RNA-Interferenz in Ticks

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Technik der RNA-Interferenz in Zecken durch Injektion zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst doppelsträngige RNA des Gens oder der interessierenden Gene synthetisiert wird. Die RNA wird dann in Zecken injiziert, wonach sie 24 Stunden lang in einer Feuchtigkeitskammer aufbewahrt werden.

Nach dieser Haltezeit dürfen sich die Zecken von einem Tier wie z.B. einer Schafzecke ernähren. Fütterungsparameter wie Gewicht, Häutung und Eizellenposition sowie die Expression des Zielgens oder der Zielgene von Interesse durch Echtzeit-R-T-P-C-R werden bestimmt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die den Effekt des Silencings von Zielgenen auf die Zeckenbiologie durch Bewertung der biologischen Parameter von Zecken und der Genexpression durch Echtzeit-R-T-P-C-R zeigen.

Unsere Gruppe arbeitet mit Zecken und versucht, molekulare Vorgänge an der Schnittstelle zwischen Zeckenerregern zu charakterisieren, um diese grundlegenden Informationen zu nutzen, um Methoden zur Kontrolle des Zeckenbefalls und der Übertragung von Krankheitserregern auf Mensch und Tier zu entwickeln. Die RNA-Interferenz hat sich als wesentliches Werkzeug in dieser Forschung herausgestellt, da sie die einzige verfügbare Methode zur genetischen Manipulation von Zecken ist. Die Funktion vieler Zeckengene ist unbekannt.

Die RNA-Interferenz ermöglicht es uns, die Rolle von Zeckengenen und der Genexpression in vielen Aspekten der Zeckenbiologie zu definieren, einschließlich Paarung, Fortpflanzung, Fütterung, Verdauung, Speicheldrüsenfunktion und der Kompetenz des Zeckenvektors für die Übertragung von Krankheitserregern. Das Verfahren wird vom Zecken-RNA-Interferenzteam unseres Labors, Dr. Ed Lewin, Doktorand, sowie Busby und mir demonstriert. Um doppelsträngige RNA zu erzeugen, synthetisieren Sie zunächst Oligonukleotid-Primer, die T-7-Promotorsequenzen für die In-vitro-Transkription von RNA enthalten.

Zum Beispiel das Dermazentrum vari lesin. Verwenden Sie die hier gezeigten Oligonukleotid-Primer D, acht, A, a, T75 und D, acht, DVT 73. Amplifizieren Sie das Zielgen mit R-T-P-C-R unter Verwendung von 10 Pikosolen jedes Oligonukleotid-Primers und einem bis 10 Nanogramm Zecken-Gesamt-RNA.

Als nächstes reinigen Sie das PCR-Produkt. Verwenden Sie dann acht Mikroliter oder etwa 100 Nanogramm, um doppelsträngige RNA zu synthetisieren. Um die Zecken für die Injektion vorzubereiten, waschen Sie die Zecken zuerst in der folgenden Reihe von Lösungen: Leitungswasser, 3%Wasserstoffperoxid destilliertes Wasser, zweimal 70%Ethanol und zwei letzte Wäschen mit destilliertem Wasser.

Führen Sie jede Wäsche in einem 50-Milliliter-Einweg-Zentrifugenröhrchen durch Schütteln durch. Anschließend wird die Lösung durch ein feinmaschiges Drahtsieb umgefüllt. Blockieren Sie die Zecken auf Papiertüchern trocknen und aliquotieren Sie die Zecken dann je nach Experiment in Gruppen von 20 bis 50.

Legen Sie jede Gruppe in einen 1,25-Unzen-Plastikbecher mit einem dicht schließenden Deckel und beschriften Sie jeden Becher mit der Versuchsgruppe. Als nächstes stellen Sie ein RNAi-Team zusammen, das aus drei Personen besteht, die den Injektionsprozess durchführen. Die erste Person positioniert jede Zecke auf doppeltem Klebeband, das auf einer drei mal sechs Zoll großen Platte aus rotem Zahnwachs befestigt ist.

