Name: Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Lernen Sie die Isolierung myogener und adipogener Vorläuferzellen aus murinem Skelettmuskel mittels enzymatischer Dissoziation und FACS. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zellviabilität und Differenzierung in vivo.

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1. Tissue Collection: <ol><li> Verwenden Mäusen zwischen 7 und 12 Wochen alt. In der Regel werden mindestens zwei Tiere verwendet: Die eine ist die Einrichtung der FACS einfarbige Kontrollen für Entschädigung und für die Fluoreszenz-minus-eins Isotypkontrolle Proben erforderlich. Die andere ist die eigentliche Probe für die Sortierung. </li><li> Euthanize die Mäuse durch CO 2-Inhalation oder nach einer Ethik-Protokoll der Wahl. Legen Mäuse auf einem Papiertuch, nach oben und Spray mit 70% Ethanol gründlich, um eine Kontamination mit der Maus Fell zu verhindern. </li><li> Heben Sie die Haut in der Bauchregion mit einer Pinzette, dann machen Sie einen kleinen Längsschnitt mit einer scharfen Schere. </li><li> Peel die beiden Hautlappen in entgegengesetzte Richtungen (oben und unten) vollständig aussetzen Hinterbein darunter liegenden Muskeln. </li><li> Excise das Muskelgewebe durch das Einfügen und Erweiterung der Schere an beiden Seiten der Tibia. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Oberschenkelknochen, um das Muskelgewebe zu extrahieren. </li><li> Legen Sie alle herausgeschnitten Muskelgewebe in 60mm Petrischalen, mit einer Schale für das Gewebe von jeder Maus. </li><li> Wiederholen Sie die oben für alle Mäuse. </li></ol> 2. Distanzieren Tissue in einzelne Zellen durch enzymatische Verdauung: In diesem Abschnitt des Protokolls, verwenden Sie sterile Reagenzien und Instrumente und Arbeiten unter sterilen Bedingungen. <ol start="9"><li> Geben Sie 2 ml Collagenase II (Sigma, Kat. Nr. 6885, 500U / ml) und 20 ul von 250mm CaCl 2 Lager zu jedem Petri-Schale. </li><li> Reißen Sie das Muskelgewebe in kleine Stücke (ca. 1 mm 3) mit zwei Pinzetten (eine gezackte, eins mit 2 Zähnen, von Fine Science Tools, cat # 11051-10, 11154-10), aufmerksam zu entfernen und zu entsorgen, wie viel kontaminiertes Nicht-Muskelgewebe wie möglich. </li><li> Decken Sie die Petrischalen und inkubieren sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. </li><li> Rufen Sie die Petri-Schalen und ein 3-ml-Spritze Kolben gründlich Maische die Gewebestücke. Verwenden Sie einen Stempel für jede Probe, um Kontaminationen zu vermeiden. </li><li> Fügen Sie einige (~ 5 ml) sterilen kalten PBS zu jeder Petrischale und Transfer des Gewebes Schlamm in einen 50 mL Falcon-Röhrchen (spülen Sie die Petri-Schale bei Bedarf alle Gewebe zu erholen) </li><li> Shake the Falcon Röhrchen kräftig, füllen Sie das Röhrchen mit PBS, Zentrifuge @ 800rpm x 5 Minuten (Eppendorf Tischgerät Modell: 5810R), und saugen Sie den Überstand (3 Mal wiederholen) </li><li> 1ml Mischung von Collagenase D (Roche, Kat. Nr. 11088882001, 1,5 HE / ml) / Dispase II (Roche, Kat. Nr.: 04942078001, 2.4u / ml) und 10 &amp;mgr; l von CaCl 2 (250mm) in jedes Röhrchen, bei 37 Grad Celsius mit Rotation für eine Stunde. </li><li> Fügen Sie 5-10 ml kalte, sterile PBS, Wirbel und Pipette gründlich, um das Gewebe zu homogenisieren. </li><li> Füllen Sie Rohre mit PBS und gut mischen. </li><li> Übertragen Sie die Flüssigkeit in einen 40 um Zellsieb auf einem 50 mL Falcon-Röhrchen platziert, um herauszufiltern, die übrigen große Stücke von Gewebe. Teilen Sie jede Probe gleichmäßig in drei 50 mL Falcon-Röhrchen. Füllen Sie jedes der Röhrchen mit PBS zentrifugieren @ 1600rpm für 5 Minuten bei 8 Grad Celsius. </li><li> Überstand verwerfen und sammeln Zellen für die Färbung. </li></ol> 3. Antikörper-Färbung und Sortierung: In diesem Abschnitt des Protokolls, mit sterilen FACS und Sammlung Puffer und Arbeit unter sterilen Bedingungen. Kommerzielle Antikörper sind in der Regel als steril, wenn sie richtig gehandhabt. <ol start="20"><li> Für einzelne Farb-und Isotyp-Kontroll-Proben, resuspendieren der Probe in 1 ml FACS-Puffer und teilen die suspendierten Zellen in neun 1,5 ml pre-markierten Eppendorf-Röhrchen (100 ul pro Röhre). <ol><li> Richten Sie einfarbige Färbung mischt nach der folgenden Tabelle: ACHTUNG: Die endgültige Konzentration von Isotyp-Kontroll-Antikörper in der Fleck sollte, dass der primäre Antikörper sind sie die Kontrolle für übereinstimmen. Zum Beispiel, wenn anti-Sca-1 für 1 μg/10 6 Zellen verwendet wird, muss der entsprechende Isotyp in der gleichen Konzentration eingesetzt werden. <table border="1"><tbody><tr><td> Tube # </td><td> Name der Röhre </td><td> Firma </td><td> Cat # </td><td> Klon </td><td> Isotyp </td><td> Verdünnung </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Non-Fleck </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Hoechst33342 </td><td> sigma </td><td> B2261 </td><td></td><td></td><td> 2-5ug/ml </td></tr><tr><td> 3 </td><td> PI </td><td> sigma </td><td> P4864 </td><td></td><td></td><td> 1ug/ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> 4 </td><td rowspan="2"> CD31-FITC CD45-FITC </td><td> eBioscience </td><td> 11-0311-85 </td><td> 390 </td><td> Rat IgG2a </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Haus gemacht </td><td></td><td> I3 / 2 </td><td> Rat IgG2b </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> SCA1-PECY7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-5981-82 </td><td> D7 </td><td> Rat IgG2a </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> α-7 APC </td><td> Haus gemacht </td><td></td><td> R2F2 </td><td> Rat IgG2b </td><td> 1000 </td></tr></tbody></table></li><li> Set up Isotypkontrolle Färbung mischt anhand der folgenden Tabelle: <table border="1"><tbody><tr><td> Tube # </td><td> Name von Rohr </td><td> Hoechst </td><td> PI </td><td> CD31- FITC </td><td> CD45- FITC </td><td> Sca- PE-CY7 </td><td> A-7- APC </td><td> Rat- IgG2b- APC </td><td> Rat- IgG2a- pecy7 </td><td> Rat- IgG2a- FITC </td><td> Rat- IgG2b- FITC </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Iso- CD31 / CD45 </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 8 </td><td> Iso- Sca- pecy7 </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 9 </td><td> Iso- α-7-APC </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table></li><li> Pipettieren der einzelnen Farb-und Isotopen-Kontrollfärbung mischt (wir normalerweise passen Sie die