Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente ist es, adulte Maus-Neurostammzellen mit Hilfe des Neurosphären-Assays zu isolieren und zu erweitern. Dies wird erreicht, indem zunächst adulte Mäusegehirne entnommen werden, gefolgt von der Sektion der Gehirne unter dem Mikroskop, der Entfernung des Septums und der Isolierung von periventrikulärem Gewebe. Dann wird das Gewebe zerkleinert und mit Tryps inisiert, um eine Einzelzellsuspension zu erreichen.

Die Zellen werden dann für die Kultur in Neurostammzellmedien plattiert. Hallo, mein Name ist Hassan Ali und ich arbeite mit Dr. Brent Reynolds am McKnight Brain Institute der University of Florida zusammen. Heute zeige ich, wie man neuronale Stammzellen aus dem Gehirn von erwachsenen Mäusen isoliert und expandieren kann.

Gehen wir ins Labor und legen wir los. Betäuben Sie zwei bis vier erwachsene Mäuse, führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation durch und spülen Sie den Kopf mit 70%igem Ethanol aus. Enthaupte das Tier und mache mit einer kleinen spitzen Schere einen mittleren codalen Rostralschnitt und lege den Schädel frei.

Nach der Entfernung von überschüssigem Gebärmutterhalsgewebe wird ein koronaler Schnitt zwischen den Augenhöhlen gemacht, indem jede Klinge der spitzen Schere in die Augenhöhle gelegt wird. Nehmen Sie das Foramen magnum als Eintrittspunkt und machen Sie einen Längsschnitt durch den Schädel entlang der sagittalen Naht. Seien Sie vorsichtig, um das darunter liegende Gehirn nicht zu beschädigen, indem Sie sicherstellen, dass die Klingen so flach wie möglich bleiben.

Machen Sie auch hier mit dem Rahmen und der Magnum einen Schnitt entlang der seitlichen Seiten des Schädels. Fassen und schälen Sie mit einer gebogenen Pinzette den Schädel über jeder Hemisphäre nach außen, um das Gehirn freizulegen. Schöpfen Sie dann mit einem kleinen Spatel das Gehirn in ein 50-ml-Röhrchen mit Saum.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Gehirne entnommen wurden. Nachdem Sie das Gehirn auf die Haube des PC zwei übertragen haben, entfernen Sie den Saum aus der 50-ml-Tube und ersetzen Sie ihn durch einen frischen Saum, um Verunreinigungen wie Blut und Haare zu entfernen. Führen Sie drei Wäschen auf diese Weise durch.

Übertragen Sie dann die Gehirne in eine 10 Zentimeter große Petrischale, die den Saum enthält. Legen Sie die Gehirne unter das Präpariermikroskop und positionieren Sie jedes Gehirn flach auf seiner ventralen Oberfläche, indem Sie es mit einer fein gebogenen Pinzette von der verwöhnten Seite halten. Entferne mit einer weiteren Pinzette die Riechkolben.

Drehen Sie dann das Gehirn, um den ventralen Aspekt freizulegen, und machen Sie einen koronalen Schnitt senkrecht zum Gehirn auf Höhe des Chiasmas opticus. Legen Sie den Roel-Teil des Gehirns in eine separate Petrischale mit Saum. Platzieren Sie den rostralen Teil des Gehirns so, dass Sie die Schnittfläche sehen können.

Halten Sie mit einer spitzen Pinzette das Gehirn fest und entfernen Sie mit einer weiteren Pinzette das Septum. Identifizieren Sie das Striatum-Corpus, Callosum und den periventrikulären Bereich mit einer feinen Pinzette. Präpariere die dünne Gewebeschicht, die die Seitenventrikel umgibt, von jeder Seite.

Achten Sie darauf, das Salparenchym und das Corpus callosum auszuschließen. Ziehen Sie das präparierte Gewebe in eine neu beschriftete 10 Zentimeter große sterile Petrischale aus Glas. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Gehirne mikropräpariert sind.

Zerkleinern Sie das gepoolte Taschentuch ein bis zwei Minuten lang mit einer Skalpellklinge, bis nur noch sehr kleine Stücke übrig sind. Waschen Sie die Skalpellklinge mit einem ml vorwarmem Trypsin, um anhaftendes Gewebe aufzufangen. Mit einem weiteren ml Trypsin.

Waschen Sie den Boden der Petrischale, um das Gewebe zu sammeln. Übertragen Sie das Gewebe auf eine 15 ml konische Zwei, um kein Gewebe zurückzulassen. Waschen Sie mit dem dritten ml Trypsin den Boden der Petrischale, damit zusätzliches Gewebe in das 15-ml-Röhrchen übertragen werden kann.

Legen Sie den Schlauch für sieben Minuten in ein 37 Grad heißes Wasserbad. Am Ende der enzymatischen Inkubation fügen Sie dem Verdauungsgewebe ein gleiches Volumen Trypsin-Inhibitor hinzu, pipettieren Sie die Suspension auf und ab, um die Inaktivierung von Trypsin sicherzustellen, und pelletieren Sie dann die Gewebesuspension durch Zentrifugation bei 700 U/min oder 110 g für fünf Minuten. Saugen Sie den Überstand ab und entsorgen Sie ihn.

