Name: Mechanische Stimulation von Stammzellen unter Verwendung cyclischer uniaxiale Dehnung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 12 s
Description: Erfahren Sie die mechanische Stimulation von Stammzellen mittels zyklischer uniaxialer Dehnung mit einem maßgeschneiderten Bioreaktor. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mechanischer Einflüsse auf das Zellverhalten für Anwendungen in der regenerativen Medizin.

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Tag 0 - Sterilisation vor dem Tag des Experiments <ol><li> Legen Sie Material in Kunststoff-Wanne und sterilisieren mit 70% Alkohol für 2 Stunden: <ul><li> Chambers </li><li> Deckel </li><li> Frames (alle 3 Teile) </li><li> Schrauben </li><li> Gummidichtungen </li><li> Zange </li><li> Schere </li><li> Hex-Schlüssel </li></ul></li><li> Saubere Membranen mit Aquet Seife und destilliertem Wasser. </li><li> Mit Ultraschall-Membranen in 70% igem Alkohol für 10 Minuten. </li><li> Legen Sie die sauberen Membranen in Kunststoff-Quadrat Gerichte. Bei Verwendung von gemusterten Membranen, sicherzustellen, dass die strukturierte Seite ist offen (Spray Alkohol auf der einen Seite der Membran und achten Sie auf die Flüssigkeit zu heruntergekommen die Rillen). </li><li> Lassen Membranen in 70% igem Alkohol für 2 Stunden abgedeckt. </li><li> Package Handschuhe in Alufolie zum Autoklavieren morgen früh. </li><li> Machen Sie 2% (Gewicht / Volumen) Gelatine-Lösung (2g/100mL) in destilliertem Wasser zum Autoklavieren morgen. </li><li> Nach dem 2 Stunden Sterilisation in 70% Alkohol, statt alle Polymer-Materialien und Membranen (non-autoklavierbar Materialien) in die Haube über Nacht UV: <ul><li> Chambers </li><li> Deckel </li><li> Frames (alle 3 Teile) </li><li> Membranen </li></ul></li><li> Pack restlichen Materialien in autoklavierbar Tasche: <ul><li> Schrauben </li><li> Gummidichtungen </li><li> Zange </li><li> Schere </li><li> Hex-Schlüssel </li></ul></li></ol> Tag 1 - Montage von Stretch-Kammern <ol><li> Autoclave Zangen, Scheren, Inbusschlüssel, Schrauben, Dichtungen, Handschuhe und Gelatine mit kleinen Autoklaven bei 240 ° F für 20 Minuten insgesamt </li><li> Entfernen Membranen aus UV und behandeln mit O 2-Plasma (gemusterten Seite nach oben) für ~ 1 Minute. </li><li> In TC Haube, Deckel gemusterte Bereich der Plasma behandelten Membranen mit Gelatine. Coat 30 für Minuten unter UV-Licht. </li><li> Waschen Sie jede Membran mit PBS 2X. Nach dem 2. waschen, verlassen einige PBS auf den Membranen zu halten rutschig, zur leichteren Montage in die Kammern. (Sollte auch dieses PBS, um die Dichtungen für einfachere Montage schmieren). </li><li> Montieren Membranen in Kammern (Verschleiß autoklaviert Handschuhe während der Montage) <ol><li> Verbinden Sie die beiden wichtigsten Stücke des Rahmens mit einer einzigen Schraube. </li><li> Klappen Sie den Rahmen um und legen eine Membran auf der Oberseite, so dass die Gelatine beschichtete Seite zugewandt dem Rahmen (der gemusterten Fläche sollte in der Mitte sein). </li><li> Befestigen Sie die Membran mit dem Rahmen mittels einer Dichtung auf jeder Seite. </li><li> Drücken Sie die Dichtungen in, mit sanftem, gleichmäßigem Druck, damit sie nicht reißen die Membran. </li></ol></li><li> Bringen Sie montierten Rahmen, um T-bar. </li><li> Klappen Sie den Rahmen und Ort in die Kammer auf den Kopf. UV Rückseite des Rahmens und die Membran für 30 Minuten </li><li> Klappen Sie den Rahmen wieder, und schrauben in Kammern (keine Änderung für die Steuerung Kammer, sondern auch für Stretch-Kammer, müssen zwei Schrauben zu verwenden, um das Endstück des Rahmens auf den Boden der Kammer legen und müssen die einzelne Schraube, die sich entfernen Halten die beiden Stücke des Rahmens zusammen). UV Vorderseite für 30 min. Sicherstellen, dass die Membranen sind völlig trocken sein, bevor Sie mit dem nächsten Schritt, oder aber die Zell-Lösung abrutschen kann bei der Aussaat. </li><li> Seed-Zellen. Fläche von 1 Platte = Fläche von 3 Membranen, so verwenden 1 / 3 einer konfluenten Platte pro Membran. Verwenden Sie 1 ml Lösung pro Zelle Membran. Nicht mehr als 1,5 ml wird schwierig sein, Lösung zu halten auf. Setzen Sie Zelle Lösung nur auf gemusterten Fläche, und verwenden Sie die Pipettenspitze auf die Lösung zu verstreuen. Abdeckung Kammern und lassen Zellen für 30 Minuten RT in der Motorhaube befestigen. </li><li> Bewegen Kammern Inkubator und lassen Zellen für 1 Stunde anzuhängen. Seien Sie SEHR vorsichtig bewegt die Kammern zu verhindern, dass Zell-Lösung abrutschen! Die Zellen in dieser Kammer wird ruiniert, wenn die Lösung fällt an dieser Stelle. </li><li> Zurück Kammer Kapuze und fügen 20 mL Medien. </li><li> Legen Kammern in Alkohol gereinigt Wanne, die mit Alufolie (auch mit Alkohol besprüht) abgedeckt ist. Bewegen Kammern Inkubator (10% CO 2) zu dehnen. </li><li> Sichere Kammern in Stretch-Maschine. Lassen Zellen über Nacht weiter befestigen, und starten Strecke auf den nächsten Tag. (Anmerkung: beim Anlegen Kammern in Stretchmaschine, denken Sie daran, die Maschine in die &quot;Null&quot; Position zu verriegeln, bevor Kammern, und ziehen Sie dann das Gummiband um die Gänge Vergessen Sie nicht, die Gänge vor dem Start der Maschine zu entsperren.). </li></ol>