Konzentration von Antikörpern, so dass zwischen 5 und 10 l Färbung Mix zu jeder Probe hinzugefügt werden) in die entsprechenden Eppendorf-Röhrchen aus Schritt 20. Gut mischen und auf Eis inkubieren für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Stain Zellen von Probe-Maus mit 800μL der Antikörper-Cocktail (unten) für FACS cell sorting. Gut mischen und auf Eis inkubieren für 1 Stunde. Antikörper-Cocktail: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA1-PECY7, α-7 APC ACHTUNG: Das optimale Verhältnis von Antikörpern gegen Zellen müssen durch individuelle Titration jeder Antikörper, da erhebliche Unterschiede zwischen den Chargen gibt bestimmt werden kann. Die optimale Menge an Antikörper verwendet werden sollte in μgs Antikörper pro 10 6 Target-Zellen exprimiert und konstant gehalten werden, wenn mit der gleichen Charge des Antikörpers. Klar, wenn die Zahl der Zielzellen nicht signifikant ändert zwischen den Experimenten, oder wenn die Färbung Band mit der Anzahl der Zellen skaliert wird, eine feste Verdünnung von jeder Antikörper können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Wash: In ca. 1 ml FACS-Puffer zu jedem der 9 Röhren, fügen Sie etwa 20 mL FACS-Puffer, um das Probenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Eppendorf-Röhrchen @ 3000rpm für 5 Minuten (Eppendorf Tischzentrifuge, Modell: 5417C). Centrifuge das Probenröhrchen @ 1600rpm für 5 Minuten (Eppendorf Tischzentrifuge, Modell: 5810R). </li><li> Absaugen und den Überstand verwerfen aus allen Rohren. </li><li> Die Zellen in der FACS-Puffer (1 ml für jede der Steuerungen, 4ml für die Sortierung Probe), um Pipette Zellen in "FACS-Röhrchen" durch die Zelle Sieb Kappe (BD Falcon cat # 352235, 40 um Porengröße) zu entfernen restlichen Klumpen, kann Einfluss auf die Durchflusszytometer. </li><li> Richten Sie die FACS-Sorter mit einfarbigem Kontrollen und Isotypkontrollen. </li><li> Sammeln sortierten Zellen nach der folgenden Tabelle in einer 3,5-ml-Collection-Puffer (95% DMEM, 5% FBS) getrennt. Normalerweise, wenn die Ernte beide Hinterbeine, könnte ein einzelner Wildtyp-Maus ungefähr 150.000 myogenen Vorläuferzellen oder 100.000 adipogenen Vorläuferzellen, die Lebensfähigkeit von über 95%, wie von reanalyzing sortierten Zellen durch FACS gemessen am Ende des Verfahrens (Abbildung 1 Ertrag ) Definition von myogenen und adipogenen Vorfahren auf Oberflächenbeschmutzung Basis <table border="1"><tbody><tr><td> Antikörper / Fleck </td><td> Myogenen Vorläuferzellen (MP) </td><td> Adipogene Vorläuferzellen (AP) </td></tr><tr><td> Hoechst </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> PI </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td>- </td><td> - </td></tr><tr><td> SCA1-PECY7 </td><td> - </td><td> + </td></tr><tr><td> α-7 APC </td><td> + </td><td> - </td></tr></tbody></table></li></ol> 4. Transplantation: <ol start="28"><li> Centrifuge sortierten Zellen @ 1500rpm für 5 Minuten, entfernen Sie den Überstand und Transfer Zellen autoklaviert Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml), spülen Zellen mit 500 ul sterilem PBS (Serum-freien!), Dann Zentrifuge @ 3000rpm für 5 Minuten. Unter Beibehaltung aller Reagenzien unter sterilen Bedingungen und Arbeiten in einer Gewebekultur Kapuze, resuspendieren myogenen Vorläuferzellen in PBS oder adipogenen Vorläuferzellen in Matrigel (BD cat # 354234) bei ca. 10 6 Zellen / ml. </li><li> Transplant myogenen Vorläuferzellen oder adipogenen Vorläuferzellen zu Empfängermäuse. <ol><li> Betäuben die Maus mit isoflouran nach Ihrer Institution Politik. </li><li> Shave das Haar um die Injektion Region, dann sterilisieren der Haut durch Reiben mit 70% Ethanol </li><li> Inject 20 &amp;mgr; l von myogenen Vorläuferzellen oder adipogenen Vorläuferzellen (= 20k-Zellen) mit einem 3 / 10 CC Insulinspritze (BD cat # 309300). </li></ol></li><li> Nach einer angemessenen Zeit (3 Wochen funktioniert gut, aber Muskelfasern Ausdruck Spender stammenden transgenen Marker sind in der Regel innerhalb einer Woche nach der Transplantation deutlich), betäuben den Empfänger Mäuse aus Schritt 29 durch intraperitoneale Injektion von 400 ul Avertin (Sigma Cat # T04840-2, 25 mg / mL), dann transkardial perfuse mit 50 ml PBS (enthält 10 uM EDTA) zuerst, gefolgt von 15 ml 4% PFA gefolgt. Sammeln Zielgewebe, post-fix mit 4% PFA über Nacht, wenn erforderlich, dann Transfer bis 20% Saccharose über Nacht. Embed in OCT, Gefrier-und Gefrier. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Wenn MP in Maus-Skelettmuskel transplantiert werden, sie leicht mit bereits vorhandenen Muskelfasern verschmelzen. Daher ist jede genetische Label in der Spenderzellen wird leicht erkennbar in den Fasern, die sie erhalten haben. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel, wo die transplantierten Zellen exprimierten humanen alkalischen phostphatase zeigte histochemisch. Wenn AP transplantiert sind das Ergebnis hängt stark von der Umgebung der Transplantation Ort: bei transplantierten subkutan diese Zellen Herkunft geben Adipozyten und Myofibroblasten (siehe Abbildung 2). In vielen anderen Standorten, einschließlich Muskeln, sie nicht überleben, wenn Verfettung hat 3 induziert worden. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Sorting-Strategie zur Isolierung von Vorläuferzellen Populationen aus Muskelfleisch (A) Sorting Strategie:. Lebende Zellen wurden auf der Grundlage Vorwärtsstreuung und side scatter identifiziert. Hoechst-Färbung wurde verwendet, um kernlosen Schutt und Propidiumiodid (PI)-Färbung auszuschließen, um tote Zellen auszuschließen. Hämatopoetischen (CD45) und Endothelzellen (CD31)-Zellen wurden aus der Sortierweichen ausgeschlossen. Die α7 + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - Scal - Teilmenge enthält alle myogenen Vorläuferzellen (MP). Die Scal + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - α7 - Bevölkerung enthält adipogenen Vorläuferzellen (AP). (B) Fluoreszenz-minus-eins (FMO) Isotypkontrollen bestätigen die Spezifität der Färbung. (C) Reinheit überprüft der MP-und AP-Teilmengen nach dem Sortieren. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse nach MP-und AP-Transplantation. AP wurden subkutan (oberes Feld) transplantiert und MP intramuskulär (unten). In beiden Fällen entstand Spenderzellen aus einer Maus zum Ausdruck transgene menschliche alkalische Phosphatase, durch die braune Färbung identifiziert.

