe sie also erneut sehr vorsichtig heraus, achte dabei jedoch darauf, am Ende die Eierstöcke zu erkennen, die genau dort liegen. Bei diesem Tier sehen sie einfach wie ein kleines Häufchen roten Gewebes aus.

Dann drehen Sie sie um, kehren zurück und überprüfen die andere Seite, und ich kann sie dort sehen. Achten Sie also darauf, sie feucht zu halten, und dann sind wir startklar. Eines möchte ich noch hervorheben: Sie sollten die Embryonen sehr vorsichtig anfassen und ausschließlich die Embryonen greifen.

Greifen Sie nicht dort, wo sich die Blutgefäße befinden, da diese leicht beschädigt werden können und es zu einer Blutung kommen würde, wodurch die Überlebensrate dramatisch sinken würde. Zunächst müssen wir daher bestimmen, wo sich der Kopf im Embryo befindet, den wir mit der DNA injizieren möchten. Dazu drehen wir das Tier vorsichtig und betrachten jeden ventralen Teil.

Bei diesem speziellen Beispiel befindet sich der Kopf rechts von mir und der Schwanz nahe links von mir. Die Mittellinie liegt in dieser Position, und William wird nun das Embryo so positionieren, dass ich es injizieren kann, genau wie bei den Ratten. Ich positioniere sie immer so, dass der Kopf auf der rechten Seite der Mutter liegt, die mir zugewandt ist.

Und damit beginne ich jetzt. Okay, Sie können dort den linken Bodenpfosten sehen, bewegen Sie sich nur ein wenig, und Sie können die Mittellinie dort deutlich erkennen. Ich werde versuchen, es etwas zu drehen, damit es für David in einer guten Position ist.

Okay, und nun werde ich mit der Injektion in das linke Ventrikel fortfahren. Hier können wir sehen, dass das linke Ventrikel vollständig mit DNA gefüllt ist. Wir erkennen, dass sich etwas Farbstoff auf das rechte Ventrikel sowie auf das dritte und vierte Ventrikel ausgebreitet hat.

Das ist ein guter Indikator für eine gute Injektion. Nun werden wir die DNA in die Zellen elektroinjizieren. Die wichtige Überlegung hierbei ist, welche Elektrode die positive Seite ist.

Wir wissen, dass die Sonde mit dem blauen Griff die positive Elektrode ist und dass diese Seite auf der Seite platziert werden sollte, in die wir die DNA elektroporieren möchten. Da wir den linken Ventrikel mit dem größten Teil der DNA injiziert haben, werde ich die positive Elektrode auf der linken Seite wie folgt positionieren. Anschließend werden wir fünf Impulse anwenden, und das war's. Es ist wichtig, dass die Elektroden vollständig mit PBS benetzt sind, damit der Kontakt zwischen den Elektroden und der Gebärmutter gut ist und die Übertragung der elektrischen Impulse angemessen erfolgt.

In Ordnung, da die Untersuchung nun abgeschlossen ist, werde ich die Hörner wieder zurück in die Höhlen schieben. Dazu bewege ich die Hörner vorsichtig zur Seite, greife hier hinein und nehme das Muskel- und Hautgewebe, um es sanft, ganz sanft wieder zurückzuschieben. Gut, schön.

Seien Sie vorsichtig mit der Harnblase. Ich kann die andere Seite machen. Danach geben wir ihr nur ein wenig Schütteln, um sie dort unten etwas zu verstauen.

Kann den Freer etwas stärker verwenden, um sie vorsichtig zu glätten. Danach werde ich mit drei Milliliter Antibiotikum-Antimykotikum spülen. Führen wir einen Zehenquetschtest durch, um sicherzustellen, dass sie vollständig betäubt ist, bevor ich mit der Naht beginne.

Und das sieht gut aus. Ich werde Henry Shine verwenden. Nummer sechs, chirurgischer Faden.

Ich bevorzuge Blockstiche, da ich finde, dass sie haltbarer sind. Wir beginnen damit, indem wir die Nadel dort hindurchführen, sie durchziehen, dreimal herumwickeln, das Ende greifen und es durchziehen.

1, 2, 3, schneiden Sie das Überschüssige ab. Sie sollten gleichmäßig fortsetzen, die Naht straff ziehen und etwas über den Punkt hinausgehen, an dem der Einschnitt endet, um erneut zu verknoten.