Dann resuspendieren Sie die Zellen in 150 Mikrolitern sterilen Neurostammzell-Basalmedien. Setzen Sie die Pipette auf 200 Mikroliter zurück und legen Sie die Spitze drei- bis siebenmal auf und ab auf und ab, um die Klumpen aufzubrechen, bis Sie eine milchige Suspension erreichen. Übermäßiges Pipettieren kann zum Zelltod führen.

Fügen Sie weitere 9,8 mls Medium hinzu, um ein Gesamtvolumen von 10 ml zu erreichen. Die Suspension wird durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb in ein 50-ml-Röhrchen geleitet, um Rückstände oder nicht zugehörige Teile zu entfernen. Pelletieren Sie dann die Zellen durch Zentrifugation bei 700 U/min und 110 G für fünf Minuten.

Saugen Sie das S Natin ab und reanimation Sie wieder. Suspendieren Sie die Zellen in einem ml vollständigem Neurostammzellmedium. Da wir Zellen aus zwei Gehirnen haben, nehmen Sie neun ml vollständiges Neurostammzellmedium und geben Sie es in ein 15-ml-Röhrchen.

Mischen Sie den einen ml Zellen, der aus den beiden Mäusegehirnen gewonnen wurde. Dann in das 15-ml-Röhrchen mit neun ml vollständigem Neurostammzellmedium umfüllen. Fügen Sie dann BFGF für eine Endkonzentration von 10 Nanogramm pro ml EGF für eine Endkonzentration von 20 Nanogramm pro ml und einen Mikroliter pro ml mit 0,2 % Heparin hinzu.

Mischen Sie dann die Zellen, die sich in vollständigem Neurostammzellmedium befinden. Mit Wachstumsfaktoren werden fünf ml der Suspension in jeden T 25-Kolben gut überführt. Normalerweise werden die aus einem Gehirn gewonnenen Zellen in einen T25-Kolben mit fünf ml vollständigem Neurostammzellmedium plattiert.

Mit Wachstumsfaktoren. Beschriften Sie jeden Kolben und geben Sie ihn sieben bis 10 Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO in einen Inkubator. Beurteilen Sie den Kolben nach sieben bis 10 Tagen unter dem Mikroskop.

Zu diesem Zeitpunkt sollte die Kugel einen Durchmesser von 150 bis 200 Mikrometern haben und bereit für den Durchgang sein. Der Inhalt jedes Kolbens wird aufgefangen und in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen, entfernen Sie den Überstand, mischen Sie das Pellet mit einem ml vorwarmem Trypsin und legen Sie es drei Minuten lang in ein 37 Grad heißes Wasserbad.

Nach dem Trypsin ein gleiches Volumen des Trypsin-Inhibitors hinzufügen und gut zentrifugieren. Entfernen Sie erneut den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem ml vollständigem Nordstammzellmedium. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension und fügen Sie sie zu 90 Mikrolitern Triam Blue hinzu.

Mischen Sie die Suspension gut und geben Sie 10 Mikroliter davon in das Hämozytometer. Führen Sie eine Zellenzählung durch. Übertragen Sie insgesamt 10 mls vollständiges Nurse-Stammzellmedium in ein 15-ml-Röhrchen, um zwei T 25-Kolben plattieren zu können.

Dann werden die Zellen gemischt und eine geeignete Zellmenge hinzugefügt, um eine Gesamtdichte von 50.000 Zellen pro ml oder 250.000 Zellen pro T 25-Kolben zu erreichen. Fügen Sie dann die Wachstumsfaktoren wie zuvor beschrieben hinzu, zu denen E-G-F-B-F-G-F und Heparin gehören. Mischen Sie die Suspension und überführen Sie sie in die Kolben T 25, um ein Gesamtvolumen von fünf MLS pro Kolben zu erhalten.

Zum Schluss stellen Sie die Kolben in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2, um Kugeln zu erzeugen. Dies ist ein Beispiel für eine Primärkultur drei Tage nach dem Plattieren. Dies ist ein Beispiel für die Kultur der primären Neurosphäre Nach sieben Tagen.

Wie Sie sehen können, gibt es Kugeln in verschiedenen Größen. Die Neurosphären sind phasenweise hell oder leuchtend und werden kugelförmiger. Mit zunehmender Größe.

Es gibt auch Trümmer. Die Menge der Ablagerungen hängt von mehreren Faktoren ab, wie z. B. der Mikrodissektion und der Gewebevorbereitung. Trümmer sind häufig in der primären adulten Neurosphärenkultur zu finden.

Dies sind Beispiele für Passagen. Ein Erwachsener Neurosphären nach sieben Tagen. Auch hier gibt es Kugeln unterschiedlicher Größe, aber es gibt viel weniger Trümmer.

Die Peripherie der Kugeln weist Mikro-Spikes auf, die bei gesunden Kugeln sichtbar sind. Lässt man die Kugeln zu groß werden, kann es sein, dass sie durch den Zelltod in der Mitte dunkel werden und nur schwer zu dissoziieren sind. Wir hoffen, dass Sie dieses Video nützlich finden.

Denken Sie daran, die Kugeln nicht zu groß werden zu lassen, da sie sich an das Substrat anheften und sich differenzieren könnten, und es wäre auch schwierig, sie zu subkultivieren. Du musst deine Speere alle sieben bis 10 Tage reichen, abhängig von ihrer Größe und ihrem Aussehen. Viel Glück bei Ihrem Experiment.