Name: Erkennung von Functional Matrix-Metalloproteinasen durch Zymographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Zymographie zur Detektion funktioneller Matrix-Metalloproteinasen in Zellkulturüberständen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von MMP-Aktivität durch Gel-Elektrophorese und Bandendichtemessung.

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Wir danken Herrn Dr. S. Ressler (Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine) für die Annahme, die Verwendung von Protein-Konzentratoren, um die Konzentration von MMPs in Zellkulturüberständen erhöhen danken. Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse der Mrs. Clifford Elder Weiß Graham Stiftungsprofessur Research Fund und die NIH / NIAMS (AR059838) zu CB unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.

1. Laden und Ausführen der Gel <ol><li> Alle Proben sind entsprechend vorbereitet werden, um die Funktion der Enzyme erhalten und sofort nach der Entnahme verwendet oder gelagert bei -80 ° C. Die Proben dürfen keine Reduktionsmittel (eine solche β-Mercaptoethanol) oder vor Gelbeladung abgekocht werden. </li><li> Öffnen Sie den Beutel mit einem Gel in einer Kassette, spülen Sie die Kassette mit entionisiertem Wasser. <ul><li> Entfernen Sie die Schutzfolie von der Unterseite der Kassette und der Kamm von der Spitze des Gels. </li><li> Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit Laufpuffer (verdünnt auf 1X in VE-Wasser). </li><li> Legen Sie das Gel in den Mini-Cell, sicherzustellen, dass die kleinere Seite der Kassette nach innen Gesichter. Einrasten mit dem Gel Tension Wedge. Die Mini-Cell erlaubt es, ein oder zwei Gele parallel laufen. </li><li> Füllen Sie den oben (innen) Kammer mit 1X-Laufpuffer über Brunnen Ebene, auf Lecks überprüfen. Im Falle eines Lecks, entfernen Sie die Puffer und die Position des Gels. </li><li> Füllen Sie die untere Kammer mit 1X-Laufpuffer. </li></ul></li><li> Legen Sie 10 ul Protein molekularer Marker in einem gut. <ul><li> Mix eine gleiche Menge an Gel-Ladepuffer und der Probe und der Last in die Vertiefungen des Gels mit Gel-loading Tipps (geänderte zwischen jeder Probe). Diese Vertiefungen können mit geladen werden bis zu 20 ul total. </li></ul></li><li> Setzen Sie den Deckel auf dem Mini-Cell und die Elektrode Kabel an die Stromversorgung. Schalten Sie die Stromversorgung an und stellen es auf 125 V konstant für 90 Minuten laufen. Überprüfen Sie die Bildung von kleinen Bläschen auf den Draht der unteren Kammer, zur Anzeige der aktuellen Auflage. </li><li> Bei der Ausführung Ihrer ersten Gel, Monitor Fortschritt der Migration alle 15 Minuten, mit dem Bromphenolblau im Ladepuffer als Indikator enthalten. Lassen Sie das Gel laufen, bis der Indikator-Farbstoff erreicht den Boden des Gels. </li></ol> 2. Renaturierung und Entwicklung der Gel <ol><li> Für jedes Gel, Herstellung von 100 ml 1X Renaturierungspuffer und 200 ml denaturierenden Puffer, sowohl in deionisiertem Wasser. </li><li> Wenn die Bromphenolblau Markerfarbstoff der Unterseite des Gels erreicht hat, schalten Sie die Stromversorgung aus, öffnen Sie den Mini-Cell, und entfernen Sie das Gel. Trennen Sie die beiden Seiten der Kassette mit der Gel-Messer (oder einer Waage Spatel). Schneiden Sie eine Ecke, um das Gel die Richtung zu markieren. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Gel aus der Kassette und in einen Behälter mit 100 ml Renaturierungspuffer. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Renaturierungspuffer und 100 mL der Entwicklung Puffer, um das Gel. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Entwicklung von Puffer und 100 ml mehr entwickeln Puffer, um das Gel. Inkubieren über Nacht (16-18 Stunden) bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Entwicklung von Puffer und spülen dreimal (5 Minuten) mit destilliertem Wasser unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Scannen Sie das Gel auf die exakte Positionierung des Proteins Standard Bands sparen werden, da sie weniger oder gar nicht sichtbar, nachdem Gelfärbung. </li><li> Stain das Gel durch Zugabe von 20 ml SimplyBlue Safestain auf das Gel. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die SimplyBlue SafeStain und de-Fleck das Gel in 100 ml oder mehr VE-Wasser für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Für bessere Ergebnisse mit frischem deionisiertem Wasser und inkubieren ersetzen noch eine Stunde oder mehr bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig das Gel aus dem Wasser und in einer Plastikplane Schutz. </li><li> Scannen Sie das Gel mit einer Auflösung von 300 dpi oder höher. Speichern Sie das Bild im TIFF-Format (Abbildung 1A). </li><li> Messen Bandenintensitäten mit ImageJ (oder eine andere ähnliche Software). <ul><li> Öffnen Sie die TIFF-Datei in ImageJ (Abbildung 1A). </li><li> Visualisieren Sie in Schwarz und Weiß, indem Sie "Bild&gt; Typ&gt; 8-bit" (Abbildung 1B). </li><li> Verwenden Sie die rechteckige Auswahl Werkzeug, um die erste Band, skizzieren, zeichnen Sie ein Rechteck mindestens zweimal höher als breit ist (dies ist ein Software-Anforderung). </li><li> Drücken Sie die "1" oder wählen Sie "&gt; Gels Analyze&gt; Wählen erste Gasse" und die Band skizziert werden soll. </li><li> Ein neues Rechteck erscheint, verschieben Sie es auf die nächste Band, und wählen Sie "Analysieren&gt; Gele&gt; Wählen nächsten lane". Wiederholen, bis alle Bands ausgewählt werden (Abbildung 1B). </li><li> "3" drücken, oder wählen Sie "Analysieren&gt; Gele&gt; Plot Gassen", um das Profil Grundstück für jedes Band (Abbildung 1C) zu generieren. </li><li> Verwenden Sie die gerade Linie Auswahl (sollte bereits automatisch ausgewählt werden), um Grundlinien zu ziehen, so dass die Spitze von Interesse ist eine komplett geschlossene Fläche. </li><li> Wählen Sie den Zauberstab-Werkzeug und klicken Sie in jeder Spitze um es auszuwählen. </li><li> Wählen Sie "Analysieren&gt; Gele&gt; Label Spitzen", um eine Tabelle mit dem Bereich für jede ausgewählte Gipfel zu erreichen. Diese Daten können als solche dargestellt werden (FBBILDUNG 1D) oder auf den Wert einer ausgewählten Band normalisiert werden. Diese Normalisierung ist besonders wichtig, wenn die Bündelung Werte von mehreren replizieren Gele, um statistische Signifikanz der Ergebnisse zu bestimmen. </li></ul></li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Wir zeigen ein Gel mit 11 Bohrungen mit unterschiedlichen Zellkulturüberständen mit unterschiedlichen Mengen an MMP-2 (Abbildung 1A) geladen. Die direkte Beobachtung dieses Gel zeigt deutliche Unterschiede in MMP-2-Konzentrationen zwischen einigen der Brunnen. Zum Beispiel ist es klar, dass Brunnen Nr. 4 und 5 viel MMP-2 als auch Nr. 11 oder sogar auch Nr. 10 enthalten. Für objektive Quantifizierung der Bands, die wir haben Densitometrie mit dem ImageJ-Software (Abbildung 1B-D) verwendet wird, bestätigt eine ca. 4-fache Differenz in MMP-2 Beträge zwischen gut # 11 und # Brunnen 4 und 5 sowie einer ca. 2-fache Differenz in MMP-2 Beträge zwischen gut # 10 und # Brunnen 4 und 5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Erkennung von MMP-2 durch Gelatine Zymographie. A, gescannte Bild einer Gelatine-Gel. Nun Zahlen sind am oberen Rand des Gels angegeben. B, Same-Gel wie in A gezeigt in schwarz und weiß für Densitometrie. Jeder Band wurde mit einem Rechteck in ImageJ ausgewählt. C, Zwei Beispiele für Densitometrie-Profile für das Gel gezeigt in A und B (Bänder # 4 und # 11). Eine gerade Linie war an der Basis jeder Spitze gezogen, um einen geschlossenen Raum zu schaffen. D, Plot der Peakflächen für das Gel in A und B vor (links) und nach (rechts) Normalisierung der Dichte der Band Nr. 1 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Diese Zahl zeigt, wie Zymographie als semi-quantitative Verfahren eingesetzt werden kann. Wir haben serielle Verdünnungen (Schritte von 1:1 Verdünnungen) in 7 aufeinander folgenden Bohrungen geladen und gemessen die Band Dichten sowohl für pro-MMP-2 und MMP-2.