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine vernünftige Balance zwischen hohen Ausbeuten und hoher Rentabilität des gereinigten Zellen zu schlagen. Der wichtigste Schritt bei der Sicherstellung, dass gesunde Zellen gewonnen werden, ist, wie vorherzusehen war, die enzymatische Spaltung des Ausgangsmaterials Gewebe. Die Handhabung des Gewebes sollte besonders schonende, das ist schwer zu beweisen oder zu schätzen, auch in ein audiovisuelles Format. Ein weiterer Schlüsselfaktor ist die Länge des Verfahrens. Je länger es dauert, bis aus dem Spender zum Empfänger Tier gehen, desto geringer die Rentabilität und damit das Anwachsen Effizienz. Sollte es irgendwelche Fragen zu Wirtschaftlichkeit, die nicht sofort, indem man die Häufigkeit der PI positives Ereignis in der gereinigten Zellproben nach der Sortierung beantwortet, empfehlen wir, dass ein Grenzverdünnung Assay clonogenicity Maßnahme 3 durchgeführt wird. Typische Arten aus unbeschädigten Muskel routinemäßig Ertrag etwa 1 in 15-20 Zellen in der Lage zu initiieren myogene oder fibro / adipogenen Kolonien in vitro. Während praktisch 100% der Kolonien von Abgeordneten initiiert differenzierte Myotuben enthalten, enthalten nur etwa ein Drittel der Bienenvölker aus FAPs erhalten Adipozyten neben smooth muscle actin positive Myofibroblasten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Collagenase II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-6885, </td><td> 500 U / ml </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> Roche </td><td> 11088882001 </td><td> 1,5 U / ml </td></tr><tr><td> Displace II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 2,4 U / ml </td></tr><tr><td> Zellsieb </td><td> BD </td><td> 352340 </td><td> 40 mu m </td></tr><tr><td> Tube mit Zellsieb </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 40 mu m </td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2261 </td><td> 2-5 ug / ml </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> Ebiosciences </td><td> 11-0311-85 </td><td> Klon 390 </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td> Hausgemachte </td><td></td><td> Klon I3 / 2 </td></tr><tr><td> SCA1-PECY7 </td><td> Ebiosciences </td><td> 25-5981-82 </td><td> Klon D7 </td></tr><tr><td> α-7-Integrin-APC </td><td> Hausgemachte </td><td> Erkundigen Sie sich bei Rossi Labor </td><td> R2F2 </td></tr></tbody></table>

