Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, lebensfähige myogene und adipogene Vorläuferzellen aus spiegelnden Skelettmuskeln zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Muskelgewebe von euthanasierten Mäusen entnommen wird. In einem zweiten Schritt wird die Probe enzymatisch verdaut, wodurch das Gewebe in einzelne Zellen dissoziiert wird.

Als nächstes wird die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder Fakten verwendet, um die Vorläuferzellen zu isolieren. Es werden Ergebnisse erhalten, die die Lebensfähigkeit und Differenzierung der isolierten Zellen bei der Transplantation in Empfängermäuse auf der Grundlage einer histochemischen Färbung für die genetische Markierung, in diesem Beispiel die humane alkalische Phosphatase, zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bereits bestehenden Techniken wie prepl besteht darin, dass die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten direkt vom Tier isoliert werden können.

Zum Beispiel nach der Induktion von Gewebeschäden, was bedeutet, dass es keine Selektion der Zellpopulation gibt und die Zellpopulation auf molekularer Ebene analysiert werden kann, um die verschiedenen Stadien zu betrachten, die die Zellen während des Prozesses der In-vivo-Regeneration durchlaufen. Diese Technik kann also dazu beitragen, eine kritische Frage im Bereich der Geweberegeneration zu beantworten, und insbesondere welche Rolle jeder Zelltyp bei der In-vivo-Regeneration spielt und wie diese Zelltypen miteinander interagieren, um ein gesundes Gewebe wieder aufzubauen. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die Therapie von Krankheiten wie Muskeldystrophie.

Da die Erforschung dieser Vorläuferzellen schließlich regenerative Strategien für diese Art von Krankheiten ermöglichen kann. Darüber hinaus erstrecken sich die Auswirkungen dieser Technik auf eine Reihe anderer Gewebe, die vom Herzen bis zum Fettgewebe reichen, da zumindest die fibro-adipogenen Vorläuferzellen in jedem einzelnen Gewebe gefunden wurden, das wir bisher getestet haben. Im Allgemeinen werden Neulinge in dieser Technik Schwierigkeiten haben, da harte Dissoziationstechniken die Lebensfähigkeit der Zellen verringern und zu viele Ablagerungen erzeugen, die dann später die saubere Trennung der Zellen beeinträchtigen.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir uns entschieden, die Durchflusszytometrie, die normalerweise für APOE-Zellen verwendet wird, auf die Untersuchung von Stammzellen in festen Geweben anzuwenden. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist wichtig, da die Schritte der Gewebedissoziation schwer zu erlernen sind, da es sehr schwierig ist, sie richtig zu beschreiben. Diese Technik wird heute Linky demonstrieren, ein Forschungsassistent in meinem Labor, der die Technik zuerst entwickelt und optimiert hat. Für dieses Verfahren werden mindestens zwei Mäuse benötigt.

Eine Maus wird für Zellen verwendet, um die notwendigen Einzelfarben- und Antikörper-Isotyp-Kontrollen für Fakten bereitzustellen, und die andere liefert die zu sortierende Probe. Besorgen Sie sich zunächst Mäuse, die zwischen sieben und 12 Wochen alt sind und zuvor in einer sterilen Laborhaube eingeschläfert wurden. Legen Sie die euthanasierte Maus mit dem Gesicht nach oben auf ein steriles Papiertuch und besprühen Sie das Fell gründlich mit 70%igem Ethanol, um eine Kontamination mit einer Pinzette in der einen und einer scharfen Schere in der anderen Hand zu verhindern.

Heben Sie die Haut im Bauchbereich an und machen Sie einen kleinen Längsschnitt. Fassen Sie die Haut auf jeder Seite des Schnitts an und schälen Sie die Haut zurück, um die Muskeln der hinteren Gliedmaßen vollständig freizulegen. Als nächstes schneiden Sie das Muskelgewebe heraus, indem Sie die geschlossene Schere unter den Muskel und über das Schienbein einführen und dann die Schere öffnen.

Die hintere Kante der Klingen erzwingt sanft die Trennung des Muskels von der Tibia. Wiederholen Sie dies für beide Seiten der Tibia und legen Sie das Gewebe in eine 60-Millimeter-Petrischale. Schneiden Sie nun auf die gleiche Weise das Muskelgewebe aus dem Oberschenkelknochen heraus und geben Sie das Gewebe in die Petrischale.

Wiederholen Sie den Vorgang für jede Maus mit einer Petrischale pro Maus. Als nächstes dissoziieren Sie das Gewebe in einzelne Zellen. Geben Sie zwei Milliliter oder 1000 Einheiten Kollagenase, zwei und 20 Mikroliter 250 millimolare Calciumchlorid-Stammlösung in jede Petrischale mit Muskelgewebe.

