Name: Respirometrische Oxidative Phosphorylierung Assessment in Saponin-permeabilisierten Cardiac Fibers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Präparation von Saponin-permeabilisierten Herzfasern zur respirometrischen OXPHOS-Analyse. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen mitochondrialer Funktion in situ für kardiale Bioenergetik-Forschung.

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Diese Studie wurde von der Canadian Institutes of Health Research and Genome Canada unterstützt. JS hält Gehaltszuschüssen Auszeichnungen von der Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation of Canada und der kanadischen Diabetes Association. Das Labor möchte die technische Unterstützung von Oroboros Instruments bei der Akquisition der Saponin-permeabilisierten Faser-Technik anerkennen.

<ol><li>Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).</li>
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<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
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<li>Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmin+cytoskeleton+linked+to+muscle+mitochondrial+distribution+and+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function.</a> J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).</li>
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<li>Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saponin-permeabilized+muscle+fibers+for+the+diagnosis+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases.</a> Biofactors. 7, 221-223 (1998).</li>
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</ol>

Die Saponin-permeabilisierten Herz-Faser-Technik bietet eine einzigartige Kompromiss zwischen in vitro und in vivo Beurteilung der mitochondrialen OXPHOS Sauerstoffverbrauch. Vorteile dieser Technik sind physiologische Relevanz im Vergleich zu isolierten Mitochondrien als zelluläre Architektur erhöht wird beibehalten. Während der Plasmamembran abgebaut wird, intrazellulären Membranstrukturen wie Mitochondrien 12, 14, sarkoplasmatischen Retikulum 14, bleiben Myofilamente und das Zy...

<table><tbody><tr><td>100 % Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>70 % Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin-5&amp;#8242;Diphosphat-Monokaliumsalz-Dihydrat (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Albumin aus bovinem Serum, im Wesentlichen frei von Fettsäuren&amp;#8211;frei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin-5&amp;#8242;-Triphosphat-Dinatriumsalz-Hydrat (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Atractylosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>Calciumcarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Carbonylcyanid-p-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis-(2-amin&amp;#8211;Thylether)-N,N,N&amp;#8242;, N&amp;#8242;-Tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>Ketaset</td></tr><tr><td>Lactobionsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Apfelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;, N&amp;rsquo;-Tetramethyl-p-phenylendiamin-Dihydrochlorid (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Phosphocreatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumcyanid</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpentobarbital</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>Konz. 54,7 mg/ml</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Bernsteinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Rompun</td></tr><tr><td>ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>15-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>50-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Pinzette für Uhrmacherarbeiten</td><td>George Tiemann &amp;& Co.</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Uhrmacherpinzette</td><td>George Tiemann &amp;& Co.</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Operationschere</td><td>George Tiemann &amp;& Co.</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>Steriles chirurgisches Messer</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;m Spritzenfilter</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Petri-Schalen</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>12-Loch-Polystyrol-Zellkulturplatten</td><td>VWR international</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>Plattenrührer</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Microbars</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;l Hamilton-Mikrospritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;l Hamilton-Mikrospritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;l Hamilton-Mikrospritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene-Flaschen mit Ausgießer</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol-Wiegeschalen</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

respirometrische oxidative phosphorylierung assessment in saponin-permeabilisierten cardiac fibers

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Untersuchung der Funktion der Mitochondrien ist ein wichtiger Parameter der kardialen Physiologie als Mitochondrien im Energiestoffwechsel, oxidativen Stress, Apoptose, dem Altern, mitochondriale Enzephalomyopathien und Toxizität von Medikamenten beteiligt sind. Vor diesem Hintergrund werden Technologien zur kardialen Funktion der Mitochondrien Maßnahme verlangen. Eine Technik, die einen integrativen Ansatz verwendet, um die Funktion der Mitochondrien Maßnahme ist respirometrische oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Analyse. Das Prinzip der respirometrische OXPHOS Beurteilung ist um die Messung der Sauerstoffkonzentration unter Verwendung einer Clark-Elektrode zentriert. Da die permeabilisierten Faserbündel verbraucht Sauerstoff, Sauerstoff-Konzentration in der geschlossenen Kammer abnimmt. Anhand ausgewählter Substrat-Inhibitor-Entkoppler Titration Protokolle, werden Elektronen auf bestimmten Seiten der Elektronen-Transportkette vorgesehen, der die Auswertung der mitochondrialen Funktion. Vor respirometrische Analyse der mitochondrialen Funktion, mechanische und chemische vorbereitende Techniken werden eingesetzt, um das Sarkolemm der Muskelfasern permeabilisieren. Chemische Permeabilisierung beschäftigt Saponin, um selektiv zu perforieren die Zellmembran unter Beibehaltung zellulären Architektur. Dieses Papier beschreibt ausführlich die Schritte bei der Vorbereitung Saponin-Haut Herz-Fasern für den Sauerstoffverbrauch Messungen der mitochondrialen OXPHOS bewerten beteiligt. Darüber hinaus Tipps zur Fehlerbehebung sowie spezifische Substrate, Inhibitoren und Entkuppler, die zur Mitochondrien-Funktion an bestimmten Standorten der Elektronen-Transportkette zu bestimmen sein kann. Wichtig ist, können die beschriebenen Protokoll leicht zu Herz-und Skelett-Gewebe von verschiedenen Tiermodellen und humanen Proben angewendet werden.

