Quantifizierung von dsDNA mit dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer und PicoGreen Dye
5. November 2010
Demonstration der Quantifizierung von dsDNA mit Molecular Probes PicoGreen Farbstoff und Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer mit einem Mikroplatten-Reader Zubehör ausgestattet.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Fähigkeit des F 7.000 Fluoreszenz-Spektrophotometers mit Mikroplatten-Reader zur Quantifizierung von doppelsträngiger DNA mit dem grünen Farbstoff Pico zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Proben und Reagenzien vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Instrument einzurichten.
Der dritte Schritt des Verfahrens ist das Laden von Proben in den Mikroplatten-Reader. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Messung von Standards und Proben. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine lineare Kalibrierungskurve zeigen, die für die Quantifizierung von doppelsträngiger DNA unbekannter Proben verwendet werden könnte.
Schalten Sie das Hitachi F 7, 000 Spectra Fluorimeter ein, damit sich die Xenon-Lampe eine Stunde lang in Excel aufwärmen kann. Erstellen Sie eine Datei mit den Standards und Beispieldaten und speichern Sie sie im kommagetrennten Format oder im CSV-Format. Um das Fluorimeter zuerst einzurichten, klicken Sie auf die Methodenschaltfläche, die das Fenster für die Analysemethode öffnet.
Wählen Sie im Messfeld Photometrie aus dem Pulldown-Menü aus. Klicken Sie nun auf den Reiter Quantifizierung. Wählen Sie im Feld Quantifizierungstyp die Option Wellenlänge aus, um anzugeben, dass die Fluoreszenzmessung mit einer bestimmten Wellenlänge durchgeführt wird.
Wählen Sie für den Kalibrierungstyp die erste Ordnung aus, und wählen Sie für die Anzahl der Wellenlängen eine aus. Geben Sie als Konzentrationseinheit Nanogramm pro Milliliter ein. Stellen Sie sicher, dass die Kontrollkästchen für die manuelle Kalibrierung und die Kraftkurve durch Null nicht aktiviert sind. Nach dem Dezimaltrennzeichen wählen Sie zwei aus, geben Sie Null für die untere Konzentrationsgrenze und 10.000 für das obere Konzentrationsgrenzfeld ein.
Klicken Sie anschließend auf die Registerkarte "Instrument" und wählen Sie im Feld "Datenmodus" die Option "Fluoreszenz" aus. Stellen Sie sicher, dass das Feld für die Häckselgeschwindigkeit inaktiv ist, da es nur für Phosphoreszenzmessungen verwendet wird. Wählen Sie im Feld Wellenlängenmodus sowohl WL fest im Feld ex WL eins als auch 480 Nanometer in das Feld EM WL ein.
Geben Sie 520 Nanometer ein. Lassen Sie alle anderen Felder unter EX und EM inaktiv. Stellen Sie sowohl den Ex-Spalt als auch den EM-Spalt auf 5,0 Nanometer ein.
Lassen Sie das Feld vor dem Feld PMT-Spannung von eins bis 1000 Volt mithilfe der Pulldown-Menüs deaktiviert. Wählen Sie für die PMT-Spannung 700 Volt aus dem Pulldown-Menü. Wählen Sie außerdem zwei für die Berechnung der automatischen Statistik: Nummer eins für Replikationen: 0,1 Sekunden für die Integrationszeit und null für die Verzögerung.
Öffnen Sie nun den Monitor-Tab und setzen Sie das Feld why axis max auf 10.000 und why axis min auf null. Wählen Sie dann das Kästchen links neben der offenen Datenverarbeitung nach der Datenerfassung und ggf. das Kästchen links neben dem Druckprotokoll nach der Datenerfassung für einen Bericht, der nach Abschluss der Messwerte automatisch gedruckt werden soll. Um schließlich alle ausgewählten Parameter in den verschiedenen Registerkarten des Fensters mit der Analysemethode zu speichern, klicken Sie auf die Registerkarte Allgemein und speichern Sie sie unter einem neuen Dateinamen an einem bestimmten Ort.
Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um dieses Fenster zu schließen. Damit ist die Einrichtung der Testparameter des Instruments abgeschlossen. Um den Mikroplatten-Reader einzurichten, klicken Sie auf die MPR-Schaltfläche, um das MPR-Setup-Fenster in den Vordergrund zu bringen.
Wählen Sie zunächst Bohrungen für die Standards aus. Klicken Sie zum Beispiel auf die Position A eins und ziehen Sie die Maus auf E eins. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Standard-Set.
Dadurch werden die Positionen ausgewählt, die für die Standards verwendet werden sollen, die in grüner Farbe hervorgehoben sind. Wählen Sie dann Positionen für die Proben aus. Klicken und ziehen Sie die Maus über die entsprechenden Positionen auf der Platte und klicken Sie dann auf die Schaltfläche für das Sample-Set, die die ausgewählten Positionen automatisch gelb hervorhebt.
Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für die Positionen der gewünschten Probenmessungen. Um die Standards und Beispielinformationen in die zuvor vorbereitete Datei mit kommagetrennten Variablen zu laden. Klicken Sie auf die Registerkarte Bohrlochinformationen des MPR-Setup-Fensters.
Wählen Sie die Schaltfläche "Informationen zum Bohrloch laden" und es öffnet sich ein Windows Explorer-Fenster, in dem Sie die CSV-Datei mit den Bohrlochinformationen identifizieren können. Nach dem Laden der Informationen sollte das Fenster als Tabelle angezeigt werden. Um eine Arbeitslösung aus Pico-Grünreagenz herzustellen, fügen Sie 50 Mikroliter 200 X PicoGrün-Reagenz zu 9,95 Millilitern TE-Puffer hinzu.
Bereiten Sie für die Standardkurve serielle Verdünnungen von doppelsträngiger Lambda-DNA in TE-Puffer für Endkonzentrationen von einem bis 100 Nanogramm pro Milliliter vor. Piptieren Sie 150 Mikroliter jedes Standards in die dafür vorgesehenen Vertiefungen einer 96-Well-Plattenplatte. Pipettieren Sie anschließend 150 Mikroliter jeder Testprobe in die entsprechenden dafür vorgesehenen Vertiefungen der Platte. Geben Sie nun mit einer Mehrfachpipette 150 Mikroliter Pico grüne Lösung in jede Vertiefung und mischen Sie die Lösung und die DNA-Proben.
Inkubieren Sie die Platte vorsichtig zwei bis fünf Minuten lang an einem dunklen Ort, damit sich die Reaktion entwickeln kann. Klicken Sie auf die Schaltfläche MPR-Anzeigebildschirm, um das MPR-Setup-Fenster oben auf dem Display anzuzeigen, und klicken Sie auf die Schaltfläche für die Austauschposition. Die Mikrotiterplatten-Halteplattform bewegt sich zur Vorderseite des Geräts, öffnet die Tür des Mikrotiterplatten-Readers und platziert die 96-Well-Platte auf der Halteplattform, wobei die A-Vertiefung nach vorne zeigt, und schließt die Klappe des Mikroplatten-Readers.
Klicken Sie auf die Schaltfläche für die Anfangsposition, um Position A einer der Mikroplatten in die Messposition zu bringen. Klicken Sie auf die Schaltfläche für die Monitoranzeige, um das Messfenster an den oberen Rand des Displays zu bringen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Messen, um mit der Messung der Standards und unbekannten Proben zu beginnen.
Eine gute Kalibrierkurve wird anhand der verschiedenen Parameter ausgewertet, die von der Software F 7.000 zur Verfügung gestellt werden. Zum Beispiel hat diese ideale Kalibrierungskurve, die für die Quantifizierung von doppelsträngiger DNA mit dem grünen Farbstoff Pico erhalten wurde, einen berechneten Bestimmungskoeffizienten von 0,99993. Bei dem beschriebenen Hochdurchsatzsystem handelt es sich um eine serielle Montage von Technologien, darunter Pico Green Dye, ein Hitachi F 7.000 Fluoreszenz-Spektralphotometer, das mit einem Mikroplatten-Reader und einem Softwareprogramm zur Automatisierung der Datenerfassung, Speicherung, Analyse und Präsentation ausgestattet ist.
Die Kombination leistungsstarker Technologien kann dem zunehmenden Bedarf an der genauen Analyse kleiner Mengen von Doppelsträngen gerecht werden. DNS.
Überblick
Dieser Artikel demonstriert die Quantifizierung von doppelsträngiger DNA (dsDNA) unter Verwendung von PicoGreen-Farbstoff und dem Hitachi F-7000 Fluoreszenzspektrophotometer mit einem Mikroplattenleser. Das Verfahren beschreibt die Vorbereitung von Proben, Geräteeinrichtung und Messprozesse, um eine lineare Kalibrierkurve für die dsDNA-Quantifizierung zu erhalten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Fluoreszenzspektroskopie
- DNA-Quantifizierung
- Mikroplattenlesertechnologie
Hintergrund
- PicoGreen-Farbstoff ist ein empfindlicher fluoreszierender Farbstoff, der zur Quantifizierung von dsDNA verwendet wird.
- Das Hitachi F-7000 ist ein vielseitiges Fluoreszenzspektrophotometer.
- Eine genaue DNA-Quantifizierung ist für verschiedene biologische Experimente unerlässlich.
- Hochdurchsatzsysteme erleichtern die Analyse mehrerer Proben gleichzeitig.
Zweck der Studie
- Um die Fähigkeit des F-7000-Spektrophotometers zur dsDNA-Quantifizierung zu demonstrieren.
- Um eine zuverlässige Methode zur Messung unbekannter DNA-Proben zu etablieren.
- Um eine lineare Kalibrierkurve für eine genaue Quantifizierung zu erstellen.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung des PicoGreen-Reagenz und der DNA-Standards.
- Einrichten der Parameter des Hitachi F-7000-Spektrophotometers.
- Beladen der Proben in den Mikroplattenleser.
- Messung der Fluoreszenz zur Erstellung einer Kalibrierkurve.
Hauptergebnisse
- Eine lineare Kalibrierkurve wurde für die dsDNA-Quantifizierung etabliert.
- Die Methode zeigte hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit.
- Die Ergebnisse zeigten einen Bestimmungskoeffizienten von 0,99993.
- Das System analysierte effektiv kleine Mengen an dsDNA.
Schlussfolgerungen
- Die Kombination von PicoGreen-Farbstoff und dem F-7000-Spektrophotometer bietet eine robuste Methode zur DNA-Quantifizierung.
- Dieser Hochdurchsatz-Ansatz erfüllt die Anforderungen an eine genaue Analyse in der biologischen Forschung.
- Die Methode kann auf verschiedene Studien angewendet werden, die präzise DNA-Messungen erfordern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of double-stranded DNA is a foundational requirement for target validation, assay development, and preclinical model generation in biopharma R&D. The Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with PicoGreen dye enables high-sensitivity, high-throughput measurement of dsDNA, supporting reliable standard curve generation for downstream applications. This method provides predictive confidence in nucleic acid quantification, reducing variability in early discovery workflows and enabling scalable, reproducible data generation across compound screening and biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise measurement of dsDNA concentrations for cloning, transfection, and PCR-based target validation assays.
- Operational Value: Supports reproducible sample preparation and quantification, reducing technical variability in hypothesis-driven experiments.
- Predictive Value: Generates linear calibration curves with high determination coefficients (R² > 0.999), ensuring accurate quantification of unknown samples in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative fluorescence readouts compatible with 96-well formats for assay standardization and reagent titration.
- Operational Value: Enables rapid measurement of 96 wells in under 60 seconds using kinetics mode, supporting high-throughput screening readiness.
- Scalability: Software allows saving and recalling microplate configurations, facilitating consistent assay setup across teams and projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Delivers reliable dsDNA quantification for biomarker analysis, PCR validation, and vector production in preclinical models.
- Risk Mitigation: High sensitivity (50 picomoles fluorescein equivalent) and wide dynamic range (5 orders of magnitude) allow accurate quantification across dilution series, reducing false negatives in low-abundance targets.
- Workflow Integration: Outputs data to Excel or report formats, enabling seamless transfer to bioinformatics and analytical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical development, where accurate nucleic acid quantification is essential for experimental reproducibility and data integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise dsDNA measurement for cloning efficiency, gene expression analysis, and mutagenesis studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs that support assay robustness and compound library normalization.
- Analytics: Generates linear calibration curves and determination coefficients (R²) that allow inter-experiment comparison and quality control.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through reliable quantification of DNA in drug formulations, viral vectors, and biomarker assays.
- Enterprise Reuse: Configurable software and standardized protocols allow reuse across departments, reducing method redevelopment and increasing operational efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High sensitivity and specificity for dsDNA reduce false signals and improve data confidence in molecular assays.
- Operational Value: Automated data collection, storage, and presentation via software minimize manual handling and transcription errors.
- Strategic Value: Reliable quantification supports go/no-go decisions in lead optimization by ensuring accurate dosing and normalization in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing trustworthy nucleic acid data for candidate selection and formulation studies.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence spectroscopy and microplate reader operation.
- Necessitates access to Hitachi F-7000 spectrophotometer with microplate reader accessory and compatible software.
- Demands standardized reagent preparation (PicoGreen dilution in TE buffer) and sample handling to avoid fluorescence quenching.
- Involves optimization of incubation time (2–5 minutes in dark) and wavelength settings (Ex 480 nm, Em 520 nm) for signal consistency.
- Includes practical limitations such as the need for dark incubation and potential interference from contaminants or organic solvents.