Dann arbeiten Sie schnell und sorgfältig. Verwenden Sie zwei graue Pinzetten, eine gezackte und eine mit zwei Zähnen, um das Gewebe in einen Kubikmillimeter große Stücke zu zerreißen. Entferne und entsorge so viel Nicht-Muskelgewebe wie möglich.

Die Petrischalen abdecken und bei 37 Grad Celsius 30 Minuten inkubieren. Nehmen Sie nach der Inkubation die Schalen heraus und geben Sie sie wieder in die sterile Laborhaube zurück. Entfernen Sie den Kolben aus einer Drei-Milliliter-Spritze und zerdrücken Sie damit das Gewebe.

Verwenden Sie einen Kolben pro Platte, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Geben Sie etwa fünf Milliliter kaltsteriles PBS in jede Petrischale und geben Sie den Inhalt der Schale in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie mit weiteren fünf Millilitern PBS, um das gesamte Gewebe wiederherzustellen, und geben Sie es in das konische Röhrchen.

Waschen und zentrifugieren Sie die Proben dreimal gemäß dem Protokoll. Geben Sie als nächstes einen Milliliter einer Lösung, die aus Kollagenase D dys Raum zwei und Calciumchlorid besteht, in jedes Röhrchen und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit Rotation für eine Stunde. Geben Sie nach der Inkubation fünf Milliliter kaltsteriles PBS in die Röhrchen, wirbeln Sie die Röhrchen kurz vor und tritrieren Sie mehrmals, um Klumpen zu dissoziieren.

Füllen Sie die Röhrchen mit PBS, mischen Sie gut und legen Sie sie auf Eis Um verbleibende große Gewebestücke zu entfernen, legen Sie ein 40-Mikron-Zellsieb über ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis und filtrieren Sie die Zellsuspension. Teilen Sie den Durchfluss gleichmäßig auf drei konische 50-Milliliter-Röhrchen auf, die mit kaltem, sterilem PBS gefüllt sind, und zentrifugieren Sie ihn fünf Minuten lang bei acht Grad Celsius bei 1600 U/min. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig das S und legen Sie die Zellen auf Eis, um myogene und adipogene Vorläuferzellen zu färben und zu sortieren.

Richten Sie zunächst die sechs einfarbigen Mischkontrollen gemäß dem beigefügten schriftlichen Protokoll ein. Zu diesen Kontrollen gehören Hulk-Färbungen ohne Färbung, Propidiumiodid, CD 31 und CD 45 FSE-markierte Antikörper, SC one P-markierte Antikörper der Größe sieben und alpha sieben A PC-markierte Antikörper. Richten Sie anschließend die drei Antikörper-Isotyp-Kontrollfärbemischungen gemäß dem schriftlichen Protokoll ein.

Nachdem die Färbemischungen vorbereitet wurden, werden neun 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen für die Einzelfarb- und Isotyp-Kontrollproben beschriftet. Reanimation: Suspendieren und kombinieren Sie die Zellen aus den drei konischen Röhrchen in einem Gesamtvolumen von einem Milliliter Faxpuffer. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der Zellen in jedes markierte Einor-Kontrollröhrchen und pipettieren Sie je nach Konzentration der Antikörper zwischen fünf und 10 Mikroliter der Färbemischungen in die entsprechenden Kontrollröhrchen.

Die Zellen der Probenmaus werden in 200 Mikroliter Faxpuffer wieder suspendiert und in einem der konischen 50-Milliliter-Röhrchen kombiniert. Dann gibst du 800 Mikroliter des Antikörper-Cocktails hinzu. Mischen Sie jedes der Kontrollröhrchen und Probenröhrchen.

Gut inkubieren Sie sie eine Stunde lang auf Eis. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen, indem Sie jeweils einen Milliliter Faxpuffer in jedes der neun Kontrollröhrchen und etwa 20 Milliliter Faxpuffer in das Probenröhrchen geben. Zentrifugieren Sie die Kontrollröhrchen fünf Minuten lang bei 3000 U/min.

Das konische Probenröhrchen wird fünf Minuten lang bei 1600 U/min zentrifugiert. Aspirieren und verwerfen Sie dann die Schlinge nach der Zentrifugation. Suspendieren Sie die Kontrollzellen in jedem Eend-Orph-Rohr mit einem Milliliter Faxpuffer und resuspendieren Sie die Probenzellen mit vier Millilitern Faxpuffer.

Fügen Sie Propidiumiodid zu den Probenzellen und Isotypkontrollen sowie zum Pi hinzu. Einfarbiges Steuerrohr. Pipettieren Sie die Zellen in Faxschläuche durch die Kappe des Zellsiebs, um verbleibende Klumpen zu entfernen, die das Zytometer beeinträchtigen könnten.