<ol><li>Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vacuum-operated+stress-providing+instrument+that+applies+static+or+variable+duration+cyclic+tension+or+compression+to+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro.</a> J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).</li>
<li>Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+equiaxial+and+uniaxial+strain+on+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).</li>
<li>Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+mechanosensing+by+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).</li>
</ol>

Banes et al. erstmals über die Verwendung eines Systems für die mechanische Stimulation der Zellen in vitro durch eine flexible elastomere Substrat mechanische Kraft auf die Zellen 1 liefern. Seit dieser Zeit haben viele Variationen dieses Design konzipiert und genutzt werden. Verschiedene mechanische Dehnung Systeme sind kommerziell unter dem Namen &quot;Flexercell&quot; (Flexcell International Corp) verfügbar, während einige Labore custom-built-Geräte verwenden. In diesem Video-Protokoll haben wir die Einrichtung und Nutzung ei...

Hinweise auf Medien: Diese einachsigen Dehnung Experimente sind anfällig für Verschmutzung durch die Komplexität der Bioreaktor-Setup. Um dem entgegenzuwirken, haben wir verschiedene Kombinationen von Antibiotika und Antimykotika versucht. Die 1% Fungizone in der Regel notwendig, zusammen mit einer Kombination von Antibiotika. Entweder verwenden Sie einen Pen / Strep Kombination oder eine Kombination von Kanamycin und Gentamicin (aber versuchen Sie nicht mit einer Kombination / Cocktail aus drei oder mehr Antibiotika zusammen, wie es zu resistenten Mutanten Bakterien führen können, und kann auch schädlich für die Zellen) .

mechanische stimulation von stammzellen unter verwendung cyclischer uniaxiale dehnung

