Name: Direkte Lieferung von MIF Morpholinos Into the Zebrafisch Otocyst durch Injektion und Elektroporation Beeinflusst Inner Ear Entwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur gezielten Morpholino-Lieferung in den Zebrafisch-Otocysten mittels Mikroinjektion und Elektroporation. Diese Technik ermöglicht präzise Studien zur Innenohrentwicklung bei Danio rerio.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Taubheit Research Foundation zu Yc S und der NSF (IOS 0930096) zu KFB unterstützt. KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184-08W1</a> , NSF DBI 0832862, NSF IOS 0930096

1. Herstellung von Elektroden für die Elektroporation <ol><li> Cut 75 um Durchmesser Wolframdraht (AM Systems, Inc. Carlsborg, WA) von geeigneter Länge (ca. 3-5 cm) </li><li> Put Wolframdraht durch Molex Stecker (Pin gestempelt Messing) </li><li> Wrap Wolframdrähten und Molex Stecker mit Schrumpfschlauch (SPC Technology, Chicago, IL) und erwärmt mit Bunsenbrenner oder Heißluftpistole zum Schrumpfen Schlauch an den Drahtplombe </li><li> Zum Schärfen der Spitze der Wolfram-Draht-, Tauch-den Draht in 1,0 N Natriumhydroxid (Conrad et al. 1993) und mit Hilfe einer Büroklammer als die andere Elektrode, Elektrolyse der Draht mit einer Rechteck Electroporator. Die Bedingungen, die wir benutzen sind 5 50-Volt Impulse einer Dauer von jeweils 100 ms mit 50 ms in zwischen den Impulsen. Die Elektroden sollten zu einem Durchmesser von 15-20 um geschärft werden </li><li> Halten Sie die Drähte in einem Fach in Nuten in Modelliermasse vor in Elektroporation verwenden gedrückt </li></ol> 2. Set Up Elektroporation Bahnhof <ol><li> Band geschärft 75 um Wolfram Elektroden Mikromanipulatoren (World Precision Instruments). </li><li> Legen Sie Mikromanipulatoren auf beiden Seiten des Präpariermikroskop Stufe (Leica). </li><li> Verbinden Sie die Elektroden mit einem Protect CUY-21 Bearbeiten Square Wave Electroporator (Abbildung 1). </li><li> Schalten Sie den Elektroporator und SET UP-Parameter für die Elektroporation, einschließlich Spannung, Pulsdauer und die Anzahl der Impulse. Die effektivste Parameter für dieses Experiment wurde festgestellt, dass drei 13-Volt-Impulse, die jeweils für 5.0ms dauerte, mit 100ms zwischen jedem Puls werden. Wenn Elektroporation erzeugt Luftblasen im Embryo, reduzieren Sie die Impulslänge. </li></ol> 3. Mikroinjektion von Morpholinos in Zebrafische Otic Vesicle <ol><li> Ernte Zebrafischembryonen aus einem Aufzuchtbecken. Inkubieren Sie die Embryonen in Embryo-raising-Medium mit 0,3 ppm Methylenblau (Westerfield, 2005) bei 28,5 ° C über Nacht. </li><li> Pull Glasnadeln mit einem Sutter P-97-Elektrode puller </li><li> Warm up ein Agarosegel Basis (1% Agarose in Fisch Wasser in einer 10 mm Petrischale) auf 37 ° C im Wasserbad </li><li> Heat 1% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt (LMPA) in Fisch Wasser, bis sie geschmolzen und warm halten in der 37 ° C Wasserbad. </li><li> Füllen Sie ein Glas Nadel mit einem Morpholino-Lösung (GeneTools, Corvallis, OR) und schneiden Sie die Spitze zu entsprechenden Durchmesser. Montieren Sie die Injektionsnadel auf einem Mikromanipulator (Kuhn). </li><li> Cut Nadelspitze zu etwa 10 um und injizieren in Mineralöl, um sicherzustellen, dass die Spitze reicht Lieferung von Morpholino-Lösung ermöglicht. </li><li> Dechorinate Embryonen nach 24 Stunden der Befruchtung (HPF) und betäuben sie mit MS222 (Tricaine, Sigma) in 0,3 ppm Methylenblau Fisch Wasser. </li><li> Richten Sie 3 bis 5 betäubt Embryonen auf das Agarosegel Basis mit der rechten Seite bis zur komfortablen einheitliche Analyse </li><li> Setzen Sie 1 bis 2 Tropfen 1% LMPA über jeden Embryo und lassen Sie sich verfestigen, um den Embryo zu fixieren </li><li> Drehen Sie die Petrischale, so dass die otic Vesikel ist auf der rechten Seite </li><li> Setzen Sie die Nadel in das Lumen des otic Vesikel und injizieren Sie die Morpholino-Lösung mit einem PV820 Pneumatische PicoPump (World Precision Instruments) mit einer angehängten Stickstofftank (Abbildung 2) </li></ol> 4. Elektroporation Procedure <ol><li> Bewegen Sie den montierten Embryonen in die Elektroporation Station unmittelbar nach der Injektion </li><li> Legen Sie die positive Elektrode auf das Gewebe direkt hinter dem Ohr-Vesikel, aber nicht durchdringen; legen Sie die negative Elektrode in das Gehirn unmittelbar vor dem otic Vesikel </li><li> Wenden Sie muss mit einem Fußpedal oder durch Drücken eines Schalters. </li><li> Gießen Fisch Wasser auf Agarose und entfernen Embryonen aus Agarose mit wirbelnden und einer Glaspipette. Seien Sie vorsichtig, nicht auf die Embryonen Schaden. Bei Embryonen, die nur schwer zu entfernen sind, mit einer Nadel vorsichtig brechen alle LMPA Umgebung des Embryos. </li><li> Legen Embryonen in einem Teller mit Methylenblau Fisch Wasser und erhöhen die Embryonen zu wünschen Stadien für die Analyse (morphologische, immunhistochemische, in-situ-Hybridisierung, etc und mikroskopische anlaysis). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Elektroporation Station. Elektroden wurden mit geschärften 75 Mikrometern Wolframdrähte und verbunden durch führt zu einer Protect CUY-21 Bearbeiten Square Wave Electroporator. Diese Elektroden wurden Mikromanipulatoren abgeklebt. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Injection-Station. Alle Embryonen wurden in das rechte Ohr für die Standardisierung Zwecke injiziert. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Phalloidin-Färbung von Aktin-Filamenten mit 3 dpf Embryonen. (A) Die 3 dpf Embryo injected mit Kontroll-MO hat eine starke Färbung von Phalloidin in der hinteren Makula (pm). (B) Der Embryo, die mit Kontroll-MO injiziert wurde und dann elektroporiert hatte ähnliches Niveau Phalloidin-Färbung in pm in der Injektion nur Embryonen. (C) Injektion mit mif MOs in die otic Vesikel allein nicht die Ursache für Reduzierung der Phalloidin-Färbung, während die Injektion von mif MOs zusammen mit Elektroporation führte zu einer dramatischen Reduzierung der Phalloidin-Färbung in der Uhr (D). bin, anterior Makula. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Phalloidin-Färbung von Aktin-Filamenten mit 5 dpf Larven. Es gab keinen Unterschied zwischen Injektion nur (A) und Injektion mit Elektroporation, wenn die Standard-Steuerung Morpholino verwendet wurde (B). Jedoch zeigte die 5 dpf Larven, die mit mif Morpholinos und elektroporiert injiziert wurden Phalloidin-Färbung in der hinteren Makula (pm) (D), wenn auch weniger dramatisch als 3 dpf, wenn sie mit dem Embryo, der mit mif Morpholinos nur (C injiziert wurde im Vergleich reduziert ). bin, anterior Makula. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Acetylierte Tubulin-Färbung von Embryonen bei 3 dpf. Der Embryo in (A) erhielten keine Injektion oder Elektroporation. Der Embryo in (B) wurde durch Elektroporation, erhielt aber keine Injektion. Embryonen erhalten sowohl der Injektion und Elektroporation (C, D) mit mif Morpholinos hatte sichtlich abgenommen Tubulin-Färbung im Vergleich zur Kontrollgruppe. (Pm, posterior Makula). <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Acetylierte Tubulin-Färbung von Embryonen bei 3 dpf mit Kontroll-Morpholino. (A) Embryo ohne Behandlung zeigte eine starke acetyliertes Tubulin-Färbung in der hinteren Makula (pm) und umfangreiche Innervation. (B) Embryo mit Kontroll-Morpholino injiziert. (C) Embryo mit Elektroporation nur behandelt. (D) Control Embryo mit Kontrolle Morpholino injiziert und Elektroporation hat ähnliche Ebenen der acetylierten Tubulin in den hinteren Makula und Innervation im Vergleich zu den nicht behandelten Kontrollgruppe.