<ol><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li>
<li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li>
<li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+regulators+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li>
<li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li>
<li>Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metallopreoteinases%3A+what+do+they+not+do%3F+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li>
<li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+%28TIMPs%29%3A+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li>
<li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+activities%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li>
<li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li>
<li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+activity+assays%3A+importance+of+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li>
<li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+zymography%3A+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li>
<li>Yu, W. H., Woessner, J. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li>
</ol>

Wir haben gezeigt, wie man zymographische Analyse der MMP-2 in Zellkulturüberständen durchzuführen. Die Höhe der Probe auf ein Gel Last muss empirisch ermittelt je nach Herkunft und MMP von Interesse sein. Lädt zu wenig wird Erkennung verhindern beim Laden zu viel kann bis zur Sättigung führen, da es nur so viel Substrat einer Protease im Bereich der Band verdauen können. Falls erforderlich, kann die Probe in deionisiertem Wasser vor dem Mischen mit Ladepuffer oder die Entwicklungszeit verdünnt werden kann de reduziert von über Nacht bis 4 Stunden. Es ist auch möglich, Proteine ​​in einer Lösung mit Konzentratoren (zB Millipore Katalog # UFC803024) konzentrieren. Wenn Bands kaum sichtbar bleiben, kann es notwendig sein, um die Gele für einen längeren Zeitraum zu entwickeln, auch bis zu 48 Stunden. Bei der Vorbereitung Proben aus Zellkultur-Überstände, darauf hinzuweisen, dass fötales Rinderserum (und andere Seren) MMPs, dass die Ergebnisse beeinflussen können, enthält. Aus diesem Grund erheben wir alle unsere Überstände nach der Kultur in serum-freiem Medium. Die Waschungen in den Absätzen 2.9 und 2.10 des Protokolls beschrieben sind notwendig, um die Hintergrundfärbung der verdauten Bands entfernen. Längere Waschzeiten löscht mehr Hintergrund, sondern auch dim die Färbung des Substrates durch das Gel. Wenn mehr Waschzeiten notwendig sind, empfehlen wir das Scannen des Gels alle paar Stunden, um den Scan mit dem besten Kontrast zu wählen. Diese Technik kann verwendet werden, um andere MMPs zu erkennen. Zum Beispiel kann MMP-9 auf Gelatine-Gelen nachgewiesen werden, und auch in geringerem Umfang MMP-1, MMP-8 und MMP-13 wie Gelatine ist nicht ihr bevorzugtes Substrat. MMP-1 und MMP-13 sind am besten auf Kollagen Zymographie erkannt, während Kasein ist das bevorzugte Substrat für die MMP-11 und ermöglicht auch den Nachweis von MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 und MMP-13 9. MMP-7 (Matrilysin) und Kollagenasen (MMP-1 und MMP-13) sind schwer zu erkennen, wenn in geringen Mengen in Kasein oder Gelatine-Gelen. Die Zugabe von Heparin auf die Probe zum Zeitpunkt der Gel-loading verbessert die Nachweisgrenze für MMP-7. Für MMP-1 und MMP-13, muss das Heparin zu dem Gel nach der elektrophoretischen Lauf ist bereits im Gange 12. Da Zymographie Maßnahmen enzymatische Aktivität nach Denaturierung und Renaturierung der Enzyme, wird es messen die Aktivität aller MMPs in der Probe vorhanden. Dies sind Enzyme, Pro-Enzyme und Enzyme gebunden endogenen Inhibitoren (zB TIMP-2). Es ist jedoch möglich, das Niveau der MMP Aktivierung in der Probe durch den Vergleich der Band Dichte des aktiven Enzyms und dass der Pro-Enzym, das einen etwas höheren Molekulargewicht bestimmen. Zymographie ist oft nicht ausreichend, um eine MMP zu identifizieren. Vergleich der Höhe der Migration eines MMP mit bekanntem Molekulargewicht-Standards ist bei der Identifizierung helfen, aber es sei darauf hingewiesen, dass einige dieser Standards ein Reduktionsmittel enthalten, und dass, wenn sie unter nicht-reduzierenden Bedingungen verwendet sie unterschiedliche Molekulargewichte 9 geben werden. Eine Option ist, um eine lösliche rekombinante MMP auf dem gleichen Gel als die Prüflinge zu laden. MMPs kann jedoch mit anderen Proteinen assoziiert sein, Induktion einer Änderung der scheinbaren Molekulargewicht. Selektive MMP-Inhibitoren kann das Gel (oder ein Teil eines Gels halbiert) während der Inkubation in der Entwicklung Puffer als pharmakologische Werkzeuge, um die Identität hinzugefügt werden die MMP von interest.A zweite Technik (Western Blot, Immunzytochemie, oder ELISA) zu empfehlen Hilfe bei der Identifizierung der MMP von Interesse. Anzumerken ist, dass Nachweisgrenzen für Western Blots oft viel niedriger als die der zymographische Gele, was möglicherweise zu falsch-negative Ergebnisse bei der Verwendung dieser Technik werden.

