Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

Das Ziel dieses Video-Protokolls ist die Isolierung und Expansion von neuronalen Stammzellen aus dem embryonalen Mausgehirn unter Verwendung des Neurosphären-Assays. Das Verfahren umfasst die Gewinnung von E14-Mausembryonen, gefolgt von einer mikrochirurgischen Gehirndissektion zur Entnahme der ganglionären Eminenzen, die Dissoziation des gewonnenen Gewebes, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, und schließlich das Ausplattieren der Zellen in Neurosphären-Kultur. Hallo, ich bin Hassan Ali aus dem Labor von Dr. Brent Frennels am Mite Brain Institute der University of Florida.

Heute zeige ich Ihnen, wie man eine Neurosphärenkultur aus dem embryonalen Maushirn mithilfe des Neurosphärenassays etabliert. In unserem Labor verwenden wir diesen Assay routinemäßig, um neuronale Stammzellen zu isolieren und zu vermehren. Gut, fangen wir an.

Betäuben Sie eine trächtige Maus zum Zeitpunkt der Paarung. Am 14. Tag der Trächtigkeit führen Sie eine Halswirbelzerreißung durch und spülen den Bauchraum mit 70 %igem Ethanol ab. Greifen Sie die Bauchhaut mit einer großen Pinzette und schneiden Sie dann die Haut und die darunterliegende Faszie mit einer großen Schere auf.

Um die Bauchhöhle und die Gebärmutterhörner freizulegen, entfernen Sie die Gebärmutterhörner mit den Embryonen und überführen Sie sie in ein 50-ml-Konischglas, das kaltes him enthält. Nachdem Sie das Uterusgewebe in die PC2-Werkbank überführt haben, entfernen Sie das him aus dem 50-ml-Gefäß und spülen Sie das Gewebe mit ausreichend frischem, kaltem him aus, um Verunreinigungen wie Blut und Haare zu entfernen; führen Sie zwei bis drei derartige Spülgänge durch. Überführen Sie das Uterusgewebe in eine 10 cm große Petrischale, die kaltes him enthält.

Öffnen Sie die Uterushörner mit kleinen gebogenen Pinzetten und einer Schere und überführen Sie die Embryonen in eine neue Schale mit kaltem Häm. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Embryonen gewonnen wurden. Anschließend stellen Sie die Embryonen unter das Stereomikroskop.

Trennen Sie die Köpfe der Embryonen auf Höhe des zervikalen Rückenmarks und überführen Sie sie in eine andere Petrischale, die kaltes Häm enthält. Halten Sie den Kopf mit feinen gebogenen Pinzetten und verwenden Sie Mikroscheren. Führen Sie zunächst einen horizontalen Schnitt oberhalb der Nase aus und setzen Sie dann den Schnitt in der Mittellinie von der Stirn zum Hinterkopf fort.

Stellen Sie sicher, dass Sie durch die Haut und den Schädel schneiden, ohne das darunterliegende Gehirn zu beschädigen. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, indem Sie die Ränder des Schnittbereichs mit der gebogenen Pinzette rückwärts drücken. Fahren Sie mit diesem Vorgehen fort, bis alle Gehirne aus den Schädeln entfernt sind.

Halten Sie das Gehirn mit der gebogenen Pinzette fest, sodass die dorsale Seite nach oben zeigt, und schneiden Sie dann mit einer Mikroschere von den Riechkugeln bis zum Hinterende der Hemisphäre durch die Großhirnrinde beider Hemisphären. Um die Ganglienanhöhen freizulegen, halten Sie das Gehirn fest und dissezieren Sie die gesamte Ganglienanhöhe mit einer 45-Grad-gekippten Pinzette aus und überführen Sie sie in eine andere Petrischale. Die Ganglienanhöhe ist hier deutlich mit ihren medialen und lateralen Anteilen dargestellt.

Alternativ können Sie die ganglionären Eminenzen durch Entfernen des umgebenden Gewebes mit feinen Pinzetten präparieren. Sie können die gesamte Eminenz auch in eine mediale und eine laterale Hälfte schneiden, wenn Sie Zellen aus einem dieser Bereiche kultivieren möchten.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Gehirne mikrodisseziert wurden. Sammeln Sie die Gewebestücke mit einem Milliliter Neuralen Stammzellmedium und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Lassen Sie die Gewebeklumpen im 15-Milliliter-Röhrchen absetzen, um sicherzustellen, dass kein Gewebe zurückbleibt.

Entfernen Sie einen Teil des überstehenden Überstandes und waschen Sie den Boden der Petrischale ab, um zusätzliches Gewebe in den 15-ml-Tubus zu überführen. Dabei platzieren Sie die Pipettenspitze an der Unterseite des Tubus. Pipettieren Sie die Suspension drei- bis viermal auf und ab, um das Gewebe aufzulösen und eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.