reinigung von vorläufern aus skelettmuskeln

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skelettmuskulatur enthält mehrere Vorläuferzellen Populationen unterschiedlicher embryonaler Herkunft und Entwicklungspotenzial. Myogenen Vorläuferzellen, in der Regel mit Wohnsitz in einem &quot;Satelliten-Zell-Position&quot; zwischen den myofiber Plasmamembran und der Laminin-rich Basalmembran, dass ensheaths es sind selbst erneuernden Zellen, die sich ausschließlich auf die myogenen Linie 1,2 begangen werden. Wir haben kürzlich eine zweite Klasse des Schiffes verbundenen Vorläuferzellen, die Myofibroblasten und weiße Fettzellen, die durch die effiziente Eingabe Proliferation Schäden reagiert und bietet trophische Unterstützung myogenen Zellen während der Geweberegeneration 3,4 erzeugen kann beschrieben. Eines der am meisten vertraut Assays auf die Entwicklungs-und regenerative Potential einer gegebenen Zellpopulation bestimmen stützt sich auf ihre Isolation und Transplantation 5-7. Zu diesem Zweck haben wir Protokolle für deren Reinigung mittels Durchflusszytometrie aus enzymatisch gespalten Muskeln, die wir in diesem Artikel skizziert werden optimiert. Die Bevölkerung erhält mit dieser Methode enthält entweder myogene oder fibro / adipogenen Kolonie-bildenden Zellen: keine andere Zelltypen sind in der Lage die Expansion in vitro oder in vivo überleben Lieferung. Wenn jedoch diese Populationen unmittelbar nach der Art der molekularen Analyse (zB qRT-PCR) eine im Auge behalten müssen, dass die frisch sortiert Teilmengen können andere Schadstoffe Zellen, die die Fähigkeit zur Bildung von Kolonien oder Pfropfung Empfänger Mangel enthalten, verwendet.

