Name: Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T20:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Expansion neuronaler Stammzellen aus embryonalen Mausgehirnen mit dem Neurosphären-Assay. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung von Zellen aus den Ganglienhügeln für neurologische Forschung.

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1. Basic Set Up Bevor wir Dissection: <ol><li> Entsprechende Volumen der kompletten NSC Medium wird hergestellt, indem NeuroCult NSC Basal Medium und NeuroCult NSC Proliferation Supplements bei einem 9:1-Verhältnis, bzw. vorbereitet. </li><li> Das Medium wird in einem 37 ° C Wasserbad erwärmt. </li><li> Kalte HEPES-gepufferte Minimum Essential Medium (HEM) mit einer hohen Konzentration von Antibiotika (10%) ist für die Präparation und Waschen Zweck vorbereitet. Alternativ können NSC Basalmedium mit Antibiotika-Supplementierung ebenfalls für diesen Zweck verwendet werden. </li><li> 25-30 ml kaltem HEM mit Antibiotika ist in sterile 50 ml Röhrchen für Entnahme der Embryonen verzichtet. </li><li> Mehrere 10cm Petrischalen aus Kunststoff sind notwendig, um die Embryonen und Hirn bei der Präparation zu halten und auch seziert Gewebe zu halten. </li><li> Die chirurgische Instrumente, notwendig, um die Embryonen (große Schere, kleine spitze Schere, Pinzette große, kleine gebogene Pinzette) oder für die embryonale Gehirn Dissektion (kleine Pinzette, gebogen feinen Pinzette, 45 ° abgewinkelt feinen Pinzette und eine kleine Schere) zu entfernen sind sterilisiert mit Glasperlen Sterilisator bei 250 ° C oder anderen verfügbaren Autoklav-Verfahren. </li><li> Dissection Mikroskop ist mit 70% igem Alkohol abgewischt und im Inneren einer laminaren Strömung oder PC2 Haube gesetzt. </li></ol> 2. Harvesting E14 Maus Brain and Micro-Dissektion: <ol><li> Ein Mal gedeckt schwangere Maus ist am Tag betäubt den 14. Schwangerschaftswoche nach einem institutionellen genehmigt Tier-Protokoll. </li><li> Genickbruch wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Tier nicht leidet Schmerzen und Leiden. </li><li> Die narkotisierten Maus auf dem Rücken auf einem saugfähigen Papiertuch gelegt, und der Bauch ist mit 70% Ethanol gespült, um den Bereich zu sterilisieren. </li><li> Die Haut über dem Bauch gegriffen mit einer großen Zange, und dann die Haut und das darunterliegende Faszie wird mit großer Schere geschnitten, um die Bauchhöhle und die Uterushörner aussetzen. </li><li> Die Uteri werden mit kleinen Zangen und Scheren entfernt und sind in einem 50-ml konischen Rohr-haltigen Kälte HEM übertragen. </li><li> Die uterine Gewebe sind an der Haube übertragen und dann ein-oder zweimal mit genügend Volumen von frischem sterilen kalten HEM gespült, um mögliche Verunreinigungen wie Blut und Haare zu entfernen. </li><li> Die uterine Gewebe werden dann zu einer 10cm Petrischale mit kaltem HEM übertragen. </li><li> Die Uterushörner werden geöffnet, indem kleine gebogene Pinzette und Schere und die Embryonen werden in eine neue 10cm Schüssel, die kalte HEM enthält übertragen. </li><li> Die Köpfe der Embryonen werden bei der zervikalen Rückenmarks Ebene aufgetrennt und auf eine andere Petrischale mit kaltem HEM. </li><li> Die Petrischale wird unter