Name: Quantifizierung von dsDNA mit dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer und PicoGreen Dye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung von dsDNA mit PicoGreen-Farbstoff und dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer. Diese Methode ermöglicht präzise DNA-Messungen mit hoher Sensitivität und einem Bestimmtheitsmaß von 0,99993.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Instrument Setup <ol><li> Schalten Sie den Spektrofluorometer und warmlaufen lassen für 1 Stunde. </li><li> Mit Excel erstellen Sie eine Datei mit den Standards und Sample-Daten, wie in Abbildung 1 gezeigt und speichern Sie sie in Comma Separated Values ​​"csv"-Format. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Standards und Proben Daten. </li><li> Set up Fluorometer wie folgt: <ol><li> Klicken Sie auf die <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="Icon 1"> Taste, wird diese öffnen Sie die Analysemethode Fenster in Abb. 2 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Analysemethode Fenster, Registerkarte Allgemein. Machen Sie die folgende Auswahl: <ul><li> In der "Measurement"-Feld, wählen Sie Photometrie aus dem Pulldown-Menü. </li><li> In "Operator"-Feld, geben Sie die entsprechenden Betreiber zu nennen. </li><li> Es besteht keine Notwendigkeit, Informationen in der "Instrument" Feld eingeben. Dies erfolgt automatisch durch die Software selektiert. </li><li> Das "Sampling"-Feld ist inaktiv, wenn mit der Mikroplatten-Reader. </li><li> Geben Sie Kommentare, die Sie in dem Bericht in der "Kommentar"-Feld enthalten sein soll. </li><li> In der "Accessory"-Feld, geben Sie Informationen im Zusammenhang mit dem Zubehör für diesen Test verwendet. </li><li> Beachten Sie die Schaltflächen auf der rechten Seite des Fensters. </li><li> Der "Load"-Taste erlaubt das Laden zuvor gespeicherte Analyse-Methoden. </li><li> Die Schaltfläche "Speichern" ermöglicht die Aktualisierung eine Reihe von Test-Parameter oder Analysemethode zuvor gespeichert und geladen, mit dem gleichen Namen. </li><li> Die Taste ermöglicht das Speichern einer neuen Reihe von Test-Parameter oder Analysemethode unter einem gewünschten Namen "Save As". </li></ul> Jetzt auf dem "Quantifizierung" Registerkarte klicken, siehe Abbildung 3 und die folgende Auswahl. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Analysemethode Window, Quantifizierung Registerkarte. <ul><li> In der "Quantifizierung Typ"-Feld, wählen Wellenlänge. Dies zeigt die Fluoreszenz Lesen gemacht wird mit der gewählten Wellenlänge sein. </li><li> In der "Calibration Type"-Feld, wählen Sie 1. Ordnung. </li><li> In der "Anzahl der Wellenlängen"-Feld, wählen Sie 1. </li><li> In der "Konzentration Einheit" Feld ng / mL. </li><li> Lassen Sie unselected die Felder für "Manuelle Kalibrierung" und "Force Kurve durch Null". </li><li> In der "Nachkommastelle"-Feld, wählen Sie 2. </li><li> In der "Lower Grenzkonzentration"-Feld, 0 eingeben. </li><li> In der "Upper Konzentrationsgrenze Feld 10000. </li></ul> Jetzt auf dem "Instrument" Registerkarte klicken und die folgende Auswahl. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Analysemethode Fenster Instrument tab <ul><li> In der "Data-Modus:" Wählen Sie im Feld Fluoreszenz. </li><li> Die "Chopping speed"-Feld ist inaktiv zu diesem Zeitpunkt, es nur für Phosphoreszenz Messungen verwendet. </li><li> In der "Wavelength-Modus"-Feld, wählen Sie Beide WL fixiert. </li><li> In der "EX / WL1" Feld 480nm. </li><li> In der "EM / WL1" Feld 520nm. </li><li> Alle anderen Felder unter EX und EM sind in dieser Zeit inaktiv. </li><li> In der "EX Schlitz"-Feld wählen 5.0nm aus dem