Respirometrische Oxidative Phosphorylierung Assessment in Saponin-permeabilisierten Cardiac Fibers

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Saponin-permeabilisierte Herzmuskel­fasern für polaro­graphische Messungen vorzubereiten. Dies wird zunächst durch die Entnahme des Herzens aus der Maus erreicht. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Herzmuskel­faser­bündel mechanisch herzustellen, die maximal sechs bis acht locker miteinander verbundene Fasern enthalten.

Anschließend werden die Herzbündel chemisch mit Saponin permeabilisiert. Danach werden die Herzbündel von verbliebenem Saponin und allen restlichen Metaboliten gewaschen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Einblicke in die mitochondriale oxidative Phosphorylierung durch polarographische Messungen ermöglichen.

Hallo, ich bin Curtis Huey aus dem Labor von Dr. Jane Sheer am Department für Biochemie und Molekularbiologie der University of Calgary. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Saponin-permeabilisierten Herzmuskelsträngen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die mitochondriale oxidative Phosphorylierung in situ zu untersuchen.

Beginnen wir also. Entnehmen Sie zu Beginn des Verfahrens ein marines Herz und legen Sie es in eine Petrischale mit der RP-Lösung auf Eis. Entfernen Sie unter dem Stereomikroskop vorsichtig das Bindegewebe und/oder Fettgewebe.

Schneiden Sie das Herz entlang des Septums in zwei Hälften und entnehmen Sie 10 bis 25 Milligramm Gewebe (Nassgewicht) durch Ausschneiden von der Endokardoberfläche des linken Ventrikels. Achten Sie darauf, dass der Schnitt entlang der Faserorientierung verläuft, um mechanische Schädigungen des Myokards zu minimieren. Legen Sie die präparierte Gewebeprobe in eine separate Petrischale mit RP-Lösung auf Eis.

Schneiden Sie das Herz entlang der Faserorientierung in längs verlaufende Streifen mit einem Durchmesser von einem bis 1,5 Millimetern. Verkürzen Sie die Streifen mit einem Skalpell auf eine Länge zwischen zwei und vier Millimetern, wobei äußerste Vorsicht und scharfe Pinzetten verwendet werden müssen. Trennen Sie die Faserbündel mechanisch voneinander.

Endgültige Faserbündel sollten maximal sechs bis acht Fasern enthalten, die durch kleine Kontaktstellen verbunden sind und ein Gewicht zwischen ein und drei Milligramm Nassgewicht aufweisen. Optisch sollte sich das Herzmuskelgewebe von der ursprünglichen roten Farbe zu einem blassen Rosaton verändern. Beginnen Sie die Herstellung der Herzmuskel-Faserbündel, indem Sie eine 12-Loch-Platte auf Eis stellen.

Spülen Sie die Vertiefungen mit RP-Lösung, um Kalziumkontaminationen zu minimieren. Geben Sie drei Milliliter eiskalte RP-Lösung mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Saponin in eine der Vertiefungen. Überführen Sie dann die mechanisch präparierten Faserbündel in die Vertiefung.

Die Faserbündel 20 Minuten unter leichtem Rühren auf Eis inkubieren. Ein neues Well mit Spiegel-fünf-Lösung spülen, 10 Milliliter eiskalte Spiegel-fünf-Lösung in das neue Well pipettieren. Die Herzbündel in das Well überführen und 10 Minuten unter leichtem Rühren auf Eis inkubieren.

Nach der Inkubation wiederholen Sie den Spiegel fünf. Waschen Sie zwei- bis dreimal mit frischem Spiegel fünf. Überführen Sie die Herzbündel jedes Mal in 10 Milliliter eiskalten Spiegel fünf.

Die wiederholten Waschschritte dienen dazu, Saponin A-T-P-A-D-P und alle verbleibenden Substrate unmittelbar vor der respiratorischen Analyse aus den Faserbündeln zu entfernen. Ermitteln Sie das Feuchtwicht der einzelnen Faserbündel, indem Sie diese mit einer Pinzette auf einer saugfähigen Oberfläche abtupfen und die Faser für fünf Sekunden oder bis sämtliche Feuchtigkeit entzogen ist, auf der Oberfläche halten. Entfernen Sie mit einer weiteren saugfähigen Oberfläche überschüssige Flüssigkeit von der Pinzette.

