Name: Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Lernen Sie die Methode zur Kultivierung von organotypischen Hippocampus-Schnitten für Neurowissenschaften. Diese Technik bewahrt die Gewebearchitektur über zwei Wochen und ermöglicht Studien zur Hippocampus-Funktion in vitro.

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Diese Arbeit wurde von NINDS finanziert - NIH R01NS060756

1. Vor dem Start der Vorbereitung von Schnitten des Hippocampus. <ol><li> Bereiten Sie das Gewebe Allesschneider, indem ein Stück Teflon Blatt und Montage einer neuen Klinge. </li><li> Wischen Sie die Gewebekultur (TC) Kapuze mit 70% Ethanol und stellen Sie die Präpariermikroskop innen. Sterilisieren der Haube, Mikroskop, Gewebe Hobel und alle Sezierbesteck für 15 Minuten mit UV-Licht. </li><li> Bereiten Sie sechs gut TC-Platten. Add 750 ul Stück Kultur Medien (SCM) pro Vertiefung und Ort Zellkultureinsätzen in jede Vertiefung. Sicherstellen, dass die Membranen sind völlig nass ohne Blasen darunter. Legen Sie die Platten im Brutschrank bei 35 ° C mit 5% CO 2 begast, bis sie benötigt. </li><li> Gießen Sie 50 mL niedrigen Na + ACSF (Sezieren Lösung) in einem 100 mL Becherglas und stellen Sie es auf dem Eis-Salz-Mischung. Blase den niedrigen Na + ACSF mit 5% CO 2 / 95% O 2 bis zum Farbumschlag und ACSF bildet einen Schlamm-Mix von gefrorenen und flüssigen Lösung (10-20 min). </li><li> Get a P5-P7 Jungtier. Bis zu drei Welpen eingesetzt werden kann. </li></ol> 2. Schnitten des Hippocampus Vorbereitung. <ol><li> Schneiden Sie den Kopf des Tieres mit scharfen Schere Dienstprogramm. Schneiden Sie die Haut und setzen den Schädel. Öffnen des Schädels durch Schneiden von Seite zu Seite entlang der interauralen Linie und dann entlang der Sagittalnaht mit einer kleinen Schere. Eine optionale Schnitt von Seite zu Seite in der Front gemacht zu erleichtern das Entfernen der Knochen und der Exposition des Gehirns sein. Scoop aus dem Gehirn schnell mit einem abgerundeten Löffel Mikrospatel und legen Sie sie in die Gülle zu sezieren Lösung für ~ 1 Minute chill. Gießen Sie ca. 10 mL eiskaltem Sezieren Lösung auf eine 60 mm Schale und den Transfer des Gehirns aus dem Becher in die Schale. Das Gehirn soll mit Sezieren Lösung abgedeckt werden. </li><li> Unter dem Binokular: Place des Gehirns und halten Sie ihn an der Mittellinie mit der Pinzette gedrückt, um den unteren Rand des 60 mm Schale. Verwenden Sie den Hippocampus Sezieren Werkzeug, um die Halbkugeln Weglassen des Mittelhirns zu trennen. Der Hippocampus werden dann auf jeder Hemisphäre ausgesetzt. Dann vorsichtig mit einer Schaufel Hippocampus mit dem Hippocampus Sezieren Werkzeug. Verwenden Sie die Präpariernadel völlig zu isolieren Hippocampus und reinigen Sie sie so weit wie möglich. </li><li> Mit einem snipped Spitze eines P1000 Filter Pipettenspitze vorsichtig aspirieren Hippocampus und überträgt es auf die Teflon Folie auf das Gewebe Schneidemaschine. Position des Hippocampus auf der konkaven Seite. </li><li> Richten Sie die hippocampi senkrecht zur Klinge koronalen Abschnitte zu erhalten und Drain überschüssige Flüssigkeit. </li><li> Schneiden Sie die hippocampi alle 400 um. </li><li> Gießen Sie ca. 10 ml kaltem SCM in eine 60 mm Schale und den Transfer in Scheiben geschnitten hippocampi vom Allesschneider mit anderen snipped P1000 Filter Spitze und kalten SCM. Vermeiden Sie Luftblasen. </li><li> Mit Hilfe eines Iris-Spachtel und einer geraden Spatel vorsichtig trennen die Scheiben voneinander. </li><li> Separate gut definiert und unbeschädigt Scheiben von beschädigten Scheiben. </li></ol> 3. Schnitten des Hippocampus Kultur <ol><li> Bringen Sie die Sechs-Well-Platten mit SCM-und Zellkultur-Einsätze aus dem Inkubator. Mit Hilfe eines anderen snipped P1000 Filter Spitze, Transfer einzelnen Scheiben auf die Membran. Legen Sie 4-5 Scheiben pro Membran. Achten Sie darauf, statt der Scheiben entweder an die Wand legen nahe oder dicht beieinander. Wenn nötig, verwenden Iris Spatel zu trennen Scheiben schneiden. Entfernen Sie überschüssiges Medium. Touch-Scheiben so wenig wie möglich, sobald