RNAi-Interferenz durch dsRNA Injektion in Drosophila Embryos

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression endogener Gene durch Injektion doppeltsträngiger RNA in Drosophila-Embryonen zu verringern, um Gene zu identifizieren, die für die Organentwicklung erforderlich sind. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen gesammelt und in einer geraden Linie ausgerichtet werden. Anschließend werden Nadeln vorbereitet und verwendet, um doppeltsträngige RNA in die Embryonen zu injizieren.

Schließlich werden die Embryonen zur Entwicklung in eine feuchte Kammer gegeben. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Defekte in der Fusion drosophila Trachealäste durch Antikörperfärbung von späten Embryonalstadien zeigen, oder durch Beobachtung der Larven unter einem Hellfeldmikroskop. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie einem klassischen genetischen Screen zur Identifizierung von Genen, die für die Organentwicklung benötigt werden, liegt darin, dass es sich hier um einen vergleichsweise einfachen und schnellen Ansatz der Reverse Genetik handelt, um Genfunktionen zu analysieren, bevor ein Mutant für dieses Gen verfügbar ist.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung kritischer Gene, die für die Entwicklung des D-Trachealsystems erforderlich sind. Es handelt sich um ein hervorragendes Modell, um die Morphogenese von Säugetierorganen wie den Wirbeltier-Atemwegen, dem Kreislaufsystem, Nierenkanälen und erforschenden Epithelien zu untersuchen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es Zeit braucht, um Techniken wie das Ausrichten von Embryonen, das Brechen von Nadeln und das Injizieren von strukturierten RNA in die Embryonen zu erlernen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Menge an injizierter doppelsträngiger RNA zwischen Embryonen variiert und eine schriftliche Beschreibung, wie syncytiale Blasto-derm-Embryonen aussehen, schwierig sein kann. Diese Schritte sind schwer zu erlernen, da das Injizieren geeigneter Mengen doppelsträngiger RNA in syncytiale Blasto-Embryonen ein so kritischer Schritt ist, um die Expression endogener Gene wirksam zu reduzieren.

Zur Vorbereitung Käfige bei 25 Grad Celsius einrichten und zwei bis vier Tage alte W 1 1 1 8-Fliegen verwenden; die Traubensaftplatten während des Tages stündlich wechseln, um die Eiersammlung über einen Zeitraum von ein bis zwei Tagen zu synchronisieren. Vor der Sammlung Syn-embryos oder Blaster-Derm-Embryos eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius sammeln; anschließend ein rechteckiges Stück Traubensaft-Agar nehmen und mit der Rasierklinge leicht eine Linie in der Mitte des Agars einritzen.

Verwenden Sie eine Metallsonde, um Embryonen von der Traubensaftplatte auf das Stück Traubensaft-Agar zu übertragen. Richten Sie etwa 50 Embryonen in einer geraden Linie in der Mitte des Agars aus, wobei die längeren Achsen der Embryonen einen 45-Grad-Winkel zur Linie bilden. Stellen Sie sicher, dass alle Embryonen mit ihren hinteren Enden in dieselbe Richtung zeigen und von der Linie weg weisen.

Schneiden Sie ein rechteckiges Stück doppelseitiges Klebeband aus und befestigen Sie es auf einem 18 mal 18 Millimeter großen Deckglas. Heben Sie die Embryonen mit