Pulldown-Menü. </li><li> In der "EM Schlitz"-Feld wählen 5.0nm aus dem Pulldown-Menü. </li><li> Lassen Sie unselected das Feld vor der "PMT Voltage 1-1000V"-Feld. </li><li> In der "PMT Voltage"-Feld, wählen Sie 700V aus dem Pulldown-Menü. </li><li> In der "Auto-Statistik calc. Number"-Feld wählen Sie 2. </li><li> In der "Repliziert" Feld auswählen 1. </li><li> In der "Integration time" Feld auszuwählen 0.1s. &lt;/ Li&gt; </li><li> In der "Delay"-Feld eingeben oder 0s. </li></ul> Klicken Sie auf die Registerkarte "Monitor". <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Analysemethode Fenster die Registerkarte Monitor. <ul><li> In der "Y-Achse", "Max:"-Feld, wählen Sie 10000 </li><li> In der "Y-Achse", "Min:"-Feld, wählen 0. </li><li> Wählen Sie das Feld links neben der "Open Datenverarbeitung nach Datenerfassung". </li><li> Lassen Sie unselected der Box auf der linken Seite des "Bericht drucken nach Datenerfassung", wenn Sie einen Bericht automatisch gedruckt werden, nachdem die Lesungen abgeschlossen werden soll. </li></ul> Klicken Sie auf den "Report"-Registerkarte, siehe Abbildung 6. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Analysemethode Fenster, Report Tab. <ul><li> In den "Output"-Feld, wählen Sie Bericht drucken aus dem Pulldown-Menü. Sie können auch wählen Sie "Verwenden Sie Microsoft Excel", wenn Sie die Daten nach Excel exportiert oder "Use Print Generator Sheet" bei Verwendung des optionalen add on Programm Report Generator, die es generiert maßgeschneiderte Berichte werden wollen. </li><li> Klicken Sie die Kontrollkästchen für die Elemente, die Sie in den Bericht aufgenommen werden. </li><li> So speichern Sie alle ausgewählten Parameter in den verschiedenen Tabs des "Analysis Method"-Fenster, klicken Sie erneut auf die Registerkarte "Allgemein" und speichern Sie sie unter einem Dateinamen und in einem Ort, wo Sie sie für zukünftige Verwendung finden konnte, und klicken Sie auf " OK "-Taste, um das Fenster zu schließen. </li><li> Damit ist die Inbetriebnahme des Instrumentes Prüfparameter. </li><li> Jetzt richten wir Ihnen die Mikroplatten-Reader. </li><li> Klicken Sie auf die <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="Icon 2"> Button, der die MPR-Setup-Fenster auf der Oberseite bringt. </li></ul> Wählen Sie Vertiefungen für die Standards und die Proben in der MPR-Setup-Fenster / Plate Register, wie in Abbildung 7 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. MPR-Setup-Fenster, Plate Registerkarte. <ul><li> Klicken Sie auf die A1 Position und ziehen Sie die Maus auf E1, dann klicken Sie auf den <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt="Icon 3"> -Taste. Diese wählt die Positionen für die Standards verwendet werden. Diese Positionen werden in grüner Farbe hervorgehoben werden. </li><li> Jetzt müssen wir Positionen F1 bis H3 wählen für die Proben. Klicken und Ziehen mit der Maus ab Position F1, um H3 Position und klicken Sie dann auf die <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt="Icon 4"> drücken, wird dieses Highlight dieser Positionen in gelber Farbe. </li><li> Dann wiederholen Sie den gleichen Vorgang für die Positionen A2 bis E3, um die Positionen für die Probe-Messungen zu wählen. </li><li> Jetzt wollen wir laden Sie die Datei Comma Separated Variable (csv-Datei) im Voraus mit den Standards und Probe bereitgestellten Informationen. </li></ul> Klicken Sie auf das "Well Informationen" auf der Registerkarte "MPR Setup-Fenster", wie in Abbildung 8 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="Abbildung 8"> Abbildung 8. MPR-Setup-Fenster, Well Registerkarte Informationen. <ul><li> Dann klicken Sie