Verfahren zur enzymatischen Dissoziation Oberfläche Kennzeichnung und Reinigung mittels Durchflusszytometrie von fibro / adipogene und myogenen Vorläuferzellen aus murinen Skelettmuskel.

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skelettmuskulatur enthält mehrere Progenitorpopulationen unterschiedlicher embryonaler Herkunft und Entwicklungspotenziale. Myogene Progenitoren, die üblicherweise ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, lebensfähige myogene und adipogene Vorläuferzellen aus spiegelbildlich angeordnetem Skelettmuskel zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zuerst Muskelgewebe von euthanasierten Mäusen entnommen wird. Im zweiten Schritt wird die Probe enzymatisch verdaut, wodurch das Gewebe in Einzelzellen zerlegt wird.Anschließend wird die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder FACS verwendet, um die Vorläuferzellen zu isolieren. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die Vitalität und Differenzierungsfähigkeit der isolierten Zellen nach Transplantation in Empfängermäuse, basierend auf histochemischer Färbung für das genetische Markermolekül, das in diesem Beispiel die humane alkalische Phosphatase ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Verfahren wie PrePL besteht darin, dass die Zellen direkt aus dem Tier zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert werden können.Beispielsweise nach der Induktion von Gewebeschäden, was bedeutet, dass keine Selektion auf der Zellpopulation stattfindet, kann die Zellpopulation auf molekularer Ebene analysiert werden, um die verschiedenen Stadien zu untersuchen, die die Zellen während des Prozesses der In-vivo-Regeneration durchlaufen. Diese Technik kann daher helfen, eine zentrale Frage im Bereich der Geweberegeneration zu beantworten, insbesondere welche Rolle jede Zellart während der In-vivo-Regeneration spielt und wie diese Zelltypen miteinander interagieren, um gesundes Gewebe wieder aufzubauen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie von Erkrankungen wie der Muskeldystrophie.Da die Untersuchung dieser Vorläuferzellen letztendlich regenerative Strategien für diese Art von Erkrankungen ermöglichen kann. Außerdem reichen die Implikationen dieser Technik bis hin zu einer Reihe weiterer Gewebe, von Herz bis Fettgewebe, da zumindest die fibroadipogenen Vorläuferzellen in jedem einzelnen bisher getesteten Gewebe nachgewiesen wurden. In der Regel haben Neulinge bei dieser Technik Schwierigkeiten, da harsche Dissoziationstechniken die Zellviabilität verringern und zu viel Zelltrümmer erzeugen, was anschließend die saubere Trennung der Zellen stören wird.Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir beschlossen, die Flusszytometrie, die üblicherweise für APOE-Zellen verwendet wird, auf die Untersuchung von Stammzellen in festen Geweben anzuwenden. Die visuelle Darstellung dieser Technik ist wichtig, da die Schritte zur Gewebe-Dissociation schwer zu erlernen sind, weil sie sehr schwer angemessen beschrieben werden können. Diese Technik wird heute von Linky, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin in meinem Labor, demonstriert, die die Methode zuerst entwickelte und optimierte. Für dieses Verfahren werden mindestens zwei Mäuse benötigt.Es wird eine Maus für die Zellen zur Verfügungstellung der notwendigen Einzelfarben- und Antikörper-Isotyp-Kontrollen verwendet, und die andere liefert die zu sortierende Probe. Zunächst werden Mäuse im Alter von sieben bis zwölf Wochen beschafft, die zuvor in einer sterilen Laborhaube euthanasiert wurden. Die euthanasierte Maus wird mit der Bauchseite nach oben auf ein steriles Papiertuch gelegt und das Fell gründlich mit 70 %igem Ethanol besprüht, um Kontaminationen zu verhindern, wobei man eine Pinzette in der einen Hand und eine scharfe Schere in der anderen hält.Heben Sie die Haut im Bauchbereich an und führen Sie einen kleinen Längsschnitt durch. Greifen Sie die Haut auf jeder Seite des Schnitts und ziehen Sie sie zurück, um die Muskulatur der Hintergliedmaßen vollständig freizulegen. Entfernen Sie anschließend das Muskelgewebe, indem Sie die geschlossene Schere unterhalb des Muskels und oberhalb der Tibia einführen und dann die Schere öffnen.Die hintere Kante der Klingen wird sanft die Trennung des Muskels von der Tibia bewirken. Wiederholen Sie den Vorgang auf beiden Seiten der Tibia und legen Sie das Gewebe in eine 60 Millimeter große Petrischale. Entfernen Sie nun auf die gleiche Weise das Muskelgewebe vom Femur und geben Sie es der Petrischale