Zerreißen Sie die Waage und legen Sie das Faserbündel zur Massenbestimmung auf eine Kunststoffwaage. Überführen Sie das Herzfaserbündel in eine neue Mulde mit eiskaltem Nahe-fünf. Das Faserbündel ist nun bereit für die Beurteilung des Sauerstoffverbrauchs.

Die folgenden Validierungstitrationen werden mit einer Zwei-Kammer-Titrationsspritze XI-Diagramm durchgeführt. Diese Experimente können je nach experimentellen und diagnostischen Zielsetzungen der Respirometrie-Studien entweder als eigenständiges Protokoll oder als Teil eines Titrationsprotokolls durchgeführt werden. Der hier verwendete ERO GRA 2K kann die Sauerstoffkonzentration messen.

Das Gerät ist mit einem Computer verbunden, der über die DAT-Lab-Software verfügt, wodurch Änderungen der Sauerstoffkonzentration als Echtzeit-Messungen des Sauerstoffverbrauchs während der gesamten Dauer des Experiments erfasst werden können. Vor dem Einbringen der isolierten Herzmuskelstränge in die XI-Graft-Kammern werden 2,1 Milliliter Mircol-5 dem Gehäuse der Kammern zugesetzt, das die polarographischen Sauerstoffsensoren oder POS enthält. Wenn die Kammern geschlossen sind, befinden sich 2 Milliliter Mircol-5 in der XI-Graft-Kammer.

Planen Sie ausreichend Zeit für die Luftsättigung und die Einstellung des Gleichgewichts des Mirror Five bei 37 Grad Celsius ein. Sobald das Gleichgewicht erreicht ist, geben Sie die Herzmuskel-Faserproben in das Mirror Five, das sich in den XI-Graft-Kammern befindet und durch Polyjod gerührte, fluoridbeschichtete Rührstäbchen enthält.

Erhöhen Sie die Sauerstoffkonzentration der GRAT-Kammern mit einer mit Sauerstoff gefüllten Spritze auf einen Bereich zwischen 250 und 550 Mikromolar. Geben Sie fünf bis zehn Minuten Zeit zur Stabilisierung der Sauerstoffkonzentration unter Verwendung einer 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze ein. Fügen Sie 10 Mikroliter zweimolaren Glutamat zur Kammer hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Millimolar zu erreichen.

Verwenden Sie dann eine separate Hamilton-Spritze, um fünf Mikroliter einer 800 Millimolar Malat-Lösung hinzuzufügen, um eine Endkonzentration von zwei Millimolar in der Kammer zu erreichen. Diese Titration dient zur Bestimmung der basalen, durch Komplex I unterstützten Atmung. Der Sauerstoffumsatz sollte innerhalb von etwa fünf Minuten nach der Titration stabilisieren, wodurch die Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs im Zustand zwei möglich ist, welcher dem Sauerstoffverbrauch entspricht.

Wenn nach zwei bis fünf Minuten stabiler Sauerstoffverbrauch keine DP zugesetzt wurde, verwenden Sie eine 25-Mikroliter-Hamilton-Mikrospritze, um 20 Mikroliter einer 500 Millimol-A-DP-Lösung hinzuzufügen, um eine endgültige sättigende Konzentration von fünf Millimolar zu erreichen. Diese Konzentration dient dazu, eine Sättigung von über 90 % zu erzielen, wodurch die Bestimmung des maximalen Zustands ermöglicht wird. Drei. Die mitochondriale Atmung über Komplex eins ermöglicht weitere zwei bis fünf Minuten stabilen Sauerstoffverbrauchs.

