Transfektion humaner neuraler Stammzellen mit dem Amaxa Nucleofector

Hallo, ich bin Steve. Ich arbeite im Labor von Dr. Flanagan an der Abteilung für Pathologie an der uc, Irvine. Heute zeige ich Ihnen, wie man humane neuronale Vorläuferzellen mit einem Maxis-Kernfaktor transfiziert.

Zunächst benötigen Sie eine große Menge an Zellen. Ich würde sagen, mindestens einen konfluenten T-25-Flasche, da dieses Protokoll eine sehr hohe Zelldichte erfordert; Sie benötigen also mindestens eine Million Zellen. Zuerst werde ich die Zellen mithilfe eines Zell-Dissociationspuffers von der Oberfläche lösen und anschließend zählen.

Und für dieses Verfahren verweise ich auf mein Verpackungsprotokoll. Der Grund, warum ich für meine Transfektionsexperimente ein Amaxa bevorzuge, liegt darin, dass Amaxa maßgeschneiderte Transfektionsprotokolle für spezifische Zelltypen entwickelt, im meinem Fall für neuronale Stammzellen. Und es funktioniert hervorragend.

Es ergibt eine sehr hohe Transfektions-Effizienz und eine sehr hohe Zellviabilität. Und los geht's. Nun bin ich bereit, eine Transfektion durchzuführen.

Für diese Transfektion habe ich meine Zellkulturschale bereits über Nacht mit Fibrin beschichtet. Danach habe ich etwas Wachstumsmedium hinzugefügt. Im Moment befindet sie sich im Inkubator und wartet darauf, die Zellen aufzunehmen.

Außerdem habe ich alle meine Reagenzien, meinen DNA-Vektor und die Transfektionslösung vorbereitet. Sie warten alle hier auf Eis. Und ich bin bereit, die Transfektion zu beginnen.

Das ist also der M-max-Kernfaktor, und bevor ich ihn in den Haube stelle, werde ich ihn mit 70 % Ethanol desinfizieren und anschließend mit einem Papiertuch abwischen. Ich habe gerade meine Zellen gezählt, sodass ich insgesamt 4 Millionen Zellen habe, und sie ausgesät. Nun bin ich bereit, mit der Transfektion zu beginnen.

Zunächst werde ich das Medium entfernen, in dem sie sich befinden. Hier habe ich meinen Zellpellet, und ich werde das darin enthaltene Medium abpipettieren. Ich werde versuchen, so viel Medium wie möglich zu entfernen, da ich keine Proteine oder ähnliche Substanzen im Transfektionsmedium haben möchte, da diese das Transfektionsprotokoll beeinflussen könnten.

Ich habe also fast das gesamte Medium entfernt und werde nun das Zellpellet in hundert Mikrolitern dieser speziell formulierten nukleären Lösung für neuronale Stammzellen der Maus resuspendieren. Mxa stellt eine Transfektionslösung zum Transfizieren neuronaler Stammzellen der Maus her, bietet jedoch keine für humane neuronale Stammzellen an. Wir haben jedoch festgestellt, dass die für Mauszellen geeignete Lösung sehr gut funktioniert. Daher werde ich hundert Mikroliter dieser nukleären Wirkstofflösung für neuronale Stammzellen der Maus abmessen.

Und ich werde mein Zellpellet darin gut wiederaufnehmen, sodass keine Zellklumpen mehr vorhanden sind. Im Wesentlichen soll ich eine homogene Zellsuspension erhalten. Dazu werde ich etwa 10 Mal auf- und abpipettieren.

Ich denke, ich habe jetzt eine ziemlich homogene Mischung und werde sie nun in ein 1,5-ml-Eppendorf-Gefäß umpipettieren. Ich verwende eine P-1000-Pipette und achte darauf, die gesamte Lösung aufzunehmen. Jetzt habe ich meine 4 Millionen Zellen resuspendiert in Maus-Neu-Transfektionslösung, und nun werde ich fünf Mikroliter meines Vektors hinzufügen.

Ich habe es die ganze Zeit über auf Eis gehalten, bis jetzt. Als Erstes werde ich fünf Mikroliter abmessen. Nun werde ich es der Zellsuspension hinzufügen.

Jetzt werde ich einen P-200 auf etwa 50 Mikroliter eingestellt verwenden und die Zellen gründlich mit dem Vektor mischen. Ich werde den Ansatz also zehnmal auf- und abpipettieren. Okay, das ist fertig.

Und ich, ich bin bereit zur Transfektion. Ich werde also eine neue Ettte öffnen. Außerdem werde ich eine spezielle Pipette holen, die von Amaxa bereitgestellt wird.

Ich werde nun die Kappe entfernen und vorsichtig die Mischung hochziehen. Dann werde ich die Pipette vollständig in das Vial einführen und die Lösung langsam herausdrücken. Nun schalte ich den Max-Kernfaktor ein und stelle diesen auf 33 0 3 3 ein, danach drücke ich die Eingabetaste.

Dann werde ich die Küvette in den Küvettenhalter einsetzen und anschließend das Rad drehen. Jetzt bin ich bereit zur Transfektion. Doch zuvor stelle ich sicher, dass warmes Medium bereitsteht, das unverzüglich den transfizierten Zellen zugegeben werden kann. Dies trägt dazu bei, die Zellviabilität zu erhöhen, wenn ich das warme Medium direkt nach der Transfektion in die Küvette gebe.

Ich werde nun eine P1000 vorbereiten. Außerdem hole ich das Kulturmedium, das sich gerade im Brutschrank befindet, um die Zellen sofort in das Medium überführen zu können. Jetzt drücke ich erneut die Eingabetaste, und der Vorgang ist abgeschlossen.

Und die erfolgreiche Transfektion, wie Sie hier sehen können, erkennen Sie an dieser sehr dicken Blasenschicht, die auf eine erfolgreiche Transfektion hinweist. Ich werde nun 500 Mikroliter vorgewärmtes Medium in das Vial geben. Ich füge also mehr Medium hinzu, das die Zellen dringend benötigen, und werde dieselbe MX-Pipette verwenden, um die Zellen aus dem Vial zu entnehmen.

Sie sind also gerade sehr stark belastet. Deshalb werde ich sie direkt in warmes Medium, mehr warmes Medium, geben. Und schließlich, der letzte Schritt: Ich werde das Q vete mit etwas zusätzlichem vorgewärmtem Medium spülen, um sicherzustellen, dass ich alle diese Zellen herausbekomme, und es dann in dasselbe Loch L geben und die Platte sofort in den Inkubator stellen.

In diesem Bild sehen wir humane neuronale Vorläuferzellen, die mit einem Zugangskernfaktor transfiziert und auf karierten Deckgläsern ausgesät wurden. Schon zwei Tage nach der Transfektion beobachten wir eine Transfektionseffizienz von etwa 50 %, die anhand der GFP-Expression sichtbar wird. Heute habe ich Ihnen gezeigt, wie man humane neuronale Vorläuferzellen mithilfe des Xis-Kernfaktors transfiziert.

Viel Erfolg mit Ihrer Transfektion.