<ol><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li>
<li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li>
<li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+polarization%3A+new+tunes+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li>
</ol>

Die Produktion der Artikel wurde von Gene Tools, LLC, die Reagenzien in der Video-und Text erwähnt produzieren gesponsert.

Wir haben erfolgreich Antisense-Oligonukleotid MOs in das Ohr des 24 hpf Zebrafischembryo eingeführt. Embryonen, die nach der Injektion und Elektroporation erhöht wurden lebensfähig. Wenn die Embryonen überlebten die Elektroporation, wuchsen sie zu normalen Tarifen im Vergleich zu Embryonen, die keine Behandlung, sowie Embryonen, die nur injiziert worden war und Embryonen, die erst seit elektroporiert erhalten hatte. Wir beobachteten die Wirkung von MIF und MIF-like MOs nach Ohr Injektion und Elektroporation durch die Kennzeichnung mit Phalloidin und acetyliertes Tubulin. Phalloidin-Färbung von Aktin-Filamenten in sensorischen Haarzellen des hinteren Makula zeigt an, dass die Elektroporation von MIF und MIF-like MO an der 24-hpf Bühne verursacht Veränderungen in Haarzellen und / oder Stereozilien Zahlen, wenn Embryonen, die nur mit der MOs injiziert wurden im Vergleich (Abbildung 3). Dieser Rückgang in Haarzellen Zahlen stimmen mit den Ergebnissen von Shen et al. (Submitted), die MOs zu mif und mif-wie eine Reduzierung der Anzahl der Haarzellen in der sackförmigen Makula verursachen. Der Rückgang der Haare Zellzahlen in Embryonen, die mit MOs und elektroporiert injiziert wurden zeigen, dass der Elektroporation kann bei der Bewegung der MOs durch die Zellmembran Hilfe, wodurch das Ausmaß der morphologischen Auswirkungen bei Embryonen, in denen die otic Vesikel nur injiziert wurde verglichen. Änderungen in der Morphologie der statoacoustic Ganglion wurden durch acetyliertes Tubulin-Färbung beobachtet. Das Ausmaß der Innervation durch die statoacoustic ganglion betroffen war, als Embryonen, die injiziert und wurden elektroporiert zeigen verringerte Verzweigung der Neuriten (Abbildung 5). Es kann auch Kondensation der Ganglienzellen und / oder eine verringerte Zahl von Ganglienzellen verringert werden, weil die acetylierten Tubulin-Färbung ist deutlich in Embryonen, die sowohl injiziert wurden und Elektroporation verringert. Da mif gezeigt worden ist, kritisch zu sein für die Entwicklung des Nervensystems (Suzuki et al., 2004), können die Änderungen nach der Elektroporation gesehen das Ergebnis der erhöhten Transfektion der mif und mif-like MO-Lösung in den Neuroblasten Zellen werden. Elektroporation von Antisense-Oligo Morpholinos direkt in ein Entwicklungsland Gewebe ist ein nützliches Werkzeug für die Steuerung der Expression eines Gens in das Gewebe der Entwicklung, sowohl räumlich als auch zeitlich, in den Embryo. Elektroporation von MIF und MIF-like MOs in das Gewebe des Innenohrs ergab anormale Morphologie der beiden hinteren Makula und die statoacoustic Ganglion. Es wurde eine Reduktion in der Anzahl der Haarzellen in der hinteren Makula in Embryonen, die injiziert worden war und im Vergleich mit Embryonen, die keine Behandlung erhalten hatten oder mit Embryonen, die entweder war nur gespritzt oder nur elektroporiert elektroporiert. Es gab auch eine Abnahme der Grad der Innervation der hinteren sensorischen Patch von der statoacoustic Ganglion und die Größe der SAG. Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von Makromolekülen in bestimmten Geweben, mit dem Vorteil der Beobachtung der primären Auswirkungen des jeweiligen DNA, RNA, oder MO in das gewünschte Gewebe und diskriminierende diese von Nebenwirkungen auf andere Gewebe einschließlich des Gehirns, Neuralleiste und periotischen Mesenchym am Innenohr Entwicklung (Barald und Kelley, 2004).

