Mikrotiterschale Biofilmbildung Assay
30. Januar 2011
Der Test beschreibt ein schnelles Mittel zur frühen Bildung von Biofilmen in Bakterien und Pilzen zu messen. Diese Methode verwendet eine Mikrotiterplatte als Substrat für die mikrobielle Bildung von Biofilmen und der Biofilm wird visualisiert Kristallviolett Belastung. Der Test liefert entweder eine qualitative oder quantitative Assay für die frühe Bildung von Biofilmen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Biofilme in einer Mikrotiterplatte anzulegen und zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Bakterienkultur in eine 96-Loch-Platte gegeben wird. Anschließend wird die Kultur je nach Mikroorganismus bei geeigneter Temperatur und über einen bestimmten Zeitraum inkubiert, um den Biofilm anzufärben.
Kristallviolett wird in jede Vertiefung mit Bakterien gegeben, anschließend werden die Bakterien gewaschen. Schließlich werden die Vertiefungen fotografiert und die Bakterien quantifiziert. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die Ansammlung und Bildung von Biofilmen über die Zeit hinweg durch die Messung von Kristallviolett zeigen.
Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie es Untersuchern ermöglicht, die Biofilmbildung bei bakteriellen und pilzlichen Organismen schnell zu bewerten. Sie kann außerdem für genetische Hochdurchsatz-Screens konfiguriert werden oder um neuartige therapeutische Substanzen zu identifizieren, die die Biofilmbildung hemmen. Bereiten Sie eine Übernachtkultur von fünf Milliliter des Wildtyps Pseudomonas aerogen oder eines Mutantenstamms vor.
In LB-Medium verdünnen Sie 10 Mikroliter Kultur in einem Milliliter frischem M 63-Minimalmedium, das mit Magnesium, Sulfat, Glukose und Cassino-Säuren ergänzt ist. Übertragen Sie anschließend mithilfe einer Pipette 100 Mikroliter der verdünnten Kultur in separate Vertiefungen einer 96-Loch-Rundbodenplatte. Inkubieren Sie die Platte vier bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, um das Biofilmbewuchs zu ermöglichen.
Nachdem sich die Biofilme gebildet haben, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und entsorgen Sie die kulturellen Überstände, indem Sie die Platte umdrehen und die Flüssigkeit herausschütteln. Tauchen Sie die Platte anschließend vorsichtig in ein kleines Wasserbad, um eventuell noch anhaftende nicht gebundene Zellen oder Bestandteile des Mediums zu entfernen, die eine Hintergrundanfärbung verursachen könnten. Schütteln Sie das Wasser ab, tupfen Sie die Platte ab und wiederholen Sie den Waschvorgang.
Wenn die Platte sauber ist, 125 Mikroliter pro Vertiefung einer 0,1 %igen Kristallviolett-Lösung hinzufügen. Zum Anfärben der Zellen die Platte 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Anschließend die Platte drei- oder viermal wie zuvor gezeigt waschen. Nach dem letzten Waschschritt die Platte kräftig auf einem Stapel Papiertüchern abtupfen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, die Platte umdrehen und einige Stunden lang umgedreht trocknen lassen. Sobald die Platte trocken ist, können die Vertiefungen mit einer Digitalkamera fotografiert werden, um die Qualität der Biofilme zu beurteilen.
Wie hier gezeigt, bilden bewegliche Bakterien wie Pseudomonas aerogen auf der linken Seite und Pseudomonas fluorescence auf der rechten Seite während des Biofilmbewuchses bevorzugt Biofilme an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Im Gegensatz dazu bilden nicht bewegliche Staphylococcus ora-Bakterien Biofilme am Boden der Vertiefungen. Um die Biofilme zu quantifizieren, geben Sie zunächst 125 Mikroliter 30 %iger Essigsäure in jede Vertiefung, einschließlich einer Blindprobe, die nur Essigsäure enthält, und inkubieren die Platte bei Raumtemperatur für 10 bis 15 Minuten, damit sich das von den Biofilmen gebundene Kristallviolett lösen kann.
Als Nächstes überführen Sie 125 Mikroliter des gelösten Farbstoffs aus jeder Vertiefung in eine neue, flachbodige 96-Loch-Mikrotiterplatte. Quantifizieren Sie mithilfe eines Plattenlesegeräts die Absorption jeder Vertiefung bei einer Wellenlänge von 550 Nanometern. Die Konzentration von Kristallviolett in jeder Vertiefung ist proportional zur Anzahl der Zellen im Biofilm.
Dieses Diagramm zeigt eine Quantifizierung der Biofilmbildung und -akkumulation durch Pseudomonas fluorescence über die Zeit während der Inkubation bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Biofilmassey in einer 96-Well-Platte durchführt, der in Kombination mit anderen Methoden wie der Mikroskopie verwendet wird. Er kann wesentlich zu unserem Verständnis der Biofilmbildung beitragen.
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Übersicht
Dieser Test beschreibt eine schnelle Methode zur Messung der frühen Biofilmbildung bei Bakterien und Pilzen unter Verwendung einer Mikrotiterplatte. Der Biofilm wird mittels Kristallviolett-Färbung sichtbar gemacht, wodurch sowohl eine qualitative als auch quantitative Analyse ermöglicht wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Biofilmforschung
- Assay-Entwicklung
Hintergrund
- Biofilme sind Gemeinschaften von Mikroorganismen, die an Oberflächen haften.
- Die Untersuchung der Biofilmbildung ist entscheidend für das Verständnis des mikrobiellen Verhaltens.
- Kristallviolett ist ein gängiger Farbstoff zur Visualisierung von Biofilmen.