sie auf der Membran sind. </li><li> Bewegen Platte zurück zum Inkubator und Kultur bei 35 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ändern SCM alle 48 Stunden innerhalb des TC Haube durch Absaugen des SCM mit einer Pasteurpipette. Add 750 ml frisches vorgewärmtes SCM pro Vertiefung. Achten Sie darauf, keine Blasen unter der Membran gebildet werden. </li></ol> 4. Lösungen <ol><li> Low Na + ACSF - Dissecting Lösung für Slice Kulturen Um deionisiertem und sterilem H 2 O hinzu: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Für 500 ml </td><td> Für 1000 ml </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> CaCl 2 (1 M) </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 mL </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> 0,901 g </td><td> 1,802 g </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 0,149 g </td><td> 0,298 g </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 (1 M) </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 mL </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 1,092 g </td><td> 2,184 g </td><td> 26 mM </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 40 g </td><td> 80 g </td><td> 234 mm </td></tr><tr><td> Phenolrotlösung 0,5% in DPBS </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 mL </td><td> 0,1% v / v </td></tr></tbody></table> Mix ~ 30 min Sterilize Durchgang durch 0,22 &amp;mgr; m-Filter Machen Sie 50 mL aliquotiert und bei 4 ° C nicht länger als 2 Monate. </li><li> Slice-Kulturmedium (SCM) <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Für 500 ml </td><td> Für 1000 ml </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> MEM Eagle Medium </td><td> 4,2 g </td><td> 8,4 g </td><td> 8,4 g / l </td></tr><tr><td> Pferdeserum hitzeinaktiviertem </td><td> 100 mL </td><td> 200 mL </td><td> 20% </td></tr><tr><td> L-Glutamin (200 mM) </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 mL </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 (1 M) </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 mL </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 (1 M) </td><td> 1 mL </td><td> 2 mL </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Insulin (1 mg / mL), gelöst in 0,01 N HCl </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 mL </td><td> 1 mg / l </td></tr><tr><td> Ascorbinsäure, Lösung (25% w / v) </td><td> 0,024 ml </td><td> 0,048 ml </td><td> 0,00125% </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> 1.16g </td><td> 2.32g </td><td> 13 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 0.22g </td><td> 0,44 g </td><td> 5,2 mm </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 3.58g </td><td> 7.16g </td><td> 30 mM </td></tr></tbody></table> Mix bis gänzlich aufgelöst und auf Raumtemperatur bringen. Der pH-Wert auf 7,27 bis 7,28 mit 1 N NaOH Messen Osmolarität. Passen Sie auf 320 mmol / kg mit deionisiertem und sterilisiert H 2 O. Erwarten Sie etwa 25-40 ml hinzuzufügen. Überprüfen Sie Osmolarität wieder. *** PH-Wert kann etwas ändern beim Einstellen der Osmolarität, das in Ordnung ist, ist es umso wichtiger, dass die Osmolarität im richtigen Bereich (317-323) ist. Sterilisieren durch Passage durch 0,22 um-Filter. Machen Sie 20 mL Aliquots und speichern bis zu 2-3 Wochen bei 4 ° C. Gluatamine Lager: Vorbereitung in einer Konzentration von 200 mM und bei -20 ° C in Aliquots von 2,5 mL. Ascorbinsäure Lager: Vorbereitung in einer Konzentration von 25% (w / v) und bei -20 ° C in Aliquots von 100 ul. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Scheiben aussehen sollte unter einem Binokular weiß ohne schwarze Flecken und gut definiert und unbeschädigt CA1, CA3 und Gyrus dentatus Regionen. Bakterielle Kontamination ist leicht wie das Verschieben schwarze Flecken in der mittleren oder Trübung des SCM zu sehen. Wenn unter dem Mikroskop gelegt, sollte die Oberfläche der Scheibe schauen nach 4 Tagen in Kultur sauber mit klaren und nachvollziehbaren Zellkörper. Wenn keine klare Zellkörper zu sehen sind und viel Schutt bedeckt die Oberfläche nach 4 Tagen, dann ist keine gesunde Scheibe.

