Name: Transfektion humaner neuraler Stammzellen mit dem Amaxa Nucleofector (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Transfektion humaner neuraler Stammzellen mit dem Amaxa Nucleofector. Diese Methode ermöglicht Genfunktionsstudien in der Neurobiologie mit hoher Effizienz und Zellviabilität.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Philip H. Schwartz des National Human Neural Stem Cell Ressourcen auf die Kinder s Hospital, Orange County Forschungsinstitut für die Bereitstellung hNSPC Kulturen anzuerkennen.

Hinweis: Beachten Sie die Passagierung Nervenstammzellen Artikel ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) und die Counting Nervenstammzellen Artikel ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262</a> ) zu lernen, wie resuspendieren und zählen hNSPCs. Vorbereitung <ol><li> Stellen Sie sicher, dass es viele von Zellen für die Transfektion (mehrere Millionen Zellen pro DNA transfiziert werden). </li><li> Coat ein Gewebe Kulturschale, in die die transfizierten Zellen ausgesät, wird mit 10 pg / ml humanem Fibronectin in der Nacht vor der Transfektion werden. Kurz vor dem Start der Transfektion Protokoll, entfernen Sie die Fibronektin, spülen Sie die Schale mit PBS, Ort und Kulturmedien in die Schüssel. Lassen Sie die Schale in den 37 ° C Gewebekultur-Inkubator für die Medien warm. Auch Platz 1 ml Kulturmedium in den Inkubator zur Vorwärmung auf 37 ° C. </li><li> Legen Sie die DNA (s) zum transfiziert werden, und die Transfektion Lösung (von Amaxa), auf Eis. </li></ol> Transfektion <ol><li> Wash eine definierte Anzahl von Zellen mit PBS (verwenden wir im Allgemeinen ~ 5 x 106 Zellen pro Transfektion). Pellet die Zellen durch Zentrifugation (1000 rpm (~ 200xg) für 5 Minuten), so viel PBS wie möglich zu entfernen, und das Zellpellet in 100 ul der Transfektion Lösung mit der Transfektion Kit zur Verfügung gestellt. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Add 5 ul der DNA (~ 5-10 ug DNA pro Transfektion) zur Zellsuspension und vorsichtig mischen. </li><li> Mit dem Amaxa Mini-Pipette die Zell-DNA-Mix in den Amaxa Transfektion Küvette. Vergewissern Sie sich, 1 ml vorgewärmtes Kulturmedium für den nächsten Schritt. Entfernen Sie außerdem die Zelle Gericht mit Kulturmedien aus dem Inkubator und legen Sie sie in der Gewebekultur Kapuze. </li><li> Setzen Sie die Küvette in die Nucleofector, drehen Sie das Rad im Uhrzeigersinn, und wählen Sie Programm &quot;A-033&quot;. Drücken Sie die Eingabetaste. </li><li> Eine erfolgreiche Transfektion wird durch die Anwesenheit eines sehr dichten Schicht von Blasen auf der Oberseite der Lösung in der Küvette angegeben. Add 500 ul warmen Medien in die Küvette, und mit dem Amaxa Mini-Pipette die transfizierten Zellen in die Schüssel mit vorgewärmten Medien. Spülen Sie die Küvette mit mehr warme Medien und fügen Sie die auf die gleiche Gericht zu spülen. Die Schale mit den Zellen in die 37 ° C Gewebekultur-Inkubator. </li></ol>

<ol><li>Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+non-viral+method+for+gene+transfer+into+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New non-viral method for gene transfer into primary cells.</a> Methods. 33, 151-163 (2004).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a> (2007).</li>
</ol>

Dieses Protokoll beschreibt eine relativ schnelle und effiziente Verfahren für die Transfektion hNSPCs. Mit diesem Verfahren haben wir zunächst Transfektionseffizienz von ~ 35% erhalten. Zellen, die durch dieses Verfahren transfizierten kann für kurzfristige Studien (transient transfizierten Zellen) oder für eine längerfristige Studien verwendet werden, wenn eine Auswahl Agent wird verwendet, um eine stabil transfizierte Bevölkerung zu generieren. Wir haben stabil transfizierten Zellen, in denen 70% der Zellen ~ drücken die exogene Protein ...