<ol><li> MOs: 0,3 mM aus einer Kombination von für mif, mif-like MO1 und mif-like MO2 verwendet wurde. Mif MO ist komplementär zu dem Startcodon des Zebrafisch mif mRNA: 5&#39;-acatcggcatgactgcgacagagat-3 &#39;. Zwei MOs wurden mif-like verwendet mif-like MO1 ist kostenlos, die translationale Startstelle:. 5&#39;-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 &#39;, während mif-like MO2 aus AS-Sequenz am intron1/exon 2 Grenze abgeleitet: 5&#39;-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 &#39;. Steuerung MO war die verschlüsselten Nukleotidsequenz von Gene Tools: 5&#39;-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 &#39;. </li><li> Methylenblau (0,3 ppm) in Fisch Wasser </li><li> MS222 (Tricaine, Sigma, 0,64 mm in Fisch Wasser) </li><li> Low-Schmelzpunkt Agarose (LMPA; Roche) </li><li> Phenolrot (Sigma) </li><li> Anti-acetyliertes Tubulin (Sigma) </li><li> Alexa Fluor ® 488 Ziege anti-Maus Zweitantikörper (Molecular Probes) </li><li> Texas-Rot-Phalloidin (Molecular Probes) </li></ol>

direkte lieferung von mif morpholinos into the zebrafisch otocyst durch injektion und elektroporation beeinflusst inner ear entwicklung

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In den letzten Jahren hat Elektroporation zu einer beliebten Methode zur in-vivo-Transfektion von DNA, RNA und Morpholinos in verschiedenen Geweben, einschließlich der Augen, des Gehirns und Somiten der Zebrafisch. Der Vorteil der Elektroporation gegenüber anderen Methoden der genetischen Manipulation ist, dass bestimmte Gewebe gezielt können, sowohl räumlich als auch zeitlich, denn die Einführung von Makromolekülen durch die Anwendung von elektrischem Strom. Hier beschreiben wir den Einsatz der Elektroporation zur Transfektion von MIF und MIF-like Morpholinos in das Gewebe des sich entwickelnden Innenohr des Zebrafisch. In früheren Studien, mif Morpholino in Embryonen im 1 eingespritzt - bis 8-Zell-Stadium führte zu weit verbreiteten morphologischen Veränderungen im Nervensystem und Auge sowie das Ohr. Durch die Ausrichtung der Gewebe des Innenohrs in späteren Phasen in der Entwicklung, können wir die primären Auswirkungen von MIF in den Entwicklungsländern Innenohr zu bestimmen, um sekundäre Effekte, die sich aus dem Einfluss von anderen Geweben führen kann entgegengesetzt. Durch die Verwendung von Phalloidin und acetyliertes Tubulin-Färbung, um die Morphologie von Neuronen, neuronale Prozesse und Haarzellen mit der hinteren Makula verbunden Studie konnten wir die Wirksamkeit der Elektroporation als Methode zur gezielten Transfektion in der Zebrafisch Innenohr zu beurteilen. Die otic Vesikel 24hpf Embryonen wurden mit Morpholinos und elektroporiert injiziert und wurden dann zu Embryonen, die keine Behandlung erhalten hatten oder bisher nur gespritzt oder elektroporiert verglichen. Embryonen, die injiziert und wurden elektroporiert zeigten eine Abnahme der Haarzelle Zahlen, verringerte Innervation durch die statoacoustic Ganglion (SAG) und weniger SAG Neuronen im Vergleich mit Kontrollgruppen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die direkte Lieferung von Morpholinos in otocysts in späteren Stadien der unspezifischen Nervensystem und Neuralleiste Auswirkungen Morpholinos am 1-8 Zell-Stadium geliefert vermeidet. Darüber hinaus ermöglicht die Untersuchung von Effekten, die an das Innenohr und nicht sekundäre Effekte auf das Ohr von primären Auswirkungen auf das Gehirn, Neuralleiste oder periotischen Mesenchym gerichtet sind.