hinzu.Wiederholen Sie dies für jede Maus, wobei eine Petrischale pro Maus verwendet wird. Als Nächstes dissoziieren Sie das Gewebe in Einzelzellen. Geben Sie zwei Milliliter oder 1000 Einheiten Kollagenase sowie zwei und 20 Mikroliter einer 250 Millimolar Calciumchlorid-Stammlösung zu jeder Petrischale mit Muskelgewebe hinzu.Dann schnell und sorgfältig vorgehen. Verwenden Sie zwei graue Pinzetten, eine gezahnte und eine mit zwei Zähnen, um das Gewebe in Stücke von einem Kubikmillimeter zu zerkleinern. Entfernen und verwerfen Sie so viel Nicht-Muskelgewebe wie möglich.Bedecken Sie die Petrischalen und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Nach der Inkubation holen Sie die Schalen heraus und bringen Sie zurück in die sterile Laborhaube. Entfernen Sie den Kolben aus einer Dreimilliliter-Spritze und verwenden Sie ihn, um das Gewebe zu zermahlen.Verwenden Sie einen Kolben pro Platte, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Geben Sie etwa fünf Milliliter kalte sterile PBS in jede Petrischale und überführen Sie den Inhalt der Schale in ein 50-Milliliter-Konischglas. Spülen Sie mit weiteren fünf Millilitern PBS nach, um das gesamte Gewebe zu gewinnen, und geben Sie es zum Konischglas hinzu.Die Proben gemäß Protokoll dreimal waschen und zentrifugieren. Danach je einen Milliliter einer Lösung, die aus Kollagenase D dys space zwei und Calciumchlorid besteht, in jedes Röhrchen geben und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Rühren inkubieren. Nach der Inkubation fünf Milliliter kalte sterile PBS zu den Röhrchen hinzufügen, die Röhrchen kurz vortexen und mehrmals pipettieren, um Klumpen aufzulösen.Füllen Sie die Röhrchen mit PBS, mischen Sie gründlich und stellen Sie sie auf Eis. Um verbleibende größere Gewebestücke zu entfernen, stellen Sie einen 40-Mikron-Zellsieb über ein 50-Milliliter-Konischrohr auf Eis und filtrieren Sie die Zellsuspension. Verteilen Sie das Durchflussvolumen gleichmäßig auf drei 50-Milliliter-Konischröhrchen, die mit kaltem, sterilen PBS gefüllt sind, und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 1600 U/min und acht Grad Celsius. Nach der Zentrifugation entfernen Sie vorsichtig das S und stellen die Zellen zur Färbung und Sortierung myogener und adipogener Vorläuferzellen auf Eis.Stellen Sie zuerst die sechs Einfärbungs-Mischkontrollen mit einzelnen Farben gemäß dem beigefügten schriftlichen Protokoll ein. Diese Kontrollen umfassen die ungefärbte Probe, HULK-Färbung, Propidiumiodid, CD31- und CD45-FSE-markierte Antikörper, SC1P7-markierten Antikörper und alpha7A-APC-markierten Antikörper. Richten Sie anschließend die drei Antikörper-Isotyp-Kontrollen-Färbemischungen gemäß dem schriftlichen Protokoll ein.Nachdem die Färbemischungen vorbereitet wurden, beschriften Sie neun 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen für die Einzelfarben- und Isotypkontrollproben. Resuspendieren und kombinieren Sie die Zellen aus den drei kegelförmigen Röhrchen in einem Gesamtvolumen von einem Milliliter Fax-Puffer. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der Zellen in jedes beschriftete Einor-Kontrollröhrchen und pipettieren Sie je nach Konzentration der Antikörper fünf bis 10 Mikroliter der Färbemischungen in die entsprechenden Kontrollröhrchen.Suspendieren Sie die Zellen der Probenmaus in 200 Mikrolitern FACS-Puffer und geben Sie sie in eines der 50-Milliliter-Konischgefäße. Fügen Sie anschließend 800 Mikroliter der Antikörper-Cocktail-Lösung hinzu. Mischen Sie jedes der Kontrollgefäße und Probengefäße. Die Proben eine Stunde lang auf Eis inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen waschen, indem man zu jedem der neun Kontrollröhrchen ein Milliliter Fax-Puffer und zum Probenröhrchen etwa 20 Milliliter Fax-Puffer hinzufügt. Die Kontrollröhrchen fünf Minuten bei 3000 U/min zentrifugieren.Zentrifugieren Sie das Probenröhrchen bei 1600 U/min für fünf Minuten. Danach das Überstandsvolumen nach der Zentrifugation abpipettieren und verwerfen. Resuspendieren Sie die Kontrollzellen in jedem Eppendorf-Röhrchen in einem Milliliter Fax-Puffer und die Probenzellen in vier Millilitern Fax-Puffer.Fügen Sie Propidiumiodid zu den Zellen der Probe, den Isotyp-Kontrollen sowie zur PI-Einzel-Farbkontrollröhre hinzu. Pipettieren Sie die Zellen mithilfe der Zellsieb-Oberfläche in FACS-Röhrchen, um verbleibende Zellklumpen zu entfernen, die den Zytometer beeinträchtigen könnten.Richten Sie das Durchflusszytometrie-Gerät mit einer einzelnen Farbe und Isotyp-Kontrollen ein. Sortieren Sie