Die zweite Person injiziert die Zecken und die dritte überwacht die Zecken nach der Injektion, atmet Kohlendioxid auf die Zecken ein, um sie zu aktivieren, und zählt und überträgt die lebenden Zecken in Becher, die mit der Versuchsgruppennummer beschriftet sind. Alle Teammitglieder müssen Einweghandschuhe tragen Um mit der Zeckeninjektion zu beginnen, fangen Sie eine Zecke mit einer Dumont-Feinzange ein und legen Sie sie mit der Bauchseite nach oben auf ein doppeltes Klebeband, das auf dem Blatt aus rotem Zahnwachs befestigt ist. Positionieren Sie die Zecken in Fünfergruppen. Lege einen kleinen Streifen Kreppband über die Mundteile aller fünf Zecken.

Um sie weiter zurückzuhalten, lassen Sie den größten Teil des Körpers frei, damit der Injektionsprozess vom Zeckeninjektor beobachtet werden kann. Um die Zecke zu injizieren, stechen Sie mit einer Mono-Eject-Insulinspritze, die mit einer 29-Gauge-Half-Inch-Nadel ausgestattet ist, ein Loch in den unteren rechten Quadranten der ventralen Oberfläche des Exoskeletts. Injizieren Sie anschließend sofort 0,2 bis 0,5 Mikroliter doppelsträngige RNA-Lösung in die Zecken mit einer speziell angefertigten Hamilton-Spritze und einer 33-Gauge-1-Zoll-Nadel mit einer 45-Grad-abgeschrägten Spitze, platzieren Sie die Nadel gut in der Zeckenhöhle, um die Platzierung und Retention der doppelsträngigen RNA sicherzustellen.

Auch wenn nach der Injektion Flüssigkeit freigesetzt wird, stellt eine tiefe Platzierung der Nadel für die Injektion sicher, dass genügend doppelsträngige RNA in der Zeckenhöhle abgelagert wird, um ein Gen-Silencing zu verursachen. Es sollte darauf geachtet werden, dass es nicht übertrieben wird. Injizieren Sie die Zecken, was zum Verlust der Hämolymphe und zum Tod der Zecke führt. Sofort nach der Injektion der Zecken nehmen Sie sie mit der feinen Pinzette vom doppelten Klebeband auf und legen Sie sie in einen Auffangbehälter aus Plastik.

Die Zecken bleiben nach der Injektion kurzzeitig inaktiv, sollten aber bald beginnen, um die Schale herumzukrabbeln. Aktivieren Sie die Zecken, indem Sie Kohlendioxid auf sie einatmen. Sobald die Zecken kriechen und aktiv sind, heilt die Injektionswunde schnell und sie werden höchstwahrscheinlich überleben.

Zählen Sie die Zecken in jeder Versuchsgruppe und legen Sie jede Gruppe in einen beschrifteten Plastikbecher mit fest geschlossenem Deckel. Ersetzen Sie alle Ticks, die in der aktuellen Gruppe absterben, bevor Sie die nächste experimentelle Gruppe injizieren. Reinigen Sie die Hamilton-Spritze, bevor Sie die nächste Versuchsgruppe injizieren, indem Sie die Spritze mit frischem 3%igem Wasserstoffperoxid füllen und dann ausstoßen.

15 Mal, gefolgt von 15 Wäschen mit sterilem Wasser. Achten Sie darauf, den Kolben der Hamilton-Spritze nicht zu verbiegen, da sich der Kolben sonst nicht reibungslos bewegt und auf die für die Zeckeninjektion erforderliche sanfte Berührung reagiert. Legen Sie die Zecken nach der Injektion in eine Kammer mit einem mit Wasser und Kaliumsulfat gefüllten Behälter, der eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrechterhält, und halten Sie sie einen Tag lang aufrecht.