<table><tbody><tr><td>Das Nucleofector-Gerät</td><td>Werkzeug</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Maus-neurales Stammzell-Nucleofector-Kit</td><td>Reagenz</td><td>Amaxa</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr></tbody></table>

transfektion humaner neuraler stammzellen mit dem amaxa nucleofector

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfektion von primären Säugerzellen neuronalen Zellen, wie die menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs), mit häufig verwendeten kationischen Lipid Transfektionsreagenzien oft in armen Lebensfähigkeit der Zellen und geringe Transfektionseffizienz geführt. Andere mechanische Verfahren zur Einführung eines Gens von Interesse, wie eine Gen-Kanone oder Mikroinjektion werden zudem durch eine schlechte Lebensfähigkeit der Zellen und niedrigen Zahlen von transfizierten Zellen begrenzt. Die Strategie der Verwendung von viralen Konstrukte eines exogenen Gens in primären Zellen einzuschleusen wurde sowohl von der Höhe der Zeit und Arbeit erforderlich, um virale Vektoren und mögliche Sicherheitsprobleme zu schaffen gezwungen worden. Wir beschreiben hier eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Transfektion von hNSPCs mit amaxas Nucleofector Gerät und Technologie mit elektrischem Strom Parameter und Puffer-Lösungen speziell für die Transfektion von neuronalen Stammzellen optimiert. Unter Verwendung dieses Protokolls haben wir erste Transfektionseffizienz von ~ 35% erreicht und ~ 70% nach stabiler Transfektion. Das Protokoll beinhaltet die Kombination einer hohen Anzahl von hNSPCs mit der DNA in den entsprechenden Puffer durch Elektroporation mit dem Nucleofector Gerät gefolgt transfiziert werden.

Die Einführung eines Gens in eine Zelle ist eine leistungsfähige Methode für die Aufklärung ihrer Funktion in vivo. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Transfektion von einer Kultur des menschlichen neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) mit Hilfe der Elektroporation Nucleofector Apparat Amaxa gemacht.

Transfektion humaner neuraler Stammzellen mit dem Amaxa Nucleofector

Transfektion primärer neuronaler Säugetierzellen, wie beispielsweise menschlicher neuraler Stamm-/Vorläuferzellen (hNSPCs), mit gängigen kationischen Lipid-Transfektionsreagenzien ...

Hallo, ich bin Steve. Ich arbeite im Labor von Dr. Flanagan an der Abteilung für Pathologie an der uc, Irvine. Heute zeige ich Ihnen, wie man humane neuronale Vorläuferzellen mit einem Maxis-Kernfaktor transfiziert.Zunächst benötigen Sie eine große Menge an Zellen. Ich würde sagen, mindestens einen konfluenten T-25-Flasche, da dieses Protokoll eine sehr hohe Zelldichte erfordert; Sie benötigen also mindestens eine Million Zellen. Zuerst werde ich die Zellen mithilfe eines Zell-Dissociationspuffers von der Oberfläche lösen und anschließend zählen.Und für dieses Verfahren verweise ich auf mein Verpackungsprotokoll. Der Grund, warum ich für meine Transfektionsexperimente ein Amaxa bevorzuge, liegt darin, dass Amaxa maßgeschneiderte Transfektionsprotokolle für spezifische Zelltypen entwickelt, im meinem Fall für neuronale Stammzellen. Und es funktioniert hervorragend.Es ergibt eine sehr hohe Transfektions-Effizienz und eine sehr hohe Zellviabilität. Und los geht's. Nun bin ich bereit, eine Transfektion durchzuführen.Für diese Transfektion habe ich meine Zellkulturschale bereits über Nacht mit Fibrin beschichtet. Danach habe ich etwas Wachstumsmedium hinzugefügt. Im Moment befindet sie

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Trotz der jüngsten Fortschritte in der Gentechnik, bleibt Transfektion von humanen embryonalen Stammzellen (hES) ein launischer Prozess. Nach unserem Kenntnisstand haben systematische und effiziente Methoden, um Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) transfizieren nicht berichtet worden. Hier beschreiben wir robuste Protokolle effizient transfizieren und nucleofect menschlichen iPS.