<ol><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).</li>
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<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> J Physiol. 550, 135-147 (2003).</li>
</ol>

Diese Methode basiert auf der Methode zuerst von Stoppini et al beschrieben ist. 11 und bietet eine schnelle Art und Weise zur Kultur Schnitten des Hippocampus. Der wichtigste Aspekt dieses Protokolls ist die Erhaltung Scheiben steril, daher ist es wichtig, geeignete sterile Techniken zu verwenden und richtig zu desinfizieren und sterilisieren das gesamte Material in Kontakt mit dem Gewebe. Verschiedene Seren Quellen können Einfluss auf die Qualität der Scheiben....

<table><tbody><tr><td>Zellkultur-Einlegeplatten</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>6-Loch-Platten</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gewebeschneider</td><td>Stoelting Co.</td><td>51425/51415</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX7-ILLD2-100</td><td></td></tr><tr><td>Hippocampus-Dissektionswerkzeug</td><td>F.S.T.</td><td>10099-15</td><td></td></tr><tr><td>Große Universalschere. Perfection</td><td>F.S.T.</td><td>37500-00/37000-00 rechts/links</td><td></td></tr><tr><td>Iris-Spatel</td><td>F.S.T.</td><td>10093-13</td><td></td></tr><tr><td>Gerader Spatel</td><td>F.S.T.</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>Runder Löffel-Mikroschaber</td><td>VWR international</td><td>57949-039</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsnadel mit einer Schneidkante</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72946</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionspinzette</td><td>Dumont</td><td>#2</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Dissektionsschere</td><td>F.S.T.</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle-Medium</td><td>Cellgro</td><td>50-019 PB</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum, hitzeinaktiviert</td><td>Invitrogen</td><td>26050-88</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>Insulin (1 mg/ml), gelöst in HCl 0,01 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure, Lösung (25 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrot-Lösung 0,5 % in DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr></tbody></table>

organotypischen hippokampalen slice-kulturen

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Der Hippocampus, einer Komponente des limbischen Systems, spielt eine wichtige Rolle in das Langzeitgedächtnis und die räumliche Navigation 1. Hippocampus-Neuronen können die Stärke ihrer Verbindungen nach kurzen starke Aktivierung ändern. Dieses Phänomen, das als Langzeit-Potenzierung (LTP) bekannt ist, kann für Stunden oder Tage dauern und ist mittlerweile der beste Kandidat Mechanismus für Lernen und Gedächtnis 2. Darüber hinaus hat der gut definierten Anatomie und Konnektivität des Hippocampus 3 hergestellt ist ein klassisches Modellsystem zur synaptischen Übertragung und synaptische Plastizität 4-Studie. Als unser Verständnis der Physiologie des Hippocampus Synapsen wuchs und molekulare Spieler identifiziert wurde, wurde die Notwendigkeit, synaptischer Proteine ​​zu manipulieren unerlässlich. Organotypischen hippokampalen Kulturen bieten die Möglichkeit für eine einfache Genmanipulation und präzise pharmakologische Intervention, sondern pflegen synaptischen Organisation, die entscheidend für das Verständnis Synapse Funktion in einem naturalistischen Kontext als Routine-Kultur dissoziierten Neuronen Methoden ist. Hier präsentieren wir eine Methode zur Vorbereitung und Kultur Schnitten des Hippocampus, die leicht auf andere Hirnregionen angepasst werden können. Diese Methode ermöglicht den einfachen Zugriff auf die Scheiben zur genetischen Manipulation mit unterschiedlichen Ansätzen, wie virale Infektionen oder 5,6 Biolistik 7. Darüber hinaus können Scheiben leicht für biochemische Assays 8 gewonnen werden, oder an Mikroskopen für die Bildgebung 9 oder elektrophysiologischen Experimenten 10.