Eine Methode, um Morpholinos direkt liefern in der Zebrafisch otocyst bei 24hpf entwickelt worden. Mit Mikroinjektion von Morpholinos in das Lumen des otic Vesikel und Elektroporation, um das Eindringen Effekt, konnten wir die Wirkung von Morpholinos auf das Gehirn zu umgehen und erhalten Wirkungen, die spezifisch an das Innenohr.

Direkte Lieferung von MIF Morpholinos Into the Zebrafisch Otocyst durch Injektion und Elektroporation Beeinflusst Inner Ear Entwicklung

In den letzten Jahren hat sich die Elektroporation zu einer populären Technik für die In-vivo-Transfektion von DNA, RNA und Morpholinos in verschiedene Gewebe entwickelt, einschließlich der ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Antisense-Oligonukleotide, Morpholinos oder andere die Entwicklung störende Moleküle direkt in das Ohr der Zebrafische im Stadium von einem Tag oder 24 Stunden nach der Befruchtung einzubringen. In diesem Beispiel verwenden wir Morpholinos gegen den frühesten Neurotrophin, der für die Entwicklung des statischen akustischen Ganglions verantwortlich ist, einen Zytokinen des Immunsystems namens Makrophagen-Migrations-Inhibitionsfaktor oder MIF, um zu bestimmen, ob Morpholinos gegen dieses Molekül die Entwicklung des Innenohrs oder die Neurogenese beeinflussen. Dies wird erreicht, indem zunächst mittels Mikroinjektion Morpholinos in das Lumen der Otozyste eingeführt werden, gefolgt von einer Elektroporation, die das Eindringen der Morpholinos aus dem Lumen in die Zellen der Otozyste erleichtert.Anschließend werden die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius kultiviert, um die Auswirkungen der Morpholinos auf die Entwicklung des Innenohrs und die Neurogenese zu beobachten. In den folgenden Tagen werden Ergebnisse erhalten, die eine Abnahme der sensorischen Haarzellen im Innenohr sowie eine verminderte Innervation durch das statoakustische Ganglion zeigen, basierend auf Immunhistochemie und Foid- und Färbemethoden, die jeweils acetyliertes Tubulin in den Kinocilien und das Aktin in den Stereocilien auf der Oberfläche der Haarzellen markieren. Diese Methode der Injektion und Elektroporation von Morpholinos im Hühnerembryo haben wir ursprünglich entwickelt, und zwar gemeinsam mit einer sehr talentierten Bachelorstudentin im Labor.Katie Holmes hat es erfolgreich auf die Größe von Zebrafischen verkleinert. Das aktuelle Forschungsteam, bestehend aus Yuchi, einer Postdoktorandin, Matt Wyatt, einem Doktoranden, und der ehemaligen Postdoktorandin im Labor, Deb Thompson, hat diese Technik für Zebrafische weiter verfeinert. Diese Methode könnte hoffentlich zentrale Fragen in den Bereichen der Entwicklungsbiologie und der Hör­for­schung beantworten, etwa, ob spezifische Morphogen-Effekte auf ein Organsystem wie das Ohr von allgemeinen Entwicklungsstörungen unterschieden werden können, die viele Organsysteme betreffen und sekundär auf das Ohr wirken, beispielsweise Effekte auf das Gehirn, die das Ohr indirekt beeinflussen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Mikroinjektionen in der Ein- bis Vierzellphase besteht darin, dass mit dieser Methode Morpholinos direkt im Ohr in späteren Entwicklungsstadien eingeführt werden. So können direkte Effekte der Morpholinos auf das Ohr erzielt und sekundäre Effekte auf das Innenohr vermieden werden. Um die Elektroden herzustellen, schneiden Sie zunächst Wolframdraht mit einem Durchmesser von 75 Mikrometern auf eine Länge von etwa drei bis fünf Zentimetern zu. Führen Sie den Wolframdraht durch einen Molex-Kabelstecker.Als Nächstes umwickeln Sie die Wolframdrähte und den Molex-Kabelstecker mit Schrumpfschlauch und erhitzen diesen mit einem Bunsenbrenner oder einer Heißluftpistole, um den Schrumpfschlauch am Draht fest zu verschließen. Um dann die Spitze des Wolframdrahts zu