Richten Sie das Faxgerät mit einer einzigen Farb- und Isotypsteuerung ein. Sortieren Sie die Probenzellen gemäß dem beigefügten schriftlichen Protokoll und sammeln Sie jede Population separat. Und ein 3,5 Milliliter Sammelröhrchen Lebensfähige myogene Vorläufer sind die Population, die geklopft ist und Alpha Sieben, ein PC-positiv und PI CD 31 FE, CD 45 FE und Ska.

Ein PE der Größe sieben, negative lebensfähige adipogene Vorläufer, ist gekümpelt und ska, ein PE der Größe sieben positiv und Pi CD 31, FE CD 45 FE und Alpha Sieben, ein PC negativ. Eine einzelne Wildtyp-Maus kann etwa einmal 10 bis zum fünften adipogenen Vorläufer und 1,5 bis zweimal 10 bis zum fünften liefern. Myogene Vorläuferzellen mit einer Lebensfähigkeit von mehr als 95 %.

Um die Zellen für die Transplantation in Wirtsmäuse vorzubereiten, werden die Zellen gewaschen. Zuerst zentrifugieren Sie verzerrte Zellen fünf Minuten lang bei 1500 U/min. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern PBS und überführen Sie sie in Einor-Röhrchen.

Die Röhrchen werden fünf Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert und der Überstand entfernt. Dann resus suspendieren myogene Vorläuferzellen in PBS oder adipogene Vorläufer in matri matrigel bei etwa 10 bis sechs Zellen pro Milliliter. Nach der Vorbereitung der anästhesierten Wirtsmäuse für jeden Spenderzelltyp gemäß dem schriftlichen Protokoll verwenden Sie eine drei Kubikzentimeter große Insulinspritze, um 20 Mikroliter etwa 20.000 Zellen von myogenen oder adipogenen Vorläuferzellen zu injizieren.

Lassen Sie den transplantierten Zellen die entsprechende Zeitspanne, um sich zu differenzieren, in der Regel etwa drei Wochen. Isolieren Sie dann das Zielgewebe und bereiten Sie es für die Kryosektion vor, wie im Protokoll in dieser Abbildung beschrieben, die Sortierstrategie wird demonstriert, um die adipogenen und myogenen Vorläuferzellen zu isolieren, lebensfähige Zellen wurden auf der Grundlage von Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung identifiziert, Hawk-Färbung wurde verwendet, um einen nuklearen Trümmer auszuschließen, und Propidiumiodid- oder PI-Färbung wurde verwendet, um tote Zellen auszuschließen, Hämatopoetische und Endothelzellen bzw. CD 45- bzw. CD 31-Zellen wurden dann von den Sortiertoren ausgeschlossen. Schließlich die Teilmenge, die Alpha sieben positiv ist.

SKA eins negativ enthält alle myogenen Vorläuferzellen und die Population, die alpha sieben negativ ist. SKA one positive enthält alle adipogenen Vorläuferzellen, die Fluoreszenz abzüglich einer Isotypkontrolle bestätigt die Spezifität der Färbung. Darüber hinaus wurden Reinheitskontrollen der adipogenen und myogenen Untergruppen durchgeführt.

Nach der Sortierung in diesem repräsentativen Beispiel können adipogene Vorläufer-Spenderzellen, die transgene, humane alkalische Phosphatase exprimieren, die subkutan injiziert werden, histochemisch im Wirtsgewebe identifiziert werden, wie durch Braunfärbung angezeigt. Myogene Vorläuferzellen, die transgen exprimieren. In diesem Gewebeschnitt wurde die intramuskulär injizierte humane alkalische Phosphatase identifiziert, wie in braun dargestellt.

Mit der Histochemie Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn mehr Proben verarbeitet werden, verlängert sich die Zeit. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, schnell und sanft zu arbeiten.

Vermeiden Sie es daher, zu viele Proben auf einmal zu verarbeiten. Eine Verlängerung der Verarbeitungszeit reduziert die Zellvariabilität nach diesem Verfahren erheblich. Andere Methoden, wie die colono SC OG-Expressionsanalyse mittels quantitativer R-T-P-C-R, können ebenfalls eingesetzt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie diese Pro-Zellen auf Schäden in vivo nach ihrer Entwicklung reagieren.

Diese Technik ebnete den Weg für andere Forscher auf dem Gebiet der Geweberegeneration, um die Wechselwirkung zwischen den Pro-Zellen in geschädigtem Gewebe zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dieses Gewebe ohne Beschädigung dissoziieren können. Die Vorläuferzellen identifizieren die Vorläuferzellen anhand ihrer Servicemarker und analysieren ihr Entwicklungspotenzial in vivo.

Danke für das Aufpassen. Viel Glück bei Ihrem Experiment.