Und das mache ich jetzt. Ziehen Sie das Gewebe oder die Haut etwas zurück. Es tritt etwas Blutung auf.

Das sollte in Ordnung sein. Wir haben immer einen Kauter bereit, falls Blutungen auftreten, was gelegentlich vorkommt. Der Kauter eignet sich gut, um diese zu stoppen.

Also gut, ich bin jenseits des Einschnitts. Ich bleibe hier. Ziehen Sie durch, bilden Sie eine Schlaufe, drehen Sie sich dreimal um, greifen Sie die Schlaufe und ziehen Sie sie nach unten.

Drehe dich dreimal im Kreis, greife die Schlaufe, ziehe sie durch und schneide das Überschüssige ab. Lege die Nadel in den spitzenfesten Behälter. Anschließend verwenden wir einen Hefter.

Wir werden bei diesem Tier Heftklammern der Größe sieben verwenden. Bei Mäusen verwenden wir die Größe sieben, bei Ratten die Größe neun.

Nehmen Sie einfach die Haut, ziehen Sie sie leicht nach oben und beginnen Sie zu schneiden. Greifen Sie die Schere erneut. Wir möchten gleichmäßige Abstände bis etwas über den Schnitt hinaus erreichen, und das ist gut.

Im Anschluss die gesamte Region mit einem Alkoholtupfer abwischen. Danach verabreichen wir ihr eine Injektion mit Buprenorphin, um sicherzustellen, dass sie keine Schmerzen verspürt. In den nächsten Tagen werden wir sie weiterhin überwachen, um sicherzustellen, dass sie gesund bleibt und keinerlei Schmerzen hat.

Okay, nachdem wir ihr nun eine Injektion mit Buprenorphin verabreicht haben, bringen wir sie wieder in ihren ursprünglichen Käfig zurück, damit sie sich beim Aufwachen wohlfühlt, stellen diesen in den Inkubator und lassen sie dort etwa 20 Minuten lang, bis sie vollständig wach ist und getrocknet wurde. Wir haben Ihnen gezeigt, wie man eine in vivo-in-utero-Elektroporation von Plasmid-DNA durchführt. Man kann beliebige Moleküle injizieren.

Es könnte kariertes D sein oder es könnten Drogen sein. Wachstumsfaktoren sterben. Wenn diese Moleküle in die Zellen eingebracht werden müssen und sie nicht durch passive Diffusion eindringen, benötigen Sie eine Elektroporation, und dafür müssen die Moleküle geladen sein.

Aber im Grunde sind die Möglichkeiten unbegrenzt. Ein Beispiel für einen alternativen Vektor zur Übertragung von Genen in Zellen sind Viren.

Und in der Vergangenheit haben wir Retroviren verwendet, um GSLs mit DNA zu markieren und zu zeigen, wie sie sich teilen und schließlich zu Neuronen werden, die nach der Markierung der Zellen mit einem Virus oder mittels Elektroporation oder nach Injektion von Medikamenten oder anderen Molekülen in die Großhirnrinde wandern. Dies kann mit mehreren Methoden untersucht werden. Eine davon ist die Zeitrafferaufnahme, bei der Sie organspezifische Schnittkulturen anfertigen.

Und dann verfolgen Sie das Schicksal der Zellen mithilfe eines Mikroskops. Wie Sie hier sehen können, Zeitpunkt 0,0: Wir beginnen mit einem Zellverbund, der sich in unmittelbarer Nähe des lateralen Ventrikels befindet.

Und im Laufe der Zeit können wir beobachten, wie die Zellen aus der ventrikulären Zone auswandern und sich in Richtung der kortikalen Platte bewegen. Außerdem fixieren wir die Embryonen und führen immunhistochemische Untersuchungen durch, um beispielsweise die Verteilung verschiedener Moleküle zu analysieren oder das Schicksal dieser unterschiedlichen Zellen zu bestimmen. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, Elektrophysiologie durchzuführen.

Wir identifizieren die markierten Zellen und untersuchen anschließend ihre elektrischen Eigenschaften. Nun, vielen Dank, dass Sie heute dabei waren. Wir hoffen, dass Ihnen unsere Demonstrationen gefallen haben und dass Sie bei Ihren Experimenten erfolgreich sein werden.

Wenn Sie Fragen haben, zögern Sie nicht, uns zu kontaktieren. Viel Glück.