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

Die Rolle der mechanischen Kräfte in der Entwicklung und Pflege von biologischen Geweben ist gut dokumentiert, darunter mehrere mechanisch reguliert Phänomene wie Knochenumbau, Muskelhypertrophie und glatten Muskelzellen Plastizität. Allerdings sind die beteiligten Kräfte oft sehr komplex und schwer zu überwachen und zu steuern in vivo. Um besser zu untersuchen, die Auswirkungen der mechanischen Kräfte auf Zellen, haben wir ein in vitro Verfahren zum Aufbringen von einachsigen zyklischen Zugbelastung auf adhärente Zellen auf elastischen Membranen kultivierten entwickelt. Diese Methode verwendet einen speziell entworfenen Bioreaktor mit einem motorisierten cam-Rotor-System, um die gewünschte Kraft aufbringen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Video-Protokoll zeigt, wie die verschiedenen Komponenten eines jeden &quot;stretch Kammer&quot;, auch in diesem Fall, eine Silikon-Membran mit mikrostrukturierten Topographie zu orientieren die Zellen mit der Richtung des Stammes zu versammeln. Wir beschreiben auch Verfahren zur Entkeimung von den Kammern, säen die Zellen auf der Membran, Verriegelung der Kammer in den Bioreaktor und die Anpassung der mechanischen Parameter (zB Größe und Geschwindigkeit der Belastung). Die Verfahren in diesem speziellen Protokoll dargelegt sind spezifisch für die Aussaat von humanen mesenchymalen Stammzellen auf Silikon-Membranen mit 10 pm breiten Kanälen parallel zur Richtung der Dehnung. Doch die Methoden und Materialien in diesem System vorgestellt flexibel genug, um eine Reihe von Variationen zu diesem Thema aufnehmen, sind: Dehnrate, Größe, Dauer, Zelltyp, Membran-Topographie, Membran-Beschichtung, etc. können alle auf die gewünschte Anwendung oder zugeschnitten werden Ergebnis. Dies ist eine robuste Methode zur Untersuchung der Auswirkungen von einachsigen Zugbelastung aufgebracht, um Zellen in vitro.

Es wird allgemein verstanden, dass mechanische Kräfte in den Körper kann die Zelldifferenzierung und Zellteilung beeinflussen. Hier präsentieren wir ein Video-Protokoll, das die Verwendung eines speziell angefertigten Bioreaktor für die Bereitstellung von einachsigen zyklischen Zugbelastung auf Zellen auf flexible Substrate mikrostrukturierten kultivierten Stammzellen.

Mechanische Stimulation von Stammzellen unter Verwendung cyclischer uniaxiale Dehnung

Die Rolle mechanischer Kräfte bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung biologischer Gewebe ist gut dokumentiert, einschließlich mehrerer mechanisch regulierter ...

Hi, ich bin Song Li. Ich bin außerordentlicher Professor in der Abteilung für Bioingenieurwesen an der UC Berkeley. Und ich bin Kyle Kapinsky. Ich bin Doktorand ebenfalls im Fachbereich Bioingenieurwesen an der UC Berkeley.Heute stellen wir ein Protokoll zur mechanischen Stimulation von Stammzellen mittels zyklischer einachsiger Dehnung vor. Die Forschung in unserem Labor konzentriert sich auf Zell- und Gewebeengineering, insbesondere im kardiovaskulären System. Wir interessieren uns für die mechanische Biologie von Stammzellen, da es einige potenzielle Anwendungen gibt.Erstens möchten wir die Wirkung mechanischer Faktoren auf die Entwicklung, beispielsweise die embryonale Entwicklung, verstehen. Zweitens interessiert uns die Steuerung der Differenzierung von Stammzellen in vitro oder in einem Darmreakt. Und drittens untersuchen wir, wie Stammzellen in vivo auf kardiovaskuläre mechanische Faktoren reagieren, zum Beispiel nach einer Transplantation.Um all diese Dinge zu untersuchen, verfügen wir über einen speziell konstruierten Bioreaktor, in dem Zellen auf elastische Membranen ausgesät und diese anschließend über einen definierten Zeitraum, mit einer definierten Dehnung und einer

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Biosynthese von knorpeligen extrazellulären Matrix durch Chondrocyten können durch Einwirkung mechanischer Reize beeinflußt werden. Diese Methode beschreibt die Technik der Anwendung dynamisch Druckspannungen zu Chondrozyten in 3D-Konstrukte und die Auswertung der induzierten Veränderungen in Chondrozytenmetabolismus verkapselt.