einem Binokular übertragen auf das Gehirn aus dem Schädel zu entfernen. </li><li> Die Köpfe sind mit einer feinen gebogenen Pinzette aus der kaudalen Seite, so der Rückenseite des Kopfes nach oben zeigen statt. Mit Mikro-Schere wird zunächst ein horizontaler Schnitt oberhalb der Augen gemacht und dann weiter in der Mittellinie von der Stirn auf die Rückseite des Kopfes. Vergewissern Sie sich durch die Haut und den Schädel geschnitten und nicht auf die zugrunde liegende Hirnschädigung. </li><li> Das Gehirn ist vom Schädel, indem Sie die Ränder der Schnittfläche in einer Rückwärtsbewegung mit den gebogenen Pinzette entfernt. Dieses Verfahren wird fortgesetzt, bis alle Gehirne aus dem Schädel entfernt werden. </li><li> Das Gehirn ist stabil gehalten mit dem gebogenen Pinzette, so dass die Rückenseite nach oben und dann mit Blick über Mikroschere einen Schnitt durch die Rinde der beiden Hemisphären, die sich von den Riechkolben an der Rückseite der Hemisphäre zu den Ganglien-Eminenzen aussetzen durchgeführt wird. </li><li> Mit der gebogenen Pinzette in der Hand und der 45 ° abgewinkelte Pinzette in der anderen werden die geschnittenen Klappen Kortex verteilt und den Ganglien-Eminenzen sind herauspräpariert. </li><li> Die sezierten Gewebes wird in einer sterilen 10cm Petrischale gelegt, und dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis alle die Gehirne wurden Mikro-seziert. </li><li> Gewebestücke werden gesammelt, indem 1 mL der NSC-Medium in einem 1 mL Pipette und in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen. </li><li> Das Gewebe wird dann dissoziiert gründlich, aber sanft, indem Sie die Pipettenspitze auf den Boden der Röhre und Pipettieren der Suspension auf und ab. Auf diese Weise die Klumpen sind in einzelne Zellen gebrochen. Pipettieren ist 3-4 mal so, dass eine milchige wie Federung erreicht wird durchgeführt. Dann wird die Suspension für 1-2 Minuten so zufrieden wie die nicht-dissoziierten Klumpen ausfällt. </li><li> Fast die gesamte Zellsuspension wird auf die andere überführt und dann noch 1 ml NSC Medium ist, um die verbleibenden Klumpen und dissoziiert einzelne Zelle wie oben beschrieben aufgenommen. </li><li> Der Inhalt der Rohre werden gepoolt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, bei 700rpm (110g). </li><li> Der Überstand wird abgesaugt bis zur eigentlichen Pellet, und die Zellen werden in 1 ml komplettem NSC-Medium resuspendiert. </li><li> Das Medium wird sanft auf und pipettiert biseine homogene einzigen Zellsuspension. </li><li> 10 ul der Zellsuspension mit 90 ul von Trypanblau auf eine Zellzahl führen gemischt. </li><li> Schließlich werden die Zellen bei der Dichte von 2x10 5 Zellen / ml in kompletten NSC Medium mit 20ng / ml epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ausplattiert. 