schärfen, tauchen Sie den Draht in eine normal (1 N) Natriumhydroxidlösung und elektrolysieren den Draht unter Verwendung einer Büroklammer als Gegenelektrode mit einer Rechteckwellenstromquelle. Die von uns verwendeten Bedingungen sind fünf Impulse mit 50 Volt, jeweils 100 Millisekunden lang, mit 50 Millisekunden Pause zwischen den Impulsen.Führen Sie drei Wiederholungen durch, wobei die Elektroden Spitze in der einnormalen Natronlauge eingetaucht ist. Stecken Sie die Elektrode etwas weiter in die Natronlauge hinein und führen Sie eine weitere Wiederholung durch. Führen Sie die Elektrode erneut weiter ein, wobei Sie die Elektrode beide Male ungefähr um die gleiche Distanz vorrücken, und führen Sie eine letzte Wiederholung durch.Dieses gestufte Schärfen erzeugt eine sehr feine Spitze an der Elektrode, wodurch eine genauere und schonendere Insertion der Elektroden in den sich entwickelnden Zebrafischembryo ermöglicht wird. Bewahren Sie die Drähte vor der Verwendung zur Elektroporation für die Mikroinjektion von Morpholinos in Zebrafisch-Otikulärvesikel in einer Schale in Modellierknete gedrückt auf. Richten Sie zunächst Zuchtbecken mit einem Kunststofftrenner ein, um die Männchen von den Weibchen am Abend zu trennen.Platzieren Sie vier Männchen und vier Weibchen in den Behälter und lassen Sie den Behälter über Nacht in einem Inkubationsraum mit einem 14- zu 10-Stunden-Licht-Dunkel-Wechsel. Am nächsten Morgen, nachdem das Licht eingeschaltet wurde, ziehen Sie den Trenner zurück und lassen die Fische etwa 20 bis 30 Minuten lang ungestört. Trennen Sie die Männchen von den Weibchen und entfernen Sie die Zuchtfische aus dem Brutbehälter.Stellen Sie sie in Becken mit frischem Fischwasser. Sammeln Sie die Embryonen aus dem Zuchtbecken, indem Sie das eihaltige Wasser durch ein Sieb gießen. Spülen Sie die Eier im Sieb mehrmals mit frischem Eiwasser ab, bevor Sie sie in eine Petrischale abtropfen lassen.Entfernen Sie alle unbefruchteten oder undurchsichtigen Eier und inkubieren Sie die Embryonen über Nacht in einem Embryonen-Aufzuchtmedium mit 0,3 PPm Methylenblau bei 28,5 °C, während die Embryonen inkubieren. Ziehen Sie Glasnadeln kurz vor der Injektion mit einem Sutter-P-97-Elektrodenzieher. Erwärmen Sie eine AROS-Gel-Basis, bestehend aus 1 % Agarose in Fischwasser, in einer 10-mm-Petrischale auf 37 °C in einem Wasserbad; erwärmen Sie 1 % Niedrigschmelzpunkt-Agarose (LMPA) in Fischwasser, bis sie geschmolzen ist, und halten Sie sie im 37 °C-Wasserbad warm.Füllen Sie eine Glasnadel mit einer Morpho-Lösung und schneiden Sie die Spitze auf den geeigneten Durchmesser zu, etwa 10 bis 15 Mikrometer. Befestigen Sie die Injektionsnadel an einem Mikromanipulator, der mit einer pneumatischen Pico-Pumpe PV820 und einem Stickstofftank verbunden ist. Dekotieren Sie die Embryonen 24 Stunden nach der Befruchtung und betäuben Sie sie mit Trica in 0,3 ppm Methylenblau-Fischwasser.Als Nächstes drei bis fünf anästhetisierte Embryonen mit der rechten Seite nach oben auf die AROS-Gel-Unterlage ausrichten, um eine bequeme, einheitliche Analyse zu ermöglichen; geben Sie ein bis zwei Tropfen 1 % LMPA über jeden Embryo und lassen Sie es erstarren, um den Embryo an Ort und Stelle zu fixieren. Drehen Sie die Petrischale so, dass sich die Ohrbläschen auf der rechten Seite befinden. Dann die Nadel in das Lumen der Ohrbläschen einführen und mithilfe des Fußpedals die Morpho-Lösung injizieren.Sofort nach der Mikroinjektion die befestigten Embryonen zur Elektroporationsstation bringen, um diese vorzubereiten. Zunächst die geschärften Wolframelektroden mit 75 Mikrometer Dicke mit Klebeband an den Mikromanipulatoren befestigen. Danach die Mikromanipulatoren auf beiden Seiten des Objekttisches des Stereomikroskops positionieren.Schalten Sie das Gerät ein und richten