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dieses Video beschreibt eine präzise Genom-Editing-Technik in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen oder hiPSCs, bei der TALENs verwendet werden, um doppelsträngige Brüche an einem Zielort zu erzeugen, die eine homologiegerichtete Reparatur für die Genintegration von Fluoreszenzproteinen induzieren.

TALEN-vermittelte gezielte Genintegration: Verwendung von sequenzspezifischen Nukleasen für die präzise Insertion von fluoreszierenden Proteingen in hiPSCs

Dieses Video zeigt die direkte Reprogrammierung von genetisch veränderten hämatopoetischen Vorläuferzellen in neuronale Stammzellen. Transkriptionsfaktoren, die von hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert werden, lösen eine Kaskade von molekularen Ereignissen aus, die ihre Umwandlung erleichtern. Weitere spezifische Medien werden verwendet, um induzierte neuronale Stammzellen zu selektieren und zu züchten.

Direkte Reprogrammierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen in neurale Stammzellen

Dieses Video zeigt den Prozess der Induktion menschlicher pluripotenter Stammzellen zur Differenzierung in Neuronen durch Transfektion mit gentechnisch veränderten Lentiviren, die ein neurogenes Transkriptionsfaktor-Gen tragen, unter der Kontrolle eines Tetracyclin-responsiven Elements, gefolgt von einer Behandlung mit einem Tetracyclin-Derivat und einem Reifungsmedium.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in Neuronen mit gentechnisch veränderten Lentiviren

Reporterzelllinien bieten ein Mittel, um zu visualisieren, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse aus heterogenen Populationen. Jedoch Gen-Targeting unter Verwendung von herkömmlichen homologen Rekombination in embryonalen Stammzellen äußerst ineffizient. Hier beschreiben wir Targeting ZNS Mittelhirn spezifischen Transkriptionsfaktor PITX3 Ortes mit EGFP mit Zink-Finger-Nuklease verbesserte homologe Rekombination.

Zinkfinger-Nuklease Verbesserte Gene Targeting in humanen embryonalen Stammzellen

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

TALEN-vermittelte Geneditierung am Safe-Harbor-AAVS1-Locus ermöglicht eine hocheffiziente Transgen-Addition in humanen iPSCs. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Vorbereitung von iPSCs für die TALEN- und Donorvektorverabreichung, zur Transfektion von iPSCs und zur Auswahl und Isolierung von iPSC-Klonen, um eine gezielte Integration eines GFP-Gens zur Erzeugung von Reporterlinien zu erreichen.

Transfektion, Selektion und Colony-Picking für Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit einem GFP-Gen in die AAVS1 Safe Harbor TALEN ziel

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur nahtlosen Genbearbeitung in humanen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines piggyBac-basierten Donorplasmids und der Cas9-Nickase-Mutante. Zwei Punktmutationen wurden in Exon 8 des Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Locus (HNF4α) in humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) eingeführt.

Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

Hier beschreiben wir ein Nukleofektionssystem, das die Effizienz der Genübertragung in expandierten neuralen Stammzellen (NSCs) verbessern soll, die aus der adulten subventrikulären Zone von Mäusen isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Genstörung in NSCs signifikant verbessert, die Wirksamkeit traditioneller Transfektionsprotokolle übertrifft und die Überlebensrate der Zellen erhöht.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Entwicklung chemisch umprogrammierter Stammzellen, um eine präzise neuronale Modulation zu erreichen, indem diese Zellen in dopaminerge Vorläuferzellen differenziert, in Mausmodelle der Parkinson-Krankheit transplantiert und verhaltensbezogene und elektrophysiologische Ergebnisse ausgewertet werden, um die erfolgreiche Integration und funktionelle Wirksamkeit der transplantierten Zellen zu bestätigen.

Chemogenetische Regulation in reprogrammierten Stammzell-abgeleiteten Vorläuferzellen bei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen

Erfahren Sie die effiziente Transfektion humaner neuraler Stammzellen mit dem Amaxa Nucleofector. Diese Methode ermöglicht Genfunktionsstudien in der Neurobiologie mit hoher Effizienz und Zellviabilität.

Transfektion humaner neuraler Stammzellen mit dem Amaxa Nucleofector

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