Saponin-permeabilisierten Faseraufbereitung in Verbindung mit respirometrische oxidative Phosphorylierung Analyse bietet integrative Beurteilung der Funktion der Mitochondrien. Mitochondriale Atmung in physiologischen und pathologischen Zuständen kann reflektieren verschiedene regulatorische Einflüsse einschließlich mitochondrialer Interaktionen, Morphologie und Biochemie.

Respirometrische Oxidative Phosphorylierung Assessment in Saponin-permeabilisierten Cardiac Fibers

Die Untersuchung der mitochondrialen Funktion stellt einen wichtigen Parameter der Herzphysiologie dar, da Mitochondrien am Energiestoffwechsel beteiligt sind, ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Saponin-permeabilisierte Herzmuskel­fasern für polaro­graphische Messungen vorzubereiten. Dies wird zunächst durch die Entnahme des Herzens aus der Maus erreicht. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Herzmuskel­faser­bündel mechanisch herzustellen, die maximal sechs bis acht locker miteinander verbundene Fasern enthalten.Anschließend werden die Herzbündel chemisch mit Saponin permeabilisiert. Danach werden die Herzbündel von verbliebenem Saponin und allen restlichen Metaboliten gewaschen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Einblicke in die mitochondriale oxidative Phosphorylierung durch polarographische Messungen ermöglichen.Hallo, ich bin Curtis Huey aus dem Labor von Dr. Jane Sheer am Department für Biochemie und Molekularbiologie der University of Calgary. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Saponin-permeabilisierten Herzmuskelsträngen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die mitochondriale oxidative Phosphorylierung in situ zu untersuchen.Beginnen wir also. Entnehmen Sie zu Beginn des Verfahrens ein marines Herz und legen Sie es in eine Petrischale mit der RP-L

respirometric-oxidative-phosphorylation-assessment-saponin

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Die vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung einer Sammlung von mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays unter Verwendung isolierter Mitochondrien aus minimalen Mengen von Maus-Skelettmuskeln. Diese Assays sind in der Lage, mechanistische Veränderungen/Anpassungen des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung und Verwendung von Puffern für die quantitative Messung der Glukose- und Fettsäureoxidationsraten im isolierten Arbeitsherz der Ratte. Die Methoden, die für die Probenanalyse und die Dateninterpretation verwendet werden, werden ebenfalls diskutiert.

Methoden zur Bestimmung von Preisen von Glucose und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherz

Hochauflösende Respirometrie verwendet mitochondrialen Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Dies ist eine einfache Technik mitochondrialen Atmungskette Komplexe '(I-IV) Atmungsraten, maximale mitochondrialen Elektronentransportsystemkapazität und mitochondrialen Außenmembran Integrität zu bestimmen.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

Dieses Protokoll beschreibt Calorespirometry, die direkte und gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und Atmung, sorgt für eine nicht-invasive Ansatz um den Energiestoffwechsel zu beurteilen. Diese Technik wird verwendet, um den Beitrag von aeroben und anaeroben Wege zur energetischen Nutzung durch die Überwachung des gesamten zellulären Energiefluss zu bewerten.

Calorespirometry: Eine starke, nicht-invasive Ansatz zur zellulären Energiestoffwechsel untersuchen

Die Beurteilung der oxidativen Phosphorylierung mit hochauflösenden Respirometern ist zu einem integralen Bestandteil der Funktionsanalyse von Mitochondrien und zellulärem Energiestoffwechsel geworden. Hier stellen wir Protokolle für die Analyse des zellulären Energiestoffwechsels mit kammer- und mikroplattenbasierten hochauflösenden Respirometern vor und diskutieren die wichtigsten Vorteile jedes Geräts.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Bioenergetik in Zellen und Geweben mittels kammer- und plattenbasierter Respirometer

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Pferde verfügen über eine außergewöhnliche aerobe Trainingskapazität, was die Skelettmuskulatur von Pferden zu einem wichtigen Gewebe sowohl für die Untersuchung der Trainingsphysiologie von Pferden als auch für die mitochondriale Physiologie von Säugetieren macht. Dieser Artikel beschreibt Techniken zur umfassenden Beurteilung der mitochondrialen Funktion in der Skelettmuskulatur von Pferden.

Hochauflösende Fluoro-Respirometrie der Skelettmuskulatur von Pferden

Die Analyse der Mitochondrienfunktion von Spermien mittels hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von frei beweglichen Spermien in einem geschlossenen Kammersystem. Die Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden, die Informationen über die mitochondrialen Eigenschaften und die Integrität der Spermien liefert.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

Hier beschreiben wir eine umfassende Methode zur Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung in frischen permeabilisierten Skelettmuskelfasern aus menschlichen oder Mausmuskeln. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung und die Beurteilung der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität unter Beibehaltung bestehender mitochondrialer Netzwerke und der Membranintegrität.

Messung der mitochondrialen Atmung in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mittels hochauflösender Respirometrie

Erfahren Sie die Präparation von Saponin-permeabilisierten Herzfasern zur respirometrischen OXPHOS-Analyse. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen mitochondrialer Funktion in situ für kardiale Bioenergetik-Forschung.

Respirometrische Oxidative Phosphorylierung Assessment in Saponin-permeabilisierten Cardiac Fibers

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