auf den <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt="Icon 5"> -Taste. Ein Windows-Explorer-Fenster öffnet sich, die wie in Abbildung 9, die es erlauben Auffinden der "Well information.csv"-Datei und laden es wird gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="Abbildung 9"> Abbildung 9. Lädt auch Probeninformationen. Nach dem Laden der "Well information"-Datei, wird der "Well Informationen" so aussehen in Abbildung 10 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="Abbildung 10"> Abbildung 10. Loaded Probe auch Informationen. </li></ul></li></ol></li></ol> 2. PicoGreen Assay Probenvorbereitung <ol><li> Bereiten 1X TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) durch Zugabe von 1 ml 20 X TE-Pufferbis 19 mL DI H 2 O. </li><li> Bereiten PicoGreen Reagenzlösung durch Zugabe von 50 ul 200 X PicoGreen Reagenz auf 9,95 ml 1 x TE-Puffer. </li><li> Bereiten Standards (Lambda dsDNA), indem serielle Verdünnungen von Lager dsDNA (100 ug / mL). Bereiten Sie zuerst eine Lösung von 50 ug / ml dsDNA durch Zugabe von 25 ul Lager dsDNA (100 ug / ml) und 25 ul 1 x TE-Puffer. Anschließend werden die Standard-Lösungen, indem Sie die angegebenen Mengen an dsDNA und Puffer wie in der Tabelle unten aufgelistet: <table border="1"><tbody><tr><td> Die Konzentration der dsDNA </td><td> Volumen der dsDNA </td><td> Volumen Puffer </td></tr><tr><td> 1 pg / mL </td><td> 20 ul von 50 ug / mL dsDNA </td><td> 980 ul 1 X TE-Puffer </td></tr><tr><td> 0,1 ug / mL </td><td> 100 ul von 1 pg / mL dsDNA </td><td> 900 ul 1 X TE-Puffer </td></tr><tr><td> 0,01 g / mL </td><td> 100 ul von 0,1 ug / ml dsDNA </td><td> 900 ul 1 X TE-Puffer </td></tr><tr><td> 0,001 g / mL </td><td> 100 ul von 0,01 ug / ml dsDNA </td><td> 900 ul 1 X TE-Puffer </td></tr></tbody></table></li></ol> 3. Measurement of Standards and Probenfluoreszenz <ol><li> Je 150 ul von jedem Standard in die Vertiefungen A1-E1 einer 96-Well-Platte, pro Bild 7, und nach der folgenden Tabelle: <table border="1"><tbody><tr><td> Gut </td><td> Standard </td></tr><tr><td> A1 </td><td> 1 pg / mL </td></tr><tr><td> B1 </td><td> 0,1 ug / mL </td></tr><tr><td> C1 </td><td> 0,01 g / mL </td></tr><tr><td> D1 </td><td> 0,001 g / mL </td></tr><tr><td> E1 </td><td> 1 X TE-Puffer </td></tr></tbody></table></li><li> Je 150 ul unbekannten Proben in die Vertiefungen F1 bis H3, in Abbildung 7 </li><li> Gießen PicoGreen Lösung in Schritt 1.2 in einen Trog für Mehrkanal-Pipette Einsatz konzipiert vorbereitet. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette auf 150 ul PicoGreen Lösung in die Vertiefungen A1-H3 zu liefern. Die Lösung und Standards vorsichtig mit Pipette. </li><li> Legen Sie Platte in dunklen Bereich und warten 2-5 Minuten für die Reaktion zu entwickeln. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Eine gute Kalibrierkurve wird unter Verwendung der verschiedenen Parameter, die von der F-7000-Software bei der Messung der Standards und die Berechnung der Kalibrierkurve von der Software zur Verfügung gestellt. Das Bestimmtheitsmaß gibt die Güte der Anpassung der gemessenen Standards und die berechnete Eichkurve. Je näher dieser Wert auf "1", der besser ist die Anpassung des Messwertes und Eichkurve. Wenn der Wert ist weit von "1", müssen die Standards neu vermessen werden, vorbereitet erneut, oder die Tauglichkeit der Kalibrierkurve geändert. Abbildung 11 zeigt ein Beispiel für eine Eichkurve mit einer berechneten Bestimmtheitsmaß = 0,99993, für die Quantifizierung von dsDNA mit PicoGreen Farbstoff erhalten. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="Abbildung 11"> Abbildung 11. Beispiel für dsDNA Kalibrierkurve.