die Zellenproben gemäß dem beigefügten schriftlichen Protokoll und sammeln Sie jede Population getrennt. Verwenden Sie eine 3,5-Milliliter-Sammelröhrchen. Lebende myogene Vorläuferzellen stellen die Population dar, die Hülken-positiv und Alpha-7-integrin-positiv ist und PI-, CD31-, FE-, CD45- und FE- sowie Ska-negativ ist.Ein PE-Größe-sieben-negatives, lebensfähiges adipogenes Vorläuferzellpopulation wird isoliert und als PE-Größe-sieben-positiv sowie pi-CD31-FE-CD45-FE- und alpha-sieben-a-PC-negativ charakterisiert. Ein einzelner Wildtyp-Maus kann etwa 1 × 10⁵ adipogene Vorläuferzellen und 1,5 bis 2 × 10⁵ myogene Vorläuferzellen mit einer Lebensfähigkeit von über 95 % liefern.Um die Zellen für die Transplantation in Wirtsmäuse vorzubereiten, werden die Zellen gewaschen. Zentrifugieren Sie zunächst deformierte Zellen bei 1500 U/min fünf Minuten lang. Entfernen Sie das Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern PBS und überführen Sie sie in Einmalröhrchen.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 3000 U/min für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie anschließend myogene Vorläuferzellen in PBS oder adipogene Vorläuferzellen in Matrigel bei etwa 10⁶ Zellen pro Milliliter. Nach der Vorbereitung der anästhesierten Wirtsmäuse für jeden Donorzelltyp gemäß dem schriftlichen Protokoll injizieren Sie mithilfe einer 0,3-mL-Insulin-Spritze 20 Mikroliter (ungefähr 20.000 Zellen) myogener oder adipogener Vorläuferzellen.Rechnen Sie mit der geeigneten Zeit für die Differenzierung der transplantierten Zellen, normalerweise etwa drei Wochen. Danach isolieren Sie das Zielgewebe und bereiten es wie in dem Protokoll beschrieben für die Kryoschnitte vor. In dieser Abbildung wird die Sortierstrategie zur Isolierung der adipogenen und myogenen Vorläuferzellen dargestellt. Lebende Zellen wurden anhand des Vorwärtsstreulichts und des Seitenstreulichts identifiziert. Die Hoechst-Färbung wurde verwendet, um nuklearen Zerfall auszuschließen, und die Propidiumiodid- oder PI-Färbung diente dem Ausschluss toter Zellen. Hämatopoetische und endotheliale Zellen, also jeweils CD 45- und CD 31-positive Zellen, wurden anschließend aus den Sortiertoren ausgeschlossen. Schließlich wurde der Teilpopulation, die alpha sieben positiv ist, isoliert.SKA1-negativ enthält alle myogenen Vorläuferzellen und die Population, die für Alpha-7-negativ ist. SKA1-positiv enthält alle adipogenen Vorläuferzellen. Fluoreszenz-minus-eins-Isoform-Kontrollen bestätigen die Spezifität der Färbung. Zusätzlich wurden Reinheitskontrollen der adipogenen und myogenen Teilpopulationen durchgeführt.Nach der Sortierung in diesem repräsentativen Beispiel können adipogene Vorläufer-Zellspender, die transgenes, humanes alkalines Phosphatase exprimieren und subkutan injiziert wurden, durch Histochemie im Wirtsgewebe anhand der braunen Färbung identifiziert werden. Myogene Vorläufer-Zellspender, die transgenes humanes alkalines Phosphatase exprimieren und intramuskulär injiziert wurden, wurden in diesem Gewebeschnitt wie durch Braunfärbung gezeigt, nachgewiesen.Mithilfe der Histochemie lässt sich diese Technik, einmal beherrscht, in fünf Stunden durchführen, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei einer größeren Anzahl von Proben verlängert sich die Dauer. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, schnell und schonend zu arbeiten.Daher sollte vermieden werden, zu viele Proben gleichzeitig zu bearbeiten. Eine Verlängerung der Bearbeitungszeit verringert die Zellvariabilität nach diesem Verfahren erheblich. Andere Methoden wie die Analyse der colono SC OG-Expressions mittels quantitativer RT-PCR können ebenfalls durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie reagieren diese Progenitorzellen nach ihrer Entwicklung auf Schäden in vivo?Diese Technik ebnete anderen Forschern auf dem Gebiet der Geweberegeneration den Weg, um die Wechselwirkungen zwischen den Stammzellen in geschädigtem Gewebe zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diese Gewebe schonend dissoziiert. Die Vorläuferzellen identifizieren die Vorläuferzellen anhand ihrer Oberflächenmarker und analysieren ihr Entwicklungspotential in vivo.Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Isolierung und Kultur einer reinen Population von ruhenden Satellitenzellen, eine Muskelstammzellpopulation, ist wesentlich für das Verständnis der Muskelstammzelle Biologie und Regeneration sowie Stammzelltransplantation bei Therapien Muskeldystrophie und anderen degenerativen Erkrankungen.