5 ml Medium für T25, 20 mL für T75 und 40 mL für T175 Flaschen verwendet. </li><li> Neurosphären sind in 5-7 Tagen gebildet werden, wenn bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 inkubiert. In 6-7 Tagen sollte die Sphären zwischen 150-200 Mikrometer messen und bereit sein wird, Subkultur (Durchgang). </li></ol> 3. Die Passage und Expansion von embryonalen NSCs: <ol><li> Wenn die Neurosphären bereit für Subkultur (150-200 &amp;mgr; m Durchmesser) sind, ist das Medium, mit hängenden Kugeln aus den Flaschen entfernt, in einer angemessenen Größe sterile Zellkulturgefäß und zentrifugiert bei 700 rpm (110 g) für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Der Überstand wird verworfen und die Kugeln sind in 1 ml% 0,05 Trypsin-EDTA resuspendiert. </li><li> Die Zellsuspension wird dann in einem 37 ° C Wasserbad für 2-3 min inkubiert, dann ein gleiches Volumen an Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor verwendet wird, um das Trypsin zu stoppen. </li><li> Die Zellsuspension wird vorsichtig nach oben und unten pipettiert, um sicherzustellen, dass die Trypsin wurde komplett inaktiviert. </li><li> Die Zellsuspension wird bei 700 rpm (110g) für 5 min zentrifugiert. Dann wird der Überstand abgenommen und die Zellen werden in 1 ml komplettem NSC-Medium resuspendiert. </li><li> 10 ul der Zellsuspension mit 90 ul von Trypanblau auf eine Zellzahl führen gemischt. </li><li> Die Zellen werden in einer Konzentration von 5x10 4 Zellen / ml in kompletten NSC Medium mit 20ng / ml EGF in einer angemessenen Größe Zellkulturflasche ausplattiert. 5 ml Medium für T25, 20 mL für T75 und 40 mL für T175 Flaschen verwendet. </li><li> Sekundäre Neurosphären sind in 5-7 Tagen gebildet werden, wenn bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 inkubiert. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: In primären embryonalen NSC Kultur, wird die Mehrheit der Zellen hypertrophe geworden und heften sich an das Gewebe Kulturschalen auf Plattierung. Während die Mehrheit der Zellen entweder sterben oder zu differenzieren, nach 2-3 Tagen, um proliferative Zellen kleine Gruppen von Zellen, die aus dem Substrat (Abbildung 1) lösen wird. Bildung von großen kugelförmigen Aggregaten in den ersten 48-Stunden-Kultur sollte nicht für die primäre Sphären verwechselt werden. Aggregatbildung hängt hauptsächlich von der Mengen von Schutt und nicht-dissoziierten Gewebe Klumpen in der Kultur. Wahre Neurosphären werden Phase hell und werden mehr als sphärische Größe zunimmt (Abbildung 2). Kleine microspikes erscheint auf der äußeren Oberfläche des lebensfähig und gesund Kugeln (Abbildung 3). Nach 5-7 Tagen, müssen die Kugeln rund sein, aber nicht verdichtet, und sollte zwischen 150 und 200 um im Durchmesser messen. Wenn Neurosphären erlaubt sind zu groß werden (nach 9-10 Tagen in Kultur), könnten sie Aggregate bilden oder dunkel in der Farbe, weil der Zelltod in der Mitte der Kugeln (siehe Video). Große Neurosphären könnten irgendwann anfangen zu in situ zu unterscheiden (Befestigung auf dem Substrat und die Migration in Richtung der Peripherie). Es ist auch schwierig, große Neurosphären distanzieren und Subkultur sie. <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Primary E14 NSC Kultur 3 Tage nach dem Ausplattieren. Die Pfeile zeigen die proliferierenden Cluster von NSCs. Original-Vergrößerung; 20x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Primäre E14 NSC Kultur 7 Tage nach dem Ausplattieren. Original-Vergrößerung, 10x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Gang sind E14 Neurosphären 5 Tage nach dem Ausplattieren. Beachten Sie die Mikro-Spikes (Pfeile) an der Peripherie der Kugeln. Original-Vergrößerung, 20x