- Diese Methode ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Biofilmentwicklung.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der frühen Biofilmbildung etablieren.
- Die Biofilmbildung über die Zeit quantifizieren.
- Die Untersuchung mikrobieller Interaktionen in Biofilmen erleichtern.
Verwendete Methoden
- Geben Sie die Bakterienkultur in eine 96-Well-Mikrotiterplatte.
- Inkubieren Sie die Kultur bei der geeigneten Temperatur und für die erforderliche Zeit.
- Fügen Sie Kristallviolett hinzu, um den Biofilm anzufärben.
- Spülen Sie die Vertiefungen aus und fotografieren Sie, um die Biofilmbildung zu quantifizieren.
Hauptergebnisse
- Die Ergebnisse zeigen die Ansammlung von Biofilmen im Zeitverlauf.
- Quantitative Daten können aus Messungen mit Kristallviolett gewonnen werden.
- Der Assay ermöglicht eine klare Visualisierung der Biofilmbildung.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode eignet sich zur Untersuchung der frühen Biofilmbildung.
- Sie kann auf verschiedene bakterielle und pilzliche Arten angewendet werden.
- Mithilfe des Assays wird das Verständnis der mikrobiellen Biofilmdynamik verbessert.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels des Biofilmbildungsassays in Mikrotiterplatten lässt sich die frühe Biofilmbildung schnell und mit hohem Durchsatz bewerten, was die Validierung von Zielstrukturen in der antimikrobiellen Wirkstoffforschung unterstützt. Durch die Quantifizierung der Biofilmbildung mittels Kristallviolett-Färbung liefert die Methode reproduzierbare, quantitative Daten, die bei der Risikominderung für therapeutische Kandidaten helfen, die auf mikrobielle Adhäsion und Persistenz abzielen. Dieser skalierbare Ansatz ist für bakterielle und pilzliche Systeme anwendbar und ermöglicht die Hochdurchsatz-Screening-Identifizierung von Substanzen, die die Biofilmbildung modulieren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen, indem Gene und Faktoren identifiziert werden, die für die Biofilmbildung erforderlich sind, wie Adhäsine, Pili und zyklische-di-GMP-Signalwege.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch Funktionsverlust-Screens in mikrobiellen Stämmen unter standardisierten Bedingungen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem Verbindungen, die die frühe Biofilmbildung hemmen, von solchen ohne Wirkung unterschieden werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte mikrobielle Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening-Untersuchung vor, indem reproduzierbare Metriken zur Biofilmbildung etabliert werden.
- Operativer Wert: Schafft Standardisierung des Assays durch einheitliche Inkubations-, Färbungs- und Quantifizierungsschritte im 96-Well-Plattenformat.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht die Eignung für Hochdurchsatz-Screenings und die Wiederverwendbarkeit der Plattform für genetische Screens und Wirkstoffbibliotheken über mehrere mikrobielle Stämme hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Relevanz: Verbindet Daten zur frühen Biofilmbildung mit phänotypischen Resistenzprofilen und unterstützt so die mechanistische Absicherung antimikrobieller Wirkstoffkandidaten.
- Präklinische Kontinuität: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem die in vitro Hemmung von Biofilmen mit der Toleranz gegenüber Antibiotika und immunologischen Effektoren verknüpft wird.
- Biomarker-Korrelation: Unterstützt die Entwicklung translationaler Biomarker durch quantifizierbare Messgrößen, die mit biofilmbedingten Toleranzphänotypen korrelieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test passt in den Entdeckungsprozess von der Zielidentifizierung bis zur Leitstruktur-Optimierung, insbesondere für Antiinfektiva-Programme, die auf die Biofilm-vermittelte Resistenz abzielen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Mikrobenadhäsions- und Biofilmbildungswegen durch genetische und chemische Störungen.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand standardisierter Biofilmbildung und Quantifizierung mit Kristallviolett, wodurch eine zuverlässige Bewertung von Verbindungen ermöglicht wird.
- Analytik: Betont quantitative Absorptionsmessungen bei 550 nm, die den Vergleich der Biofilmbiomasse unter verschiedenen Bedingungen und Stämmen erlauben.
- Translationale Forschung: Verbindet frühe Daten zur Biofilminhibition mit präklinischer Relevanz, indem Toleranzmechanismen modelliert werden, wie sie bei chronischen Infektionen beobachtet werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Positioniert die Methode als wiederverwendbare Screening-Plattform für antimikrobielle, antimykotische und antibiofilmaktive Programme über mehrere Pathogenmodelle hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Target-Validierung durch messbare Verringerung der Biofilmbildung nach genetischer oder pharmakologischer Intervention.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über 96-Well-Formate für Hochdurchsatzanwendungen.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen bei der Leitstruktur-Identifizierung durch Verringerung von Falsch-positiven Ergebnissen mittels orthogonaler Biofilm-Quantifizierung.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf dosisabhängiger Hemmung der frühen Biofilmbildung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert mikrobiologische Fachkenntnisse in steriler Technik, Kulturpräparation und Handhabung von Biofilmen.
- Setzt Zugang zu Plattenlesegeräten voraus, die Absorptionsmessungen bei 550 nm und die Verwendung standardmäßiger 96-Well-Mikrotiterplatten ermöglichen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich Inkubationszeiten, Waschschritten und Färbeprotokollen, um die Variabilität zwischen den Wells zu minimieren.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf Nicht-Modellorganismen oder Pilze mit unterschiedlichen Adhäsionseigenschaften ausgeweitet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Unfähigkeit, die Architektur ausgereifter Biofilme oder flussabhängige Phänotypen abzubilden, wie in der Quelle angegeben.