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Blutgefäße innerhalb der menschlichen Skelettmuskulatur Hafen mehrere Multi-Linie Vorläuferpopulationen, die sich ideal für die regenerative Anwendungen sind. Dieses Isolierungsverfahren ermöglicht die gleichzeitige Reinigung von drei multiVorläuferZellPopulationen jeweils drei Strukturschichten der Blutgefäße: myogenen Endothelzellen aus Intima, Perizyten von Medien und Adventitia-Zellen von Adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Hier ein Protokoll, das auf epigenetische Reprogrammierung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in Richtung Erzeugung eines homogenen Bevölkerung von Skelettmuskelvorläuferzellen, die unter permissiven Kulturbedingungen bilden dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres), die biologischen Merkmale der menschlichen rekapitulieren beschreiben wir Skelettmuskeln.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

In-vitro-Kultur haben Systeme unerlässlich, um unser Verständnis von Wirbel myogenesis bewährt. Allerdings bleibt noch viel zu über Nicht-Säuger-Skelettmuskel-Entwicklung und das Wachstum gelernt werden, vor allem in den basalen Taxa. Eine effiziente und robuste Protokoll für die Isolierung der adulten Stammzellen aus diesem Gewebe, die myogene Vorläuferzellen (MPCs) und Erhaltung ihrer Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung in einer Primärkultur Einstellung ermöglicht die...

Herstellung von primären Myogenic Vorläuferzelle / Myoblastenkulturen von Basal Wirbelstammbaum

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste, reproduzierbare und einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung von Myoblasten Vorläuferzellen aus dem Skelettmuskel von Erwachsenen und alten Menschen. Die Muskeln hier sind Fuß- und Beinmuskeln. Dieser Ansatz ermöglicht die Isolierung einer angereicherten Population von primären Myoblasten für funktionelle Studien.

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Hier beschreiben wir eine Methodik, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus erwachsenem Muskelgewebe zu erhalten. Diese Zellen werden verwendet, um die In-vitro- Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen und insbesondere Proteine ​​zu untersuchen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind.

Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

Wir präsentieren Techniken zur Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsiegewebe gewonnen werden.  hMPCs, die durch diese Methoden gewonnen und charakterisiert werden, können anschließend verwendet werden, um Forschungsfragen im Zusammenhang mit menschlicher Myogenese und Skelettmuskelregeneration zu behandeln.

Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

Die genaue Identifizierung von fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) und Muskelstammzellen (MuSCs) ist entscheidend für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Isolierung, Reinigung und Kultur von FAPs und MuSCs aus erwachsenen Mausmuskeln.

FACS-Isolierung und Kultur von fibro-adipogene Vorläuferzellen und Muskelstammzellen aus ungestörten und verletzten Maus-Skelettmuskeln

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Muskelstammzellen und fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus einzelnen Skelettmuskeln bei Mäusen. Das Protokoll umfasst die Dissektion einzelner Muskeln, die Isolierung von Stammzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, die Reinheitsbewertung durch Immunfluoreszenzfärbung und die quantitative Messung des S-Phaseneintritts mittels 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin-Inkorporationsassay.

Isolierung ruhender Stammzellpopulationen aus einzelnen Skelettmuskeln

Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Isolierung und Anreicherung primärer Myoblasten aus adulten und neonatalen Mausskelettmuskeln durch Gewebedissoziation, sequentielle Filtration, Präplattierung und definierte Kulturbedingungen, wodurch die Etablierung und Pflege von satellitenzellbasierten Myoblastkulturen für nachgelagerte experimentelle Anwendungen ermöglicht wird.

Isolierung von Skelettmuskel-Satellitenzellen für In-vitro-Myogenese-Studien

Lernen Sie die Isolierung myogener und adipogener Vorläuferzellen aus murinem Skelettmuskel mittels enzymatischer Dissoziation und FACS. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zellviabilität und Differenzierung in vivo.

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

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