Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, organotypische Hippocampus-Schnitte zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der Hippocampus präpariert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den Hippocampus zu schneiden.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die hippokampalen Schnitte zu trennen und zu sortieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Kultivieren der hippokampalen Schnitte. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die gesunde organische hippokampale Schnitte durch Visualisierung mit einem Dissektionsmikroskop oder einem Mikroskop zeigen.

Hallo, mein Name ist Jimena Opitz und ich bin Wissenschaftlerin im Labor von Dr. Andres bar an der University of Washington in Seattle. Ich werde die Methode zur Kultur organotypischer Hippocampus-LICs demonstrieren. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Hypocampi schnell disseziert und geschnitten werden müssen, und um Kontaminationen zu vermeiden, ist eine sterile Dissektionslösung und sterile Schnittkultur erforderlich.

Das Medium kann bis zu drei Wochen im Voraus hergestellt und wie im schriftlichen Protokoll beschrieben bei vier Grad Celsius gelagert werden. Vor der Herstellung von Hippocampus-Schnitten können Kulturen vorbereitet werden. Es ist notwendig, sowohl den Zellkulturhauben als auch die für die Dissektion verwendeten Geräte ordnungsgemäß zu sterilisieren.

Wischen Sie zuerst die innere Oberfläche der Zellkulturhaube mit 70%igem Ethanol ab. Stellen Sie dann das Stereomikroskop und alle Dissektionsinstrumente in die Haube. Bereiten Sie den Gewebescheren vor, indem Sie ein sauberes Teflon-Blatt auf den Probentisch legen und ein neues Messer montieren.

Stellen Sie den Gewebeschneider in der Gewebekulturhaube mithilfe einer UV-Lampe auf und sterilisieren Sie alle Oberflächen und Geräte 15 Minuten lang. Schalten Sie die Lampe aus, nachdem der UV-Sterilisationsprozess abgeschlossen ist. Arbeiten Sie in der Gewebekulturhaube.

Bereiten Sie zunächst die sechs Vertiefungen umfassenden Gewebekulturplatten für die Kultivierung der hippocampalen Schnitte vor. Pipettieren Sie 750 Mikroliter SEM in jede Vertiefung der Sechs-Vertiefungsplatte. Anschließend platzieren Sie mit sterilen Pinzetten einen Zellkultur-Einlegebehälter in jede Vertiefung der Gewebekulturplatte.

Darauf achten, dass keine Luftblasen unter dem Insert eingeschlossen werden. Es ist wichtig, dass die Membran jedes Zellkultur-Inserts mit dem Gewebekulturmedium benetzt ist. Falls die Membran trocken ist, überprüfen, ob Luftblasen vorhanden sind.

Wenn sich die Membran oberhalb des Meniskus des SCM befindet, kann weiteres Medium in die Vertiefung gegeben werden. Stellen Sie die vorbereiteten Kulturplatten in einen Gewebekultur-Inkubator. Lagern Sie sie bei 35 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, bis sie benötigt werden.

Schließlich füllen Sie einen Eisbehälter mit einer Mischung aus Eis und Salz und stellen Sie ihn neben den Enthauptungsbereich, wobei die Arbeit im Abzug durchgeführt wird. Füllen Sie einen 100-Milliliter-Becher mit Dissektionslösung. Stellen Sie den Becher in die Eis-Salz-Mischung und sprudeln Sie die Lösung 10 bis 20 Minuten lang mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff, bis sich die Farbe von rosa nach orange verändert.

Und die Dissektionslösung bildet eine Suspension aus gefrorener und flüssiger Lösung. Nun sind die Umgebung für die Dissektion und die Zellkulturplatten bereit für die Dissektion. P drei bis P sieben Wicklung.

Bei diesem Verfahren werden Welpen verwendet. Kulturen können aus bis zu drei Würfen gleichzeitig vorbereitet werden. Dieses Verfahren wird anhand eines einzelnen Welpen veranschaulicht.

Entnehmen Sie das Gehirn schnell aus dem dekapitierten Welpen und legen Sie es für eine Minute in den 100-Milliliter-Becher, der die Dissektionslösung Slurry Chill enthält. Bereiten Sie währenddessen eine Dissektionswanne vor, indem Sie etwa 10 Milliliter eiskalte Dissektionslösung auf den Boden einer 60-Millimeter-Zellkulturschale geben. Überführen Sie mithilfe eines abgerundeten Löffels oder einer Mikroschaufel das Gehirn aus dem 100-Milliliter-Becher in die 60-Millimeter-Schale, die mit kaltem Dissektionsmedium gefüllt ist. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn vollständig von der Dissektionslösung bedeckt ist.

Platzieren Sie die Schale mit dem Gehirn unter dem Stereomikroskop. Suchen Sie mithilfe des Stereomikroskops das Gehirn und zentrieren Sie es im Sichtfeld, indem Sie steriles anatomisches Besteck verwenden.