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Craig, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+factor+expansion+of+endogenous+subependymal+neural+precursor+cell+populations+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain.</a> J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li>
</ol>

Die Neurosphäre Test ist die Methode der Wahl für die Isolierung und Expansion von neuralen Stammzellen 1-5 wegen seiner Einfachheit und Reproduzierbarkeit. Dieser Assay ist ein unschätzbares Werkzeug für Großanlagen von undifferenzierten Vorläuferzellen ZNS, die sowohl für in vitro und in vivo-Studien verwendet werden könnte. Es sollte betont werden, dass Neurosphären sowohl von der bona fide neuralen Stammzellen und mehr eingeschränkt Vorfahren konnten generiert werden kann. Daher Berechnu...

* Um HEM machen, mischen 110L Paket MEM and160ml 1M HEPES und bringen das Volumen auf 8,75 L mit destilliertem Wasser. Setzen Sie den End-pH auf 7,4 und speichern Sie sie bei 4 ° C.

gründung embryonale maus neural stem cell culture mit dem neurosphäre assay

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In Säugetieren wirkt Stammzellen als Quelle von undifferenzierten Zellen zu Zelle Entstehung und Erneuerung in verschiedenen Geweben und Organen während der Lebensdauer des Tieres zu erhalten. Sie können möglicherweise ersetzen Zellen, die in den Alterungsprozess oder in den Prozess der Verletzungen und Krankheiten verloren gehen. Die Existenz von neuralen Stammzellen (NSCs) wurde zuerst von Reynolds und Weiss (1992) in der erwachsenen Säugetieren zentralen Nervensystems (ZNS) mit einem neuartigen serumfreien Kultur-System, das Neurosphäre Assay (NSA) beschrieben. Unter Verwendung dieses Tests ist es auch möglich zu isolieren und zu erweitern NSCs aus verschiedenen Regionen des embryonalen ZNS. Diese in vitro erweitert NSCs sind multipotente und kann zu den drei wichtigsten Zelltypen des ZNS geben. Während die NSA scheint relativ einfach durchzuführen, um die Verfahren demonstriert hier Aufmerksamkeit erforderlich ist, um verlässliche und konstante Ergebnisse zu erzielen. Dieses Video zeigt praktisch NSA zu erzeugen und zu erweitern NSCs aus embryonalen Tag 14-Maus-Gehirngewebe und erbringt technische Details so dass man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen. Das Verfahren schließt die Gewinnung E14 Mausembryonen, Gehirn Mikrodissektion zu den Ganglien-Eminenzen, Dissoziation des geernteten Gewebes in NSC Medium Ernte einer einzigen Zellsuspension zu gewinnen, und schließlich plating Zellen in NSA Kultur. Nach 5-7 Tagen in Kultur, sind die resultierenden primären Neurosphären passagiert weiter ausbauen die Anzahl der NSCs für zukünftige Experimente.

Dieses Video-Protokoll zeigt die Anwendung der Neurosphäre Assay für die Isolierung und Expansion von neuronalen Stammzellen, die aus den Ganglien-Eminenzen der embryonalen Tag 14-Maus-Gehirn.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

Bei Säugetieren dienen Stammzellen als Quelle undifferenzierter Zellen, um die Zellgenese und Erneuerung in verschiedenen Geweben und Organen im Laufe des Lebens aufrechtzuerhalten ...

Das Ziel dieses Video-Protokolls ist die Isolierung und Expansion von neuronalen Stammzellen aus dem embryonalen Mausgehirn unter Verwendung des Neurosphären-Assays. Das Verfahren umfasst die Gewinnung von E14-Mausembryonen, gefolgt von einer mikrochirurgischen Gehirndissektion zur Entnahme der ganglionären Eminenzen, die Dissoziation des gewonnenen Gewebes, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, und schließlich das Ausplattieren der Zellen in Neurosphären-Kultur. Hallo, ich bin Hassan Ali aus dem Labor von Dr. Brent Frennels am Mite Brain Institute der University of Florida.Heute werde ich Ihnen zeigen, wie man eine Neurosphärenkultur aus dem embryonalen Maushirn mithilfe des Neurosphärenassays etabliert. In unserem Labor verwenden wir diesen Assay routinemäßig, um neuronale Stammzellen zu isolieren und zu vermehren. Gut, fangen wir an.Betäuben Sie eine trächtige Maus zum Zeitpunkt der Paarung. Am 14. Tag der Trächtigkeit führen Sie eine Halswirbelzerreißung durch und spülen den Bauchraum mit 70 % Ethanol. Greifen Sie die Bauchhaut mit einer großen Pinzette und schneiden Sie dann die Haut und die darunterliegende Faszie mit einer großen Schere auf.Um die Bauchhöhle und die Uterushörner freizulegen, entfernen Sie die Uterushörner mit den Embryonen und überführen Sie sie in ein 50-ml-Konischglas, das kaltes him enthält. Nachdem Sie das Uterusgewebe in die PC2-Werkbank überführt haben, entfernen Sie das him aus dem 50-ml-Gefäß und spülen Sie das Gewebe mit ausreichend frischem, kaltem him aus, um Verunreinigungen wie Blut und Haare zu entfernen; führen Sie zwei bis drei derartige Spülgänge durch. Überführen Sie das Uterusgewebe in eine 10 cm große Petrischale, die kaltes him enthält.Öffnen Sie die Uterushörner mit kleinen gebogenen Pinzetten und einer Schere und überführen Sie die Embryonen in eine neue Schale mit kaltem HEM. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Embryonen gewonnen wurden. Anschließend platzieren Sie die Embryonen unter dem Stereomikroskop.Trennen Sie die Köpfe der Embryonen auf Höhe des zervikalen Rückenmarks und überführen Sie sie in eine andere Petrischale, die kaltes Häm enthält. Halten Sie den Kopf mit feinen gebogenen Pinzetten und verwenden Sie Mikroscheren. Führen Sie zunächst einen horizontalen Schnitt oberhalb der Nase aus und setzen Sie dann den Schnitt in der Mittellinie von der Stirn zum Hinterkopf fort.Stellen Sie sicher, dass Sie durch die Haut und den Schädel schneiden, ohne das darunterliegende Gehirn zu beschädigen. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, indem Sie die Ränder des Schnittbereichs mit der gebogenen Pinzette rückwärts drücken. Fahren Sie mit diesem Vorgehen fort, bis alle Gehirne aus den Schädeln entfernt sind.Halten Sie das Gehirn mit der gebogenen Pinzette fest, sodass die dorsale Seite nach oben zeigt, und schneiden Sie dann mit einer Mikroschere von den Riechkugeln bis zum Hinterende der Hemisphäre durch die Großhirnrinde jeder Hemisphäre. Um die Ganglieneminenz freizulegen, halten Sie das Gehirn an Ort und Stelle und dissezieren Sie die gesamte Ganglieneminenz mit einer 45-Grad-gekippten Pinzette aus und überführen Sie sie in eine andere Petrischale. Die Ganglieneminenz ist hier deutlich mit ihren medialen und lateralen Anteilen dargestellt.Alternativ können Sie die ganglionären Eminenzen durch Entfernen des umgebenden Gewebes mit feinen Pinzetten präparieren. Sie können die gesamte Eminenz auch in eine mediale und eine laterale Hälfte schneiden, wenn Sie Zellen aus einem dieser Bereiche kultivieren möchten.Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Gehirne mikrodisseziert wurden. Sammeln Sie die Gewebestücke mit einem Milliliter neuronalem Stammzellmedium und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Lassen Sie die Gewebeklumpen im 15-Milliliter-Röhrchen absetzen, um sicherzustellen, dass kein Gewebe zurückbleibt.Entfernen Sie einen Teil des überstehenden Überstandes und waschen Sie den Boden der Petrischale ab, um zusätzliches Gewebe in den 15-ml-Tubus zu überführen. Dabei platzieren Sie die Pipettenspitze an der Unterseite des Tubus. Pipettieren Sie die Suspension drei- bis viermal auf und ab, um das Gewebe aufzulösen und eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.Dann lassen Sie die Suspension eine Minute lang ruhen, damit sich die nicht assoziierten Klumpen absetzen können; überführen Sie anschließend nahezu die gesamte Zellsuspension in ein anderes 15-ml-Röhrchen. Geben Sie dann ein Milliliter Neuro-Stammzellmedium zu den verbleibenden Klumpen hinzu und dissoziieren Sie diese zu Einzelzellen. Ziehen Sie den Inhalt der Röhrchen ab.Anschließend die Suspension fünf Minuten lang bei 700 U/min oder 110 ×g zentrifugieren. Den Überstand entfernen und die Zellen in einem Milliliter vollständigem Neurostammzellmedium resuspendieren. 