<table><tbody><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell CE-Kennzeichnung Elektrophoresegerät</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Netzteil (Modell 302)</td><td>VWR international</td><td>93000-744</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10 % Gelatine-Zymogramm-Gele, 1,0 mm, 12 Vertiefungen</td><td>Invitrogen</td><td>EC61752BOX</td><td></td></tr><tr><td>Blue Juice Probenauftragspuffer</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>Probenauftragspipettenspitzen</td><td>VWR international</td><td>53509-015</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Molekulargewichtsstandard</td><td>Invitrogen</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycin-SDS-Laufpuffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>Novex Zymogramm-Renaturierungspuffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC2670</td><td></td></tr><tr><td>Novex Zymogramm-Entwicklungsbuffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC2671</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection 4490 Photo Scanner</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ-Software</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>n/a</td><td>Verfasst von W. Rasband, NIH/NIMH</td></tr></tbody></table>

erkennung von functional matrix-metalloproteinasen durch zymographie

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sind Zink-haltigen Endopeptidasen. Sie bauen Proteine ​​durch Spaltung von Peptidbindungen. Mehr als zwanzig MMPs wurden identifiziert und sind in sechs Gruppen auf ihre Struktur und Substratspezifität (Kollagenasen, Gelatinasen Membran Typ [MT-MMP], Stromelysine, matrilysins, und andere) basieren getrennt. MMPs spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Invasion Knorpelabbau, Gewebe-Remodeling, Wundheilung, und Embryogenese. Sie daher in normalen Prozessen und in der Pathogenese vieler Erkrankungen, wie rheumatoide Arthritis, Krebs oder chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung 1-6 teilnehmen. Hier werden wir uns auf MMP-2 (Gelatinase A, Typ IV Kollagenase), eine weit verbreitete Ausdruck MMP konzentrieren. Wir werden zeigen, wie MMP-2 in Zellkulturüberständen erkennen zymographisch, eine häufig verwendete, einfache und doch sehr sensible Technik zuerst 1980 von C. Heussen und EB Dowdle 7-10 beschrieben. Diese Technik ist semi-quantitative, kann es daher zur MMP Ebenen in Testproben zu bestimmen, wenn bekannte Konzentrationen von rekombinanten MMP auf dem gleichen Gel 11 sind geladen werden. Und Gelatine (Substrat für MMP-2); Lösungen, die MMPs (zB Zellkulturüberstände, Urin oder Serum) werden auf ein Polyacrylamidgel mit Natriumdodecylsulfat (um die Proteine ​​zu linearisieren SDS) geladen. Der Probenpuffer wurde entwickelt, um Proben Viskositätsanstieg (bis Gelbeladung zu erleichtern), eine Tracking-Farbstoff (Bromphenolblau; zum Beispiel die Migration-Monitor), bieten denaturierenden Moleküle (Proteine ​​linearisieren) und Kontrolle der pH-Wert der Probe. Proteine ​​sind dann unter einen elektrischen Strom in einem Laufpuffer entworfen, um eine konstante Wanderungsgeschwindigkeit bieten zu migrieren. Der Abstand der Migration ist umgekehrt mit dem Molekulargewicht des Proteins (kleine Proteine ​​schneller bewegen durch das Gel als große Proteine ​​und damit die Migration weiter unten in der Gel) korreliert. Nach der Migration wird das Gel in einer Renaturierungspuffer gelegt, damit Proteine ​​ihre Tertiärstruktur, die für enzymatische Aktivität wiederzugewinnen. Das Gel wird dann in einem Entwicklungsland Puffer so konzipiert, dass die Protease seine Substratverdau platziert. Die Entwicklung Puffer enthält auch p-aminophenylmercuric (APMA), um den nicht-proteolytische Pro-MMPs in den aktiven MMPs aktivieren. Der nächste Schritt besteht in der Färbung des Substrats (Gelatine in unserem Beispiel). Nach dem Waschen der überschüssigen Farbstoff aus dem Gel Bereichen Proteaseverdau als klare Streifen erscheinen. Je klarer die Band, je konzentrierter die Protease enthält. Band Färbeintensität kann dann durch Densitometrie ermittelt werden, mit einer Software wie ImageJ, so dass für die Probenvorbereitung Vergleich.

Dieses Protokoll beschreibt eine activity-based-Assay zum Nachweis Matrixmetalloproteinasen in Kulturüberständen oder Körperflüssigkeiten.