Als nächstes legen Sie einzelne Zecken in Zeckenfütterungszellen, die an ein Schaf geklebt sind, und lassen Sie sie mit der gleichen Anzahl von nicht injizierten männlichen oder weiblichen Zecken füttern, je nachdem, welches Geschlecht nicht injiziert wurde. Sammeln und winken Sie weibliche Zecken aus der Fütterungszelle, nachdem sie die Fütterung für etwa 10 Tage abgeschlossen haben oder wenn die Kontrollweibchen abgesetzt sind, brütet der Wirt jede Gruppe von Zecken in der Feuchtigkeitskammer aus, bis die Eizellenposition abgeschlossen ist. Bewerten Sie die Position der Eizellen nach Gruppen, indem Sie die von allen Zecken in einer Gruppe produzierten Eier wiegen, um den Zeckenphänotyp nach der Fütterung zu bewerten.

Bestimmen Sie die Anzahl der überlebenden Zecken und berechnen Sie das Zeckengewicht sowie die Position der Eizellen und die Fruchtbarkeit der Eier. Abhängig vom Zielgen und den Zielen der Studie können weitere Analysen durchgeführt werden, um das Gen-Silencing durch R-T-P-C-R zu bestätigen. Nach der Fütterung sezieren Sie die Speicheldrüsen und Eingeweide von einzelnen Zecken aus den injizierten und doppelsträngigen RNA-injizierten Gruppen und extrahieren Sie dann die Gesamt-RNA aus den einzelnen Gewebeproben.

Analysieren Sie die Zielgentranskripte in einzelnen Geweben mit Echtzeit-R-T-P-C-R und normalisieren Sie die RNA-Spiegel gegen ribosomale RNA von Zecken 16. Führen Sie unter Verwendung der Gennormmethode Dissoziationskurven am Ende der Reaktion durch, um sicherzustellen, dass nur ein Amplikon gebildet wird und dass die Amplikons für jede Probe konsistent im gleichen Temperaturbereich denaturieren, vergleichen Sie die normalisierten CT-Werte für mRNA-Spiegel zwischen kontrolliert injiziert und doppelsträngig. RNA-injizierte Zecken mit dem T-Test des Schülers.

Das hier beschriebene Protokoll wurde in unserem Labor für RNAi bei vielen verschiedenen exotischen Zeckenarten verwendet. Die Menge an doppelsträngiger RNA, die in die Zecken injiziert wird, variiert mit der Größe der Zecke. Größere Zeckenarten können ein größeres Volumen aufnehmen.

Die Verweise sind dem begleitenden schriftlichen Teil des Protokolls zu entnehmen. Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, sollte nach 24 Stunden eine Mortalität von weniger als 5 % durch das Injektionsverfahren erreicht werden. Ein typischer Phänotyp nach einem Gen-Knockdown in Zecken ist hier dargestellt, bei dem einer Gruppe von Zecken Pools doppelsträngiger RNA injiziert wurden, die zum Screening auf zeckenschützende Antigene verwendet wurden.

Bei Zecken, die lichtmikroskopisch untersucht werden, kann eine zelluläre Degeneration im Zeckengewebe beobachtet werden. Phänotypische Veränderungen können auch mit Funktionsverlust einhergehen. Zum Beispiel führt die RNAI von SUBIN zu sterilen Männchen, die sich nicht erfolgreich mit den Weibchen paaren können.

Andere Methoden können verwendet werden, um den Einfluss von Gen-Silencing auf die Gen- und Proteinexpression und auf die Zeckenbiologie zu bestimmen, einschließlich Echtzeit-R-T-P-C-R, Lichtelektronenmikroskopie oder konfokaler Mikroskopie. Genomik oder Proteomik. RNA-Interferenz kann auch in Zeckenzellkulturen durchgeführt werden und stellt eine In-vitro-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen Zeckenzellen und Krankheitserregern dar.