Sie die Parameter für die Elektroporation ein. Die effektivsten Parameter für dieses Experiment erwiesen sich als drei Impulse mit 13 Volt und zwei Millisekunden Dauer, jeweils mit einem Abstand von 100 Millisekunden zwischen den Impulsen.Platzieren Sie die Elektroden so, dass die Ohrbläschen gleichmäßig flankiert sind, wobei sich eine Elektrode oberflächlich und die andere tief zur Ohrbläsche befindet. Anschließend wenden Sie einen Strom an, indem Sie ein Fußpedal betätigen oder einen Schalter drücken, sobald die Elektroporation abgeschlossen ist. Gießen Sie Fischwasser auf die aros und entfernen Sie die Embryonen mithilfe einer Glaspipette, indem Sie die Platte vorsichtig schwenken.Seien Sie vorsichtig, um die Embryonen nicht zu beschädigen, insbesondere wenn sie schwer zu entfernen sind. Verwenden Sie eine Nadel, um vorsichtig das umgebende LMPA aufzulösen. Überführen Sie die Embryonen in eine Platte mit Methylenblau-Fischwasser und ziehen Sie die Embryonen bis zu den gewünschten Stadien für die morphologische immunhistochemische Analyse heran. Bei der C-zwei-Hybridisierung und mikroskopischen Analyse werden hier repräsentative Ergebnisse der Injektion in das Ohr und der Elektroporation von Morphos gezeigt. Die hintere oder auditorische Makula, gekennzeichnet als PM, ist eines der Hörorgane des Fisches, wenn sie mit Phinrot markiert ist. Auf diesem Foto erscheinen die Aktinbündel in den Stereozilien der Sinneshaarsinneszellen als rote Punkte auf dem Tischtennisball.Die durch fluoreszenzmarkierte Phin a dargestellte paddelförmige Makula in einem dreitägigen Embryo nach Befruchtung, der mit MIF-Morphos injiziert wurde, zeigt im Vergleich zu Embryonen gleichen Alters, die sowohl elektroporiert als auch injiziert wurden, lediglich mehr Aktinfilamente innerhalb der Stereozilien der Haarzellen. Die Injektion und Elektroporation mit dem Standard-Kontroll-Morpho führte jedoch im Vergleich zur alleinigen Injektion des Morphos nicht zu einer verminderten F- und Färbung. Die Ergebnisse sind in der hinteren Makula ähnlich, jedoch weniger ausgeprägt nach fünf Tagen in Larven, die injiziert und elektroporiert wurden, im Vergleich zu dem Embryo, der nur mit MIF-Morphosen injiziert wurde.Es gab keinen Unterschied zwischen Injektion allein und Injektion mit Elektroporation, wenn der Standard-Kontroll-Morph verwendet wurde. Dieses Embryo, das mit einem Antikörper gegen acetyliertes Tubulin gefärbt wurde, erhielt weder eine Injektion noch eine Elektroporation von MIF-Morphosen. Dieses Embryo wurde elektroporiert, erhielt jedoch keine Injektion.Beide Embryonen zeigen eine normale Färbung für acetyliertes Tubulin. Diese Embryonen wurden jeweils injiziert und elektroporiert. Sie wiesen im Vergleich zu Kontrollen sichtbar eine verminderte Tubulin-Färbung sowie deutlich weniger neuronale Fortsätze in Verbindung mit dem Ohr und den umliegenden Ganglien auf.Wenn das Kontroll-Morpholino für die Injektion und Elektroporation verwendet wurde, beobachteten wir keine Verringerung des Ausmaßes der aketylierten Tubulin-Färbung und auch keine Abnahme der Innervation durch das akustische Ganglion im Vergleich zur Injektion des Morpholinos allein. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Der schwierigste Teil der Technik ist die Elektroporation; besondere Vorsicht sollte darauf verwendet werden, das Gehirn nicht zu beschädigen, wobei geschärfte Elektroden helfen können, dieses Problem zu verringern.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mikroinjektion ist eine gut etablierte und effektive Methode für die Einführung von Fremdstoffen in befruchtete Zebrafisch-Embryos. Hier zeigen wir eine robuste Mikroinjektionstechnik für die Durchführung von mRNA-Überexpression und Morpholino-Oligonukleotid-Gen Knockdown Studien im Zebrafisch.