Erkennung von Functional Matrix-Metalloproteinasen durch Zymographie

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sind zinkhaltige Endopeptidasen. Sie bauen Proteine durch die Spaltung von Peptidbindungen ab. Mehr als zwanzig MMPs wurden ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, funktionelle Matrix-Metalloproteinasen nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem die Probe zunächst durch Zugabe eines Puffergemischs ohne Reduktionsmittel für die Zymographie vorbereitet wird. Anschließend wird das Gelatine-Zymographie-Gel mit der Probe beladen und laufen gelassen, bis der Laufindikator das Ende des Gels erreicht hat.Nach der Elektrophorese wird das Gel renaturiert, entwickelt, angefärbt und entfärbt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gel zur Datenanalyse einzuscannen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen in den Proben mittels Banddichteanalyse zeigen.Hallo, ich komme aus dem Labor von Dr. Kristin Bitten an der Abteilung für Molekulare Physiologie und Biophysik am LER College of Medicine. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zum Nachweis von Matrix-Metalloproteinasen mittels Zymographie. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Matrix-Metalloproteinasen zu untersuchen, die von kultivierten primären Zellen sezerniert werden.Kommen wir also zur Untersuchung. Vor Beginn dieses Protokolls müssen alle Matrix-Metalloproteinasen oder MMPs angemessen vorbereitet werden, um die Funktion der Enzyme aufrechtzuerhalten. Die Proben können sofort verwendet oder bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Hier wird MMP-2, auch bekannt als Gelatinase A oder Typ-IV-Collagenase, verwendet, um die Visualisierung der MP-Aktivität mittels Synographie zu demonstrieren. Sobald die MMP-Enzyme vorbereitet wurden, besorgen Sie eine 10 %-Gelatine-Zymogramm-Gel-Packung, die ein Gel in einer Kassette enthält. Spülen Sie die Kassette mit entionisiertem Wasser ab.Entfernen Sie das Schutzband von der Unterseite der Kassette und den Kamm von der Oberseite des Gels. Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit Tris-Glycin-SDS-Laufpuffer aus.Platzieren Sie das Gel in eine Mini-Gelelektrophoresevorrichtung, wobei die schmalere Seite der Kassette nach innen zeigen muss. Sichern Sie das Gel mit dem Gelführungswinkel. Füllen Sie die obere Kammer der Vorrichtung mit Tris-Glycin-SDS-Laufpuffer über dem Niveau der Mulden und prüfen Sie auf eventuelle Lecks.Füllen Sie auch die untere Kammer der Gelelektrophorese mit Laufpuffer. Geben Sie dann 10 Mikroliter Protein-Molekularmarker auf das Gel. Mischen Sie eine gleiche Menge der Probe mit einem Gel-Ladepuffer, der keine Reduktionsmittel enthält.Im Gegensatz zur herkömmlichen SDS-Gelelektrophorese die Proben nicht erhitzten, sondern direkt in die Gelasen laden. Mithilfe von Gel-Ladepipettenspitzen können diese Auen bis zu 20 Mikroliter Volumen aufnehmen. Die Abdeckung auf die Minizelle setzen und die Elektrodenkabel mit dem Netzgerät verbinden.Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie konstant 125 Volt für eine Laufzeit von 90 Minuten ein. Überprüfen Sie beim ersten Gel die Bildung kleiner Bläschen am Draht der unteren Kammer, die auf den Stromfluss hinweisen. Überwachen Sie alle 15 Minuten den Fortschritt der Migration unter Verwendung des im Lade-Puffer enthaltenen Bromphenolblau als Indikator für jedes Gel.Stellen Sie 100 Milliliter eines einmaligen xmo Gramm Rena-Puffers und 200 Milliliter eines xmo Gramm Entwicklungs-Puffers, beide in entionisiertem Wasser her. Wenn sich das Bromphenolblau-Frontfarbstoff am unteren Rand des Gels befindet, schalten Sie das Netzteil aus. Öffnen Sie die Minizelle und nehmen Sie das Gel heraus.Trennen Sie die beiden Seiten der Kassette. Schneiden Sie mit einem Gel-Messer eine Ecke ab, um die Laufrichtung des Gels zu markieren. Entfernen Sie das Gel vorsichtig aus der Kassette und legen Sie es in einen Behälter mit 100 Milliliter Rena-Puffer.Die Gele 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren, den Rena-Puffer entfernen und 100 Milliliter Entwicklungs-Puffer zum Gel hinzufügen. 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. Anschließend den Entwicklungs-Puffer entfernen und weitere 100 Milliliter frischen Entwicklungs-Puffer zum Gel hinzufügen.Die Gele über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Übernacht-Inkubation das Entwicklungs-Puffer entfernen und das Gel waschen, indem es mit entionisiertem Wasser und einer sanften Bewegung inkubiert wird. Diesen Waschschritt zweimal jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur wiederholen.Legen Sie das Gel auf eine Kunststoff-Hülle und entfernen Sie Luftblasen. Scannen Sie anschließend das Gel mit einem Fotokopierer, um die exakte Positionierung der Proteinmarker-Banden zu speichern, da diese später kaum noch sichtbar sein werden. Nach der Gelfärbung.Färben Sie das Gel, indem Sie 20 Milliliter Simply Blue Safe Stain zum Gel geben. Inkubieren Sie das Gel eine Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen Sie unter leichtem Rühren den Simply Blue Safe Stain und waschen Sie das Gel in 100 Milliliter entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Nach einer Stunde mit frischem entionisiertem Wasser auffüllen und das Gel mindestens eine Stunde weiter inkubieren. Um die Daten mittels Zytometrie zu analysieren, entfernen Sie das Gel vorsichtig aus dem Wasser und legen es in eine Kunststoff-Hülle. Scannen Sie das Gel mit einem Fotoscanner mit einer Auflösung von 300 