<ol><li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li>
</ol>

Luis A. Moreno und Kendra L. Cox von Hitachi High Technologies America, dass das Instrument in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.

Sorgfältige Pipettieren während der Probenvorbereitung sowie über eine stabile und empfindliche Fluoreszenz-Spektralphotometer ist unerlässlich für den Erhalt von guten und reproduzierbaren Ergebnissen. Im Falle der Fluoreszenz-Spektralphotometer für diesen Test verwendet wird vorgeschlagen mit 300 ul Endprobe Volumen im Mikroplatten-Reader. Niedrigere Volumen verringert sich die Empfindlichkeit und ein größeres Volumen kann Kreuzkontaminationen zwischen den Wells zu verursachen.

<table><tbody><tr><td>Destilliertes H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA-Assaykit von Invitrogen</td><td>Reagenz</td><td></td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Nalge Nunc-Fluoreszenzmikroplatten, Bestellnummer 237108</td><td>Zubehör</td><td></td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>12-Kanal-Eppendorf-Mikropipette</td><td>Zubehör</td><td></td><td>3516677</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L Eppendorf-Pipette</td><td>Zubehör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L Eppendorf-Pipette</td><td>Zubehör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-mL-Serologische Pipette</td><td>Zubehör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Zubehör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Zubehör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektrophotometer mit FL Solutions 2.1</td><td>Gerät</td><td></td><td>5J1-0003</td><td></td></tr><tr><td>Zubehör für Mikroplattenleser für F-7000</td><td>Gerät</td><td></td><td>5J0-0139</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung von dsdna mit dem hitachi f-7000 fluoreszenz-spektralphotometer und picogreen dye

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantifizierung von DNA, vor allem in kleinen Konzentrationen, ist eine wichtige Aufgabe mit einer Vielzahl von biologischen Anwendungen, einschließlich Standard-Molekularbiologie-Assays wie Synthese und Aufreinigung von DNA-, Diagnose-Anwendungen wie die Quantifizierung der DNA-Amplifikation Produkte und Detektion von DNA-Molekülen in der Medikamentenentwicklung Vorbereitungen. Während dieses Video zeigen wir Ihnen die Leistungsfähigkeit der Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer mit einer Micro-Plate Reader Zubehör zum dsDNA Quantifizierung mittels Molecular Probes Quant-it PicoGreen Farbstoff Reagenzienkit durchführen ausgestattet. Der F-7000 Fluoreszenzspektrophotometer bietet hohe Empfindlichkeit und hohe Geschwindigkeit Messungen. Es ist ein sehr flexibles System für die Messung von Fluoreszenz, Lumineszenz und Phosphoreszenz. Mehrere Betriebsarten zur Verfügung, einschließlich Wellenlänge zu scannen, zu scannen, Photometrie und 3-D-Scan-Messung. Das Spektralphotometer ist die Empfindlichkeit im Bereich von 50 pmol Fluorescein bei der Verwendung eines 300 &amp;mgr; Probenvolumen in der Mikrotiterplatte und ist in der Lage Scan-Geschwindigkeiten von 60.000 nm / min. Es hat auch einen breiten dynamischen Bereich von bis zu 5 Größenordnungen, die für die Verwendung von Kalibrierkurven über einen weiten Bereich von Konzentrationen erlaubt. Das optische System nutzt alle reflektive Optiken für maximale Energie und Sensibilität. Die Standard-Wellenlängenbereich von 200 bis 750 nm, und kann bis 900 nm erweitert werden, wenn mit einem der optionalen Nah-Infrarot-Photomultiplier. Das System ermöglicht optional Temperaturregelung für die Platten-Lesegerät 5 bis 60 Grad Celsius mit einem optionalen externen temperierten Flüssigkeit Thermostaten. Die Mikroplatten-Reader ermöglicht den Einsatz von 96-Well Mikrotiterplatten, und die Messung der Geschwindigkeit für 96 Vertiefungen von weniger als 60 Sekunden bei Verwendung der Kinetik-Modus. Software steuert für die F-7000 und Mikroplatten-Reader sind auch sehr flexibel. Die Proben können entweder in Spalte oder Zeile Formate eingestellt werden und eine beliebige Kombination von Brunnen kann für die Probe-Messungen gewählt werden. Dies ermöglicht eine optimale Ausnutzung der Mikroplatten. Darüber hinaus ermöglicht die Software den Import Mikrotiterplatten Beispielkonfigurationen in Excel erstellt und gespeichert in Comma Separated Values ​​oder &quot;csv&quot;-Format. Microplate Mess-Konfigurationen können gespeichert und wieder aufgerufen werden, indem die Software für Komfort und erhöhte Produktivität. Daten Ergebnisse kann auf einem Standard-Bericht, Excel, oder einem optionalen Report Generator Program.