Verwenden Sie dann eine 10-Mikroliter-Hamilton-Mikrospritze, um fünf Mikroliter einer vier Millimolar Cytochrom-C-Lösung hinzuzufügen, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolar zu erreichen. Die Sauerstoffkonzentration zu diesem Zeitpunkt wird zur Qualitätskontrolle der Integrität der äußeren mitochondrialen Membran verwendet. Nach weiteren zwei bis fünf Minuten stabilem Sauerstoffverbrauch fügen Sie ein Mikroliter einer vier Milligramm pro Milliliter ACIN-Lösung hinzu, um die ATP-Synthase zu hemmen.

Dieser Titrationsschritt dient zur Überprüfung der Integrität der inneren mitochondrialen Membran. Nach der wiederholten oxphos-Bewertung entnehmen Sie die Probe zur Bestimmung des Trockengewichts oder eines mitochondrialen Markers. Entfernen Sie anschließend Spiegel fünf aus den Glasgefäßen des XI Grat.

Spülen Sie die Kammern mindestens dreimal mit destilliertem Wasser. Anschließend spülen Sie die Kammern mindestens dreimal mit 100 % Ethanol. Um ethanolösliche Inhibitoren wie Oligomycin zu entfernen.

Danach zwei weitere Spülungen mit 70 % Ethanol durchführen. Anschließend 70 % Ethanol hinzufügen und die XI-Graft-Kammern zur Sterilisation 30 Minuten einweichen lassen. Abschließend die Kammern, die die POS enthalten, mindestens fünfmal mit doppelt destilliertem Wasser waschen. Der Sauerstoffverbrauch in ordnungsgemäß präparierten, herzmuskelfasermimetischen Fasern wird anhand des Qualitätskontrollprotokolls bewertet; das Atemkontrollverhältnis (RCR) stellt die Kopplung zwischen Sauerstoffverbrauch und oxidativer Phosphorylierung in permeabilisierten Faserpräparationen dar.

Der RCR ist die Atmungsrate im Zustand drei im Verhältnis zum Zustand zwei oder alternativ Zustand drei geteilt durch Zustand vier, wobei gut gekoppelte, permeabilisierte Herzmuskelpräparationen einen RCR zwischen drei und sechs aufweisen. Die Titration von Cytochrom C dient als Validierung einer korrekten Gewebepräparation. Cytochrom C ist ein Protein, das im Intermembranraum an der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert ist.

Wenn die äußere Membran der Mitochondrien intakt ist, verbleibt das endogene Cytochrom C im Intermembranraum, und die Titration von exogenem Cytochrom C hat eine vernachlässigbare Wirkung auf die Atmung. Umgekehrt kann das endogene Cytochrom C bei einer beschädigten äußeren Mitochondrienmembran aus dem Intermembranraum freigesetzt werden und hemmt dann die Atmung, bis exogenes Cytochrom C zugegeben wird, wodurch die Beurteilung des Einflusses pathologischer oder experimenteller Stressfaktoren auf die Intaktheit der äußeren Mitochondrienmembran ermöglicht wird. Die Zugabe von CIN dient der Beurteilung von Veränderungen der Leckatmung, also des Sauerstoffverbrauchs, der nicht zur DP-Phosphorylierung beiträgt. Kontroll- oder Wildtyp-Fasern sollten empfindlich auf die Zugabe von CIN reagieren und eine signifikante Verringerung des Sauerstoffflusses aufweisen.

Ein niedriger RCR und eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Oligomycin, die zu einem relativ erhöhten Sauerstofffluss führen, weisen auf eine Schädigung der inneren mitochondrialen Membran während der Vorbereitung hin. Das Fehlen einer Reaktion auf Substrat-Inhibitor-Uncoupling-Titrationen, wie hier beobachtet, kann auf verlängerte Inkubationszeiten von Saponin und entfleischten Faserbündeln in RP- und Mirror-Five-Lösungen hindeuten. Nachfolgende Arbeiten sollten die Zeiträume zwischen der Tötung des Versuchstiers und den Sauerstoffverbrauchsmessungen minimieren.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Herzmuskelstränge für polargraphische Messungen vorbereitet. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass bei dieser Prozedur beim mechanischen Trennen der Herzmuskelstränge äußerste Vorsicht geboten ist. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.