Punkten pro Zoll oder höher. Speichern Sie das Bild im TIFF-Format. Öffnen Sie die TIFF-Datei in ImageJ oder einer ähnlichen Software zur Quantifizierung, um die Bandenintensitäten zu messen. Visualisieren Sie das Bild in Schwarzweiß, indem Sie den Bildtyp „Acht Bit“ auswählen.Verwenden Sie das Rechteck-Auswahlwerkzeug, um das erste Band zu umreißen, indem Sie ein Rechteck zeichnen, das mindestens doppelt so hoch wie breit ist. Wählen Sie „Gels analysieren“. Wählen Sie die erste Spur aus, und das Band wird markiert.Dann erscheint ein neues Rechteck. Verschieben Sie es zur nächsten Bande und wählen Sie „Gele analysieren“, dann die nächste Spur. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Bänder ausgewählt sind.Wählen Sie „Gele analysieren, Spuren plotten“, um das Profil-Diagramm für jedes Band zu erstellen. Verwenden Sie die Geraden-Auswahl, um Baselines zu zeichnen, sodass der Peak von Interesse eine vollständig umschlossene Fläche bildet. Wählen Sie das Zauberstab-Werkzeug aus und klicken Sie innerhalb jedes Peaks, um ihn zu markieren.Wählen Sie „Gele analysieren, Peaks markieren“, um eine Tabelle mit der Fläche jedes ausgewählten Peaks zu erhalten. Diese Daten können direkt dargestellt oder auf den Wert eines ausgewählten Bandes normalisiert werden. Diese Normalisierung ist besonders wichtig, wenn Werte aus mehreren Wiederholungsgele zusammengeführt werden, um die statistische Signifikanz der Ergebnisse zu bestimmen.Jedes Loch des hier gezeigten Gels wurde mit einer anderen Zellkultur beladen. Die Überstände enthielten unterschiedliche Mengen an MMP-2. Die direkte Beobachtung dieses Gels zeigt offensichtliche Unterschiede in den MMP-2-Konzentrationen zwischen einigen der Löchern.Beispielsweise ist deutlich, dass sowohl Brunnen vier als auch fünf deutlich mehr MMP zwei enthalten als die Brunnen 10 und 11. Zur objektiven Quantifizierung der Banden wurde eine dichte Zytometrie mit der Image-J-Software verwendet. Diese Software zeigte einen ungefähren vierfachen Unterschied in mmp an.Zwei Mengen zwischen, nun, 11 und den Vertiefungen vier und fünf. Ebenso wurde ein zweifacher Unterschied in den Mengen an MMP-2 zwischen den Vertiefungen 10 und den Vertiefungen vier und fünf beobachtet. Wir zeigen Ihnen lediglich, wie funktionelle Kenngrößen detektiert werden können.Metallpersis durch xog. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, dass Ihre Probe nicht gekocht werden darf. Andernfalls können Sie keine Banden in Ihrem Gel sehen.Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von magnetischen Pinzette, um die Wirkung von Gewalt auf enzymatische Proteolyse auf der Ebene einzelner Moleküle in einem hoch parallelisierbaren Weise zu studieren.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