Demonstration der Quantifizierung von dsDNA mit Molecular Probes PicoGreen Farbstoff und Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer mit einem Mikroplatten-Reader Zubehör ausgestattet.

Quantifizierung von dsDNA mit dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer und PicoGreen Dye

Die Quantifizierung von DNA, insbesondere in geringen Konzentrationen, ist eine wichtige Aufgabe mit einem breiten Spektrum an biologischen Anwendungen, einschließlich standardmäßiger molekularer ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Fähigkeit des fluoreszierenden Spektrophotometers F 7,000 mit Mikroplattenleser zur Quantifizierung doppelsträngiger DNA unter Verwendung des Pico-Green-Farbstoffs zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Proben und Reagenzien vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Einrichtung des Instruments.Der dritte Schritt des Verfahrens ist das Beladen der Proben in den Mikroplattenreader. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Durchführung der Messung von Standards und Proben. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die eine lineare Kalibrierkurve zeigen, die für die Quantifizierung von doppelsträngiger DNA in unbekannten Proben verwendet werden kann.Schalten Sie das Hitachi F 7,000 Spektral-Fluorimeter ein, um der Xenonlampe eine Aufwärmzeit von einer Stunde in Excel zu ermöglichen. Erstellen Sie eine Datei mit den Standard- und Probendaten und speichern Sie sie im durch Komma getrennten Werten-Format (CSV). Um das Fluorimeter einzurichten, klicken Sie zunächst auf die Schaltfläche „Methode“, die das Analysemethoden-Fenster öffnet.Wählen Sie im Messbereich Photometrie aus dem Dropdown-Menü aus. Klicken Sie nun auf den Reiter Quantifizierung. Wählen Sie im Feld Quantifizierungstyp Wellenlänge aus, um anzugeben, dass die Fluoreszenzablesung unter Verwendung einer bestimmten Wellenlänge erfolgen wird.Wählen Sie für den Kalibrierungstyp die erste Ordnung und für die Anzahl der Wellenlängen eins aus. Geben Sie Nanogramm pro Milliliter als Konzentrationseinheit ein. Stellen Sie sicher, dass die Felder manuelle Kalibrierung und Kurve durch Null erzwingen nicht ausgewählt sind. Wählen Sie bei Anzahl der Nachkommastellen zwei aus, geben Sie null für die untere Konzentrationsgrenze und 10.000 für das Feld obere Konzentrationsgrenze ein.Klicken Sie anschließend auf den Instrumentreiter und wählen im Feld Datenmodus Fluoreszenz aus. Stellen Sie sicher, dass das Feld Chopping-Geschwindigkeit inaktiv ist, da es nur für Phosphoreszenzmessungen verwendet wird. Wählen Sie im Feld Wellenlängenmodus beide WL fest im Ex-WL-1-Feld aus und geben Sie im EM-WL-1-Feld 480 Nanometer ein.Geben Sie 520 Nanometer ein. Lassen Sie alle anderen Felder unter EX und EM inaktiv. Stellen Sie sowohl den EX-Spalt als auch den EM-Spalt auf 5,0 Nanometer ein.Über die Dropdown-Menüs bleibt das Feld vor dem PMT-Spannungsbereich von 1 bis 1000 Volt unmarkiert. Wählen Sie für die PMT-Spannung 700 Volt aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie außerdem zwei für die automatische Statistikberechnung, eins für die Wiederholungen, 0,1 Sekunden für die Integrationszeit und null für die Verzögerung.Öffnen Sie nun die Registerkarte „Monitor“ und stellen Sie das Feld „Y-Achsen-Maximum“ auf 10.000 und die „Y-Achsen-Minimum“ auf null ein. Aktivieren Sie dann das Kästchen links neben „Datenverarbeitung nach Datenerfassung öffnen“ und gegebenenfalls das Kästchen links neben „Bericht nach Datenerfassung drucken“, um einen Bericht automatisch nach Abschluss der Messungen auszudrucken. Klicken Sie abschließend auf die Registerkarte „Allgemein“, um alle ausgewählten Parameter in den verschiedenen Registerkarten des Fensters „Analysenmethode“ unter einem neuen Dateinamen an einem angegebenen Speicherort zu speichern.Klicken Sie auf die Schaltfläche „Okay“, um dieses Fenster zu schließen. Damit ist die Einrichtung der Instrumententestparameter abgeschlossen. Um den Mikroplattenreader einzurichten, klicken Sie auf die Taste MPR, um das MPR-Einrichtungsfenster in den Vordergrund zu holen.Wählen Sie zuerst die Vertiefungen für die Standards aus. Klicken Sie beispielsweise auf die Position A1 und ziehen Sie die Maus bis E1. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Standardreihe“.Dadurch werden die Positionen ausgewählt, die für die Standards verwendet werden sollen, wie durch die grüne Markierung hervorgehoben. Anschließend wählen Sie die Positionen für die Proben aus. Klicken Sie hierzu entsprechend auf die gewünschten Positionen auf der Platte und ziehen Sie mit gedrückter Maustaste über diese, und klicken Sie danach auf den Probenset-Button, wodurch die ausgewählten Positionen automatisch gelb markiert werden.Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für die Positionen, an denen die gewünschten Probenmessungen durchgeführt werden sollen. Um die Standards und Probendaten in die zuvor erstellte durch Komma getrennte Variablen-Datei zu laden, klicken Sie auf den Reiter „Welleninformationen“ im MPR-Setup-Fenster.Wählen Sie die Schaltfläche „Load Well Information“ (Informationen zur Beladungsprobe) aus, und ein Fenster von Windows Explorer wird geöffnet, um die Datei „well information dot csv“ zu identifizieren. Nach dem Laden der Informationen sollte das Fenster die Daten als Tabelle anzeigen. Um eine Arbeitslösung des Pico-Green-Reagenz herzustellen, geben Sie 50 Mikroliter des 200×-Pico-Green-Reagenz zu 9,95 Millilitern TE-Puffer hinzu.Für die Standardkurve bereiten Sie serielle Verdünnungen von Lambda-Doppelstrang-DNA in TE-Puffer für Endkonzentrationen von einem bis 100 Nanogramm pro Milliliter vor; pipettieren Sie 150 Mikroliter jedes Standards in die dafür vorgesehenen Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Danach pipettieren Sie 150 Mikroliter jeder Testprobe in die entsprechenden dafür vorgesehenen Vertiefungen der Platte. Fügen Sie nun mit einer Mehrkanalpipette 150 Mikroliter Pico-Green-Lösung in jede Vertiefung hinzu und mischen Sie die Lösung und die DNA-Proben.Inkubieren Sie die Platte vorsichtig zwei bis fünf Minuten lang an einem dunklen Ort, um die Reaktion zu entwickeln. Klicken Sie auf die Anzeigetaste des MPR, um das MPR-Setup-Fenster in den Vordergrund zu bringen, und klicken Sie auf die Taste zum Positionstausch. Die Halteplattform für die Mikroplatte bewegt sich nach vorne aus dem Gerät heraus, öffnet die Tür des Mikroplattenlesegeräts und platziert die 96-Loch-Platte auf der Halteplattform, wobei das Loch A1 nach vorne zeigt; anschließend schließt sich die Tür des Mikroplattenlesegeräts.Klicken Sie auf die Schaltfläche für die Anfangsposition, um Position A einer Mikroplatte in die Messposition zu bringen. Klicken Sie auf die Schaltfläche zur Bildschirmanzeige, um das Messfenster an die Spitze der Anzeige zu bringen. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Messen“, um die Messung der Standards und der unbekannten Proben zu starten.Eine gute Kalibrierungskurve wird anhand der verschiedenen Parameter bewertet, die von der F 7,000-Software bereitgestellt werden. Beispielsweise weist diese ideale Kalibrierungskurve, die zur Quantifizierung von doppelsträngiger DNA unter Verwendung des Pico-Green-Farbstoffs erhalten wurde, einen berechneten Bestimmtheitskoeffizienten von 0,99993 auf. Das beschriebene Hochdurchsatzsystem ist eine serielle Anordnung von Technologien, zu denen der Pico-Green-Farbstoff, ein fluoreszierendes Spektralphotometer vom Typ Hitachi F 7,000 mit Mikroplattenleser sowie ein Softwareprogramm zur Automatisierung der Datenerfassung, -speicherung, -analyse und -darstellung gehören.Die Kombination leistungsfähiger Technologien kann dem wachsenden Bedarf an einer genauen Analyse geringer Mengen doppelsträngiger DNA gerecht werden.