Wir beschreiben eine Methode zur organotypischen Schnitten des Hippocampus, die leicht auf andere Hirnregionen angepasst werden vorbereiten können. Hirnschnitten sind auf porösen Membranen und Kulturmedien ist erlaubt, um eine Schnittstelle bilden gelegt. Diese Methode schont die grobe Architektur des Hippocampus für bis zu 2 Wochen in Kultur.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

Der Hippocampus, eine Komponente des limbischen Systems, spielt eine wichtige Rolle für das Langzeitgedächtnis und die räumliche Navigation 1. Hippocampale Neuronen können die ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, organotypische Hippocampus-Schnitte zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der Hippocampus präpariert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den Hippocampus in Schnitte zu zerteilen.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die hippokampalen Schnitte zu trennen und zu sortieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Kultivieren der hippokampalen Schnitte. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die gesunde organische Hippo-Hippocampus-Schnitte durch Visualisierung mit einem Dissektionsmikroskop oder einem Mikroskop zeigen.Hallo, mein Name ist Jimena Opitz und ich bin Wissenschaftlerin im Labor von Dr. Andres bar an der University of Washington in Seattle. Ich werde die Methode zur Kultur organotypischer Hippocampus-LICs demonstrieren. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Hypocampi schnell disseziert und geschnitten werden müssen und Kontaminationen vermieden werden müssen, weshalb sterile Dissektionslösung und sterile Schnittkultur erforderlich sind.Das Medium kann bis zu drei Wochen im Voraus hergestellt und wie im schriftlichen Prot

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Die organoptypic Hippocampus Stück Kultur-Modell ist...

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Herstellung von organotypischen Hippocampus-Schnittkulturen aus dem Gehirn eines Rattenwelpen. Es beschreibt die Schritte bei der Dissektion des Hippocampus, das Schneiden und die Kulturbedingungen, die erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit und das Wachstum der Zellen in den Hippocampus-Schnitten zu fördern und letztendlich organotypische Schnittkulturen zu erzeugen.

Präparation von organotypischen Schnittkulturen aus dem Hippocampus eines Rattenwelpen

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Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

Pair-Aufzeichnungen sind simultane Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von zwei synaptisch verbundenen Neuronen, die eine präzise elektrophysiologische und pharmakologische Charakterisierung der Synapsen zwischen einzelnen Neuronen ermöglichen. Hier beschreiben wir die detaillierte Methodik und die Anforderungen für die Etablierung dieser Technik in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen in jedem Labor, das für Elektrophysiologie ausgestattet ist.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

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Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung Hippocampus postnatale Neurogenese mit dem organotypischen Kulturtechnik. Dieses Verfahren ermöglicht die in vitro Manipulation von Neurogenese und ermöglicht die direkte Anwendung von pharmakologischen Wirkstoffen an die kultivierten Hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

Wir beschreiben ein Protokoll zur zelltypspezifischen Expression des genetisch codierten FRET-basierten Sensors ATeam1.03YEMK in organotypischen Scheibenkulturen des Mausvorhirns. Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Sensor für die dynamische Bildgebung von zellulären ATP-Spiegeln in Neuronen und Astrozyten verwendet wird.

Bildgebung von intrazellulärem ATP in organotypischen Gewebescheiben des Maushirns mit dem FRET-basierten Sensor ATeam1.03YEMK

Hier beschreiben wir die Herstellung von rhinalen Kortex-Hippocampus organotypischen Scheiben. Unter einem allmählichen und kontrollierten Serumentzug zeigen diese Scheiben sich entwickelnde epileptische Ereignisse und können als Ex-vivo-Modell der Epileptogenese angesehen werden. Dieses System stellt ein hervorragendes Werkzeug zur Überwachung der Dynamik spontaner Aktivität sowie zur Beurteilung des Fortschreitens neuroinflammatoratorischer Merkmale im Verlauf der Epileptogenese dar.

Ein Modell der Epileptogenese in rhinalen Kortex-Hippocampus Organotypischen Schnittkulturen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von horizontalen Hippocampus-entorhinalen Kortex-Scheiben (HEC) von Mäusen, die eine spontane scharfe Wellenwelligkeit saufen. Slices werden in einer vereinfachten Grenzraum-Haltekammer inkubiert und Aufnahmen werden unter getauchten Bedingungen mit schnell fließender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchgeführt, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes und die spontane Entstehung von Netzwerkaktivität zu fördern.

Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein systematisches Protokoll zu beschreiben, um horizontale Hippocampus-Gehirnscheiben bei Mäusen zu erhalten. Das Ziel dieser Methode ist es, die Integrität von Hippocampus-Faserwegen zu erhalten, wie dem Perforantenweg und dem moosigen Fasertrakt, um dentate Gyrus-bezogene neurologische Prozesse zu bewerten.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

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