In diesem Video führen wir Zymographie durch, eine elektrophoretische Technik, um die proteolytische Aktivität in biologischen Proben zu analysieren.

Fluoreszierende Peptid-Zymographie: Eine modifizierte Technik zum Nachweis der Proteaseaktivität unter Verwendung fluorogener Substrate in Zymogramm-Gelen

Dieses Video demonstriert die Zymographie-Gelelektrophorese-Technik zur Beurteilung der Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die in Zellkulturüberständen vorhanden sind. Die aktiven MMPs bauen das MMP-spezifische Substrat ab, das in ein Polyacrylamidgel eingebettet ist, das nach der Färbung als klare Banden auf einem dunklen gefärbten Hintergrund erscheint.

Zymographie-Gelelektrophorese: Eine elektrophoretische Technik zum Nachweis von Matrix-Metalloproteinasen durch Bewertung der enzymatischen Aktivität

Genaue Massenmessung stellt einen wichtigen Schritt bei der Untersuchung von Proteinen. Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (MS) für eine solche Bestimmung verwendet werden, und deren wesentliche Vorteil ist die Toleranz zu Salzen, Detergenzien und Verunreinigungen. Hier veranschaulichen wir eine zugängliche Ansatz für die Analyse von Proteinen, die größer als 100 kDa durch MALDI-MS.

Matrix-assistierte Laser Desorptions / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie-Analyse von intakten Proteinen mit mehr als 100 kDa

Dieses Protokoll beschreibt, wie man eine 2D-Mischmatrix, bestehend aus Gelatine und Kollagen I, und einem 3D-Kollagen-I-Plug, um lineare Invadosomen zu studieren, vorzubereiten. Diese Protokolle erlauben die Untersuchung der linearen Invadosomenbildung, der Matrixabbauaktivität und der Invasionsfähigkeit von Primärzellen und Krebszelllinien.

2D- und 3D-Matrizen zur Untersuchung der linearen Invadosomenbildung und -aktivität

Hier präsentieren wir Ihnen Auszüge mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie ein Protokoll Protease Spezifität im Rohöl Maus Gewebe zu bestimmen.

Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für eine modifizierte Zymographic-Technik in der fluoreszierenden Peptide als abbaubare Substrat anstelle von native Proteine verwendet werden. Elektrophorese von biologischen Proben in fluoreszierenden Peptid-Zymogramme ermöglicht die Detektion eines breiteren Spektrums von Proteasen als frühere Zymographic Techniken.

Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

Hier ist ein Protokoll für die Verkapselung und Kultivierung von Zellen in Poly(ethylene glycol) (PEG) Hydrogele funktionalisiert mit einem Fluorogenic Matrix-Metalloproteinase (MMP) präsentiert-abbaubar Peptid. Zelluläre MMP und Stoffwechselaktivität werden direkt von der Hydrogel-Kulturen mit einem standard Mikrotestplatte Reader gemessen.

Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele

His-Tag-Reinigung, Dialyse und Aktivierung werden eingesetzt, um die Ausbeute an löslicher, aktiver Matrix-Metalloproteinase-3-katalytischer Domänenproteinexpression in Bakterien zu erhöhen. Proteinfraktionen werden über SDS-PAGE-Gele analysiert.

Bakterielle Expression und Aufreinigung der humanen Matrix-Metalloproteinase-3 mittels Affinitätschromatographie

Proteinasen sind für die bakterielle Pathogenese von entscheidender Bedeutung und ermöglichen die Invasion und Immunumgehung. Die einstufige Extraktion von zytoplasmatischen und Membranproteinen von Bakterien in ihrer aktiven Form ist erschütternd. Dieser Videoartikel zeigt die Extraktion ganzzellulärer Proteine von Leptospira für die Zymographie-Analyse zum Nachweis und zur Charakterisierung von Gelatinasen.

Einstufige Extraktion und zymographische Analyse von bakteriellen Gelatinasen

Erfahren Sie die Zymographie zur Detektion funktioneller Matrix-Metalloproteinasen in Zellkulturüberständen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von MMP-Aktivität durch Gel-Elektrophorese und Bandendichtemessung.

Erkennung von Functional Matrix-Metalloproteinasen durch Zymographie

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