Halten Sie das Gehirn in der Mittellinie mit der Präparationspinzette, die auf den Boden der Schale gedrückt wird. Benutzen Sie das Hippocampus-Präparationstool, um vorsichtig die kortikalen Hemisphären vom Mittelhirn abzulösen, wobei das Mittelhirn an Ort und Stelle verbleibt; idealerweise bleiben die kortikalen Hemisphären mit dem restlichen Gehirn verbunden. Nun ist der Hippocampus freigelegt. Nehmen Sie das Hippocampus-Präparationstool und heben Sie den Hippocampus aus einer Hemisphäre heraus.

Verwenden Sie dann die Präpariernadel, um so viel wie möglich an nicht-hippocampalem Gewebe zu entfernen. Sobald der erste Hippocampus isoliert und gereinigt ist, wiederholen Sie diesen Vorgang für den zweiten Hippocampus aus der anderen Hemisphäre. Verwenden Sie anschließend sterile Schere, um die Spitze einer P-1000-Filterpipettenspitze abzuschneiden.

Bringen Sie die Pipettenspitze auf einer sterilen P-1000-Pipette an. Aspirieren Sie vorsichtig einen Hippocampus und überführen Sie ihn auf das Teflonblatt am Gewebeschneider. Platzieren Sie anschließend auf ähnliche Weise den zweiten Hippocampus auf dem Schneidegerät.

Platzieren Sie die hippocampalen Hälften auf ihren konkaven Seiten und richten Sie sie senkrecht zur Klinge aus. Aspirieren Sie die überschüssige Flüssigkeit von dem Teflon-Blatt. Stellen Sie den Feinmechanismus oder den Messschieber auf die Nullposition ein. Schneiden Sie die Hippocampi in 400-Mikrometer-Schnitte.

Bereiten Sie eine weitere abgeschnittene P-1000-Filterpipettenspitze vor und befestigen Sie sie an einer sterilen P-1000-Pipette. Gießen Sie etwa 10 Milliliter kaltes SCM in eine sterile 60-Millimeter-Zellkulturschale. Geben Sie mithilfe der Pipette etwas Medium hinzu und überführen Sie die hippokampalen Schnitte vom Schneidegerät in die Schale.

Vermeiden Sie das Entstehen von Blasen; nachdem Sie den Übertragungsprozess für alle Schnitte wiederholt haben, stellen Sie die Schale unter das Stereomikroskop. Ziehen Sie abschließend mit einem Iris-Spatel und einem geraden Spatel vorsichtig die Schnitte voneinander auseinander.

Trennen Sie die gut definierten und unbeschädigten Schnitte von beschädigten Schnitten. Die gut definierten hippocampalen Schnitte sind nun bereit, kultiviert zu werden. Entnehmen Sie dem Inkubator die zuvor vorbereiteten sechs-Loch-Gewebekulturplatten mit SCM und Gewebekultur-Einlagen, und überführen Sie mit einer P-1000-Pipette und einer abgeschnittenen, breiten Pipettenspitze vier bis fünf einzelne Schnitte pro Membran.

Falls erforderlich, die Schnitte mit dem Iris-Spatel voneinander trennen. Darauf achten, die Schnitte nicht zu nahe an der Insert-Wand oder in unmittelbarer Nähe zueinander zu platzieren. Unter sorgfältiger Vermeidung von Berührungen der Schnitte überschüssiges Medium von der oberen Oberfläche der Zellkultur absaugen.

Membran einsetzen. Schließlich die Platte, die nun die Hippocampus-Schnittkulturen enthält, in den Gewebekultur-Inkubator zurückbringen. Auf 35 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid einstellen.

Nach 48 Stunden entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator, wobei Sie im Gewebekulturhaubenarbeitsplatz arbeiten. Aspirieren Sie das Medium mit einer Hintenpipette. Geben Sie 750 Mikroliter frisches vorgewärmtes SCM pro Platte hinzu.

Erneut sicherstellen, dass sich unter der Membran des Zellkultur-Inserts keine Blasen bilden. Dies ist ein Beispiel für eine gesunde hippocampale Schnittpräparation, die bereit zur Kultivierung ist. Die CA1-, CA3-Regionen und der Gyrus dentatus, Bereiche des Hippocampus, sind deutlich sichtbar und unbeschädigt.

Hier ist eine beschädigte Hippocampus-Schnittstelle gezeigt, die nicht für die Kultur verwendet wurde. Schließlich ist dies ein Beispiel für eine gesunde Hippocampus-Schnittstelle nach vier Tagen in Kultur. Beachten Sie, dass die Schnittstelle unter dem Stereomikroskop weiß erscheint und die Oberfläche der Schnittstelle sauber ist.

Die Regionen CA eins, CA drei und Gyrus dentatus des Hippocampus sind deutlich sichtbar und unbeschädigt. Sobald man sie beherrscht, kann diese Technik in etwa einer Stunde durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, stets geeignete Steriltechniken anzuwenden und das Gewebe schonend zu behandeln. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man organotypische Schnitte kultiviert. Hippocampale Lyse.

Vielen Dank und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.