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Dieses Manuskript stellt eine Technik, um auf adhärenten Zellen oder Gewebe gelten oder freiKräfte mit unidirektionalen Stretching.

Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran

Wir stellen in diesem Artikel ein neues Streck Plattform, die verwendet werden können, um einzelne Zellantworten auf komplexe anisotropen biaxiale mechanische Verformung zu untersuchen und zu quantifizieren, die mechanischen Eigenschaften von biologischen Geweben.

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Ein neuartiges Bildgebungsprotokoll wurde entwickelt, das einen speziellen motorbetriebenen mechanischen Aktuator verwendet, um die Messung von Echtzeitreaktionen auf mechanische Dehnung in lebenden Zellen zu ermöglichen. Das für die Mechanobiologie relevante System kann Dehnungen von bis zu 20 % aufbringen und ermöglicht gleichzeitig eine Bildgebung nahezu in Echtzeit mit konfokaler oder Rasterkraftmikroskopie.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

Dieser Artikel stellt eine einfache Methode zur Bereitstellung von nicht-kontinuierlichen gradienter statische Belastungen auf eine konzentrische Zelle beladenen Hydrogel, Ausrichtung der Zellen für das Tissue Engineering zu regulieren.

Gradient Stamm Chip für anregende zellulären Verhaltensweisen in Zelle beladenen Hydrogel

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ausbildung einer Zellpopulation, die mit elektrischen und mechanischen Reizen emuliert kardiale Physiologie. Diese elektromechanische Stimulation erhöht das Cardiomyogenic Potenzial der behandelten Zellen und ist eine vielversprechende Strategie für weitere Zelltherapie, Krankheit Modellierung und Drogen-Screening.

Gleichzeitige elektrische und mechanische Stimulation, Cells Cardiomyogenic Potenzial zu steigern

Ein dreidimensionales uniaxiales mechanisches Stimulations-Bioreaktorsystem ist ein idealer Bioreaktor für tenogen-spezifische Differenzierung von Sehnenstammzellen und Neotendonbildung.

Anwendung eines dreidimensionalen uniaxialen mechanischen Stimulations-Bioreaktorsystems zur Induzieren tenogener Differenzierung von tendonabgeleiteten Stammzellen

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von iTenozyten durch die Erzeugung von iPSC-abgeleiteten mesenchymalen Stromazellen mit kombinierter Überexpression von Sklerose unter Verwendung eines lentiviralen Vektors und uniaxialer Streckung über einen 2D-Bioreaktor.

Generierung von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten iTenozyten durch kombinierte Sklera-Überexpression und uniaxiale 2D-Spannung

Hier stellen wir ein neuartiges Gerät vor, das isotrope und uniaxiale Dehnungswellenformen auf Zellen anwendet und gleichzeitig Kultur auf Substraten mit abstimmbarer Steifigkeit und anpassbaren Proteinmatrizen unterstützt. Diese einfache, wirtschaftliche Plattform ermöglicht es Forschern, zu untersuchen, wie mechanische Hinweise die zelluläre Funktion sowohl in grundlegenden Studien als auch in krankheitsrelevanten Kontexten regulieren.

Eine neuartige Plattform für in vitro zelluläre Dehnung und Bildgebung

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Erfahren Sie die mechanische Stimulation von Stammzellen mittels zyklischer uniaxialer Dehnung mit einem maßgeschneiderten Bioreaktor. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mechanischer Einflüsse auf das Zellverhalten für Anwendungen in der regenerativen Medizin.

Mechanische Stimulation von Stammzellen unter Verwendung cyclischer uniaxiale Dehnung

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