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Ein anpassungsfähiges reversen genetischen Methode für Zebrafisch-Gen-Funktion während der späteren Phasen der Entwicklung und physiologischen Homöostase wie Geweberegeneration unter Verwendung intraventrikuläre Injektion von Gen-spezifischen morpholinos beurteilen.

Rückwärts Genetische Morpholino Ansatz mit Herz ventrikuläre Injektion auf mehrere Schwer zu Zielgeweben in der Zebrafisch-Larve Transfektion

Mit Hilfe der In-Ovo-Elektroporation entwickelten wir eine Methode, um das auditorische Innenohr und den Cochlea-Kern in Hühnerembryonen selektiv zu transfizieren, um einen zellgruppenspezifischen Knockdown des fragilen X-Mentalretardationsproteins während diskreter Perioden des Schaltkreisaufbaus zu erreichen.

Sezieren der zellautonomen Funktion des fragilen X-mentalen Retardierungsproteins in einem auditorischen Schaltkreis durch In-Ovo-Elektroporation

In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E16 Rattenembryonen

Lernen Sie eine Methode zur gezielten Morpholino-Lieferung in den Zebrafisch-Otocysten mittels Mikroinjektion und Elektroporation. Diese Technik ermöglicht präzise Studien zur Innenohrentwicklung bei Danio rerio.

Direkte Lieferung von MIF Morpholinos Into the Zebrafisch Otocyst durch Injektion und Elektroporation Beeinflusst Inner Ear Entwicklung (Video) | JoVE Journal

Direkte Lieferung von MIF Morpholinos Into the Zebrafisch Otocyst durch Injektion und Elektroporation Beeinflusst Inner Ear Entwicklung

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