Dann lassen Sie die Suspension eine Minute lang ruhen, damit sich die nicht assoziierten Klumpen absetzen; überführen Sie anschließend nahezu die gesamte Zellsuspension in ein anderes 15-ml-Gefäß. Geben Sie dann ein Milliliter Neuro-Stammzellmedium zu den verbleibenden Klumpen hinzu und dissoziieren Sie diese zu Einzelzellen. Ziehen Sie den Inhalt der Gefäße ab.

Anschließend die Suspension fünf Minuten lang bei 700 U/min oder 110 ×g zentrifugieren. Den Überstand entfernen und die Zellen in einem Milliliter vollständigem Neurostammzellmedium resuspendieren. 10 Mikroliter der Zellsuspension entnehmen und gut mit 90 Mikrolitern Trypanblau vermischen.

Entnehmen Sie anschließend 10 Mikroliter dieser Suspension und überführen Sie sie in ein Hämozytometer. Führen Sie eine Zellzählung durch. Überführen Sie insgesamt 20 ml vollständiges neuronales Stammzellmedium in ein 50-ml-Konischglas, um eine T-80-Flasche zu beimpfen.

Danach die Zellsuspension mischen und eine geeignete Menge an Zellen hinzufügen, um eine Gesamtdichte von 200.000 Zellen pro Milliliter oder 4 Millionen Zellen pro T-80-Flasche zu erreichen. EGF in einer Endkonzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter zugeben. Die Zellen in vollständigem neuronalem Stammzellmedium mit Wachstumsfaktor mischen und die Zellsuspension in T-80-Flaschen überführen.

Beschriften Sie den Kolben und überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass eine Einzelzell-Suspension ohne Gewebeklumpen vorliegt. Stellen Sie den Kolben für fünf bis sieben Tage in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2. Bewerten Sie den Kolben nach fünf bis sieben Tagen unter dem Mikroskop.

Zu diesem Zeitpunkt haben sich Neurosphären gebildet und sollten einen Durchmesser zwischen 150 und 200 Mikrometern aufweisen; sie sind nun bereit für die Subkultur. Sammeln Sie den Inhalt des Kolbens in einem sterilen Gewebekulturgefäß passender Größe, zentrifugieren Sie das Gefäß und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Sphären in einem mittleren Milliliter vorgewärmtem Trypsin und stellen Sie das Gefäß zwei Minuten lang in ein Wasserbad bei 37 Grad.

Dann eine gleiche Menge Trypsininhibitor hinzufügen und vorsichtig, aber gründlich mischen, um die Trypsinaktivität zu stoppen. Nochmals zentrifugieren und den Überstand entfernen. Die Zellen anschließend in einem Milliliter vollständigem neuronalem Stammzellmedium resuspendieren und wie zuvor beschrieben eine Zellzählung durchführen. Um einen T-175-Flasken zu beimpfen, insgesamt 40 ml vollständiges neuronales Stammzellmedium in ein 50-ml-Konischgefäß überführen.

Anschließend die Zellen mischen und eine geeignete Menge an Zellen hinzufügen, um eine Gesamtdichte von 50.000 Zellen pro M oder 2 Millionen Zellen pro T175-Flasche zu erreichen. Danach EGF in einer Endkonzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter zugeben. Die Zellen in vollständigem neuralen Stammzellmedium mit Wachstumsfaktor mischen und die Zellsuspension in eine T175-Flasche überführen.

Beschriften Sie den Kolben und stellen Sie ihn für fünf bis sieben Tage in einen Inkubator. Dies ist ein Beispiel für eine primäre E 14 neuronale Stammzellkultur. Drei Tage nach der Aussaat zeigen die Pfeile proliferierende Zellverbände neuronaler Stammzellen.

Sie können auch Zellen sehen, die am Substrat haften und differenziert sind. Dies ist ein Beispiel für eine primäre neuronale Stammzellkultur vom Embryonalstadium E 14, sieben Tage nach der Aussaat. Wie Sie erkennen können, sind Kugeln verschiedener Größen vorhanden.

Es gibt auch Zellen, die differenziert sind. Die Menge an Zelltrümmern ist deutlich geringer als in primären adulten Neurosphärokulturen. Außerdem sind die Sphäroide nicht verdichtet und weisen mikroskopische Ausstülpungen am Rand auf, was darauf hinweist, dass die Sphäroide gesund und vital sind.

Die Sphäre sollte nicht zu groß werden, da sie aufgrund von Zelltod im Zentrum dunkel in der Farbe werden könnte. Große Sphären könnten außerdem an das Substrat anhaften und differenzieren. Dies ist ein Beispiel für Neurosphären der Passage eins von E 14, fünf Tage nach der Plättierung.

Auch hier sehen Sie erneut die mikroskopischen Fortsätze am Rand der Sphären. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Neurosphären aus den Ganglienanhöhen von E14-Mäusen unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren kultiviert. Sie können Neurosphären auch aus anderen Hirnregionen wie dem Kortex und dem Mesencephalon gewinnen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Neurosphärenkulturen.