10 Mikroliter der Zellsuspension entnehmen und gut mit 90 Mikrolitern Trypanblau vermischen.Nehmen Sie anschließend 10 Mikroliter dieser Suspension und überführen Sie sie in ein Hämozytometer. Führen Sie eine Zellzählung durch. Überführen Sie insgesamt 20 ml komplettes neuronales Stammzellmedium in ein 50-ml-Konischglas, um eine T-80-Flasche zu beimpfen.Dann die Zellsuspension mischen und eine geeignete Menge an Zellen hinzufügen, um eine Gesamtdichte von 200.000 Zellen pro Milliliter oder 4 Millionen Zellen pro T-80-Flasche zu erreichen. EGF in einer Endkonzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter zugeben. Die Zellen in vollständigem neuronalem Stammzellmedium mit Wachstumsfaktor mischen und die Zellsuspension in T-80-Flaschen überführen.Beschriften Sie den Kolben und überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass eine Einzelzell-Suspension ohne Gewebeklumpen vorliegt. Stellen Sie den Kolben für fünf bis sieben Tage in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2. Bewerten Sie den Kolben nach fünf bis sieben Tagen unter dem Mikroskop.Zu diesem Zeitpunkt haben sich Neurosphären gebildet und sollten einen Durchmesser zwischen 150 und 200 Mikrometern aufweisen; sie sind nun bereit für die Subkultur. Sammeln Sie den Inhalt des Kolbens in einem sterilen Gewebekulturgefäß passender Größe, zentrifugieren Sie das Gefäß und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Sphären in einem mittleren Milliliter vorgewärmtem Trypsin und stellen Sie das Gefäß zwei Minuten lang in ein Wasserbad bei 37 Grad.Anschließend eine gleiche Menge Trypsininhibitor hinzufügen und vorsichtig, aber gründlich mischen, um die Trypsinaktivität zu stoppen. Nochmals zentrifugieren und den Überstand entfernen. Die Zellen anschließend in einem Milliliter vollständigem neuronalem Stammzellmedium resuspendieren und wie zuvor beschrieben eine Zellzählung durchführen. Um einen T-175-Flasken zu beimpfen, insgesamt 40 ml vollständiges neuronales Stammzellmedium in ein 50-ml-Konischgefäß überführen. Anschließend die Zellen mischen und eine geeignete Menge an Zellen hinzufügen, um eine Gesamtdichte von 50.000 Zellen pro M oder 2 Millionen Zellen pro T175-Flasche zu erreichen. Danach EGF in einer Endkonzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter zugeben. Die Zellen in vollständigem neuralen Stammzellmedium mit Wachstumsfaktor mischen und die Zellsuspension in eine T175-Flasche überführen.Beschriften Sie den Kolben und stellen Sie ihn für fünf bis sieben Tage in einen Inkubator. Dies ist ein Beispiel für eine primäre E14-Neuralstammzellkultur. Drei Tage nach der Aussaat zeigen die Pfeile proliferierende Zellverbände aus Neuralstammzellen.Sie können auch Zellen sehen, die am Substrat haften und differenziert sind. Dies ist ein Beispiel für eine primäre E 14 Neuros-Stammzellkultur sieben Tage nach der Aussaat. Wie Sie erkennen können, gibt es Sphären unterschiedlicher Größe.Es gibt auch Zellen, die differenziert sind. Die Menge an Zelltrümmern ist im Vergleich zu primären neurosphäroiden Kulturen aus erwachsenen Organismen deutlich geringer. Außerdem sind die Sphäroide nicht verdichtet und weisen mikroskopische Ausstülpungen am Rand auf, was darauf hinweist, dass die Sphäroide gesund und vital sind.Die Sphäre sollte nicht zu groß werden, da sie aufgrund von Zelltod im Zentrum dunkel in der Farbe werden könnte. Große Sphären könnten außerdem am Substrat anhaften und differenzieren. Dies ist ein Beispiel für Neurosphären der Passage eins vom Embryo Tag 14, fünf Tage nach der Aussaat.Auch hier sehen Sie die mikroskopischen Fortsätze am Rand der Sphären. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Neurosphären aus ganglionären Eminenzen von E14-Mäusen unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren kultiviert. Sie können Neurosphären auch aus anderen Hirnregionen wie Cortex und Mesencephalon gewinnen.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Neurosphärenkulturen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video-Protokoll zeigt die Neurosphäre Assay-Methode zu generieren und zu erweitern neurale Stammzellen aus dem erwachsenen Maus periventrikulären Region und erbringt technische Erkenntnisse, um sicherzustellen, kann man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Dieses Video-Protokoll zeigt, wie zu diskriminieren und aufzählen bona fide neurale Stammzellen in einer gemischten Population von neuralen Vorläuferzellen über die neuronalen Kolonie-bildenden-Zell-Assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

Diese Video-Protokoll zeigt ein neues Verfahren zur Erzeugung und anschließender Reinigung von neuronalen Vorläuferzellen aus einer erneuerbaren Quelle von neuralen Stammzellen (NSC) an körperlicher (Größe und Granularität internen) und fluoreszierenden Eigenschaften unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Technologie.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Das Video zeigt den Prozess der Isolierung und Kultivierung von neuralen Stammzellen aus der subkallosalen Zone des Mäusegehirns. Dabei geht es um das Präparieren von Gewebe, die enzymatische Dissoziation und die Kultivierung mit Differenzierungsfaktoren, um sich zu reifen Nervenzellen zu entwickeln.

Isolierung und Kultivierung adulter neuraler Stammzellen aus der subkallosalen Zone der Maus

Dieses Video zeigt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung der lateralen Ventrikelwände aus dem erwachsenen Mausgehirn und zur Durchführung einer enzymatischen Gewebedissoziation, um einzelne Zellen zu erhalten. Diese Zellen werden dann spezifischen Kulturbedingungen ausgesetzt, die die Proliferation von neuralen Stammzellen selektiv fördern und ihre Differenzierung in Co-Kulturen von Oligodendrozyten und Astrozyten fördern.

Gewinnung einer gemischten Oligodendrozyten- und Astrozytenkultur aus adulten neuralen Stammzellen der Maus

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Neurale Stammzellen (NSCs) beziehen sich auf Zellen, die selbst zu erneuern und differenzieren sich in die drei neuronale Abstammungslinien. Hier beschreiben wir ein Protokoll NSC Frequenz in einer gegebenen Zellpopulation zu bestimmen, Neurosphärenbildung und Differenzierung unter klonalen Bedingungen.

Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Hier zeigen wir die Leistung eines minimalen Rückenmark Verletzungen Modells in einer Erwachsenen Maus, die den zentralen Kanal Nische Gehäuse endogenen neurale Stammzellen (NSCs) erspart. Wir zeigen, wie neurosphäre Assay verwendet werden kann, um Aktivierung und Migration der definitive und primitiven NSCs nach Verletzung zu quantifizieren.

Ein Neurosphäre Assay auszuwertende endogenen neurale Stammzellen Aktivierung in einem Mausmodell der minimalen Spinal Cord Injury

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

In diesem Artikel beschreiben wir ausführlich ein Protokoll zur Erzeugung von Neurosphärenkulturen aus postnatalen mausneuronischen Stammzellen, die aus den wichtigsten neurogenen Nischen der Maus abgeleitet sind. Neurosphären werden verwendet, um neuronale Stammzellen aus Hirngewebe zu identifizieren, was die Schätzung von Vorläuferzellzahlen ermöglicht. Darüber hinaus können diese 3D-Strukturen unter differenziativen Bedingungen plattiert werden, was zu Neuronen, Oligodendrozyten und...

Isolierung und Expansion von Neurosphären aus postnatalen (P1-3) Maus neurogenen Nischen

Hier beschreiben wir ein Nukleofektionssystem, das die Effizienz der Genübertragung in expandierten neuralen Stammzellen (NSCs) verbessern soll, die aus der adulten subventrikulären Zone von Mäusen isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Genstörung in NSCs signifikant verbessert, die Wirksamkeit traditioneller Transfektionsprotokolle übertrifft und die Überlebensrate der Zellen erhöht.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Lernen Sie die Isolierung und Expansion neuronaler Stammzellen aus embryonalen Mausgehirnen mit dem Neurosphären-Assay. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung von Zellen aus den Ganglienhügeln für neurologische Forschung.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

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