quantification-dsdna-using-hitachi-f-7000-fluorescence

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Verwendung von NanoDrop Mikrovolumens Systeme als praktische und effiziente Alternative zu herkömmlichen Nukleinsäure Quantifizierung Methodik ist durch die Demonstration von zwei Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung Protokollen beschrieben.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Wir beschreiben einen digitalen Endpunkt-Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten (analogen) Auslesung. Wir messen die Massenfluoreszenz von tröpfchenbasierten digitalen Assays mit einem Standard-qPCR-Gerät anstelle von speziellen Instrumenten und bestätigen unsere Ergebnisse durch Mikroskopie.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Diese Handschrift beschreibt eine Duplex digitalen PCR Assay , die gleichzeitig verwendet werden können , um Enterococcus spp quantifizieren. Und die HF183 genetischen Markern als Indikatoren für allgemeine und menschlichen assoziiertes fäkale Verunreinigung in Erholungsgewässern.

Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Und das menschliche Fecal-assoziierte HF183 Marker in Waters

Diese Methode erlaubt selektive Färbung und Quantifizierung der DNA in den Gelen durch Einweichen das Gel in einem SYBR Grün ich / Nitro blau Tetrazoliumsalz Lösung und setzen Sie sie dem Sonnenlicht oder eine blaue Lichtquelle. Dies erzeugt einen sichtbaren Niederschlag und erfordert fast keine Ausrüstung, wodurch es ideal für den mobilen Einsatz.

DNA-Färbung Methode basiert auf Formazan Niederschlag induziert durch blaues Licht aussetzen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur DNA-Protein Interaktionen durch Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) mit ein ortspezifisch modifizierte λ-DNA-Substrat und einem Quantenpunkt beschriftet Protein zu studieren.

Visualisierung der Interaktion zwischen dem Qdot-markierten Protein und ortspezifisch modifizierte λ-DNA auf der Einzelmolekül-Ebene

Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.

Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode zum Nachweis der Bindung zwischen Verbindungen und Proteinmolekülen, die die Vorteile eines minimalen Proteinprobenverlusts und einer hohen Datengenauigkeit bietet.

Nachweis der CD40-Protein-Umbelliferon-Wechselwirkung mittels dynamischer Differenzialfluoreszenz

In dieser Studie wird ein einfacher, benutzerfreundlicher ratiometrischer FRET-Assay für den Nachweis und die quantitative Beurteilung der DNase-Aktivität vorgestellt und seine Anwendung bei der Analyse einer schwachen Nuklease demonstriert.

Beurteilung der DNase-Aktivität durch ratiometrischen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer

Dieses Protokoll beschreibt das Design von Split-Hybridisierungssonden, die das fluoreszierend leuchtende Aptamer DAP-10-42 als Signalreporter verwenden, und ihre Anwendung für den Nukleinsäurenachweis und die Differenzierung zwischen Zielen mit Einzelnukleotidsubstitutionen.

Split-Hybridisierungssonde unter Verwendung eines DNA-Fluoreszenz-Leuchtaptamers als Signalreporter für die sequenzspezifische Nukleinsäureanalyse

Dieses Protokoll bietet detaillierte Operationen zur Probenvorbereitung, Datenerhebung und Analyse von DNA-intrinsischen Fluoreszenzspektren.

Spektroskopische Superauflösungsbildgebung von DNA-Molekülen unter Verwendung von intrinsischem Kontrast

Lernen Sie die Quantifizierung von dsDNA mit PicoGreen-Farbstoff und dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer. Diese Methode ermöglicht präzise DNA-Messungen mit hoher Sensitivität und einem Bestimmtheitsmaß von 0,99993.

Quantifizierung von dsDNA mit dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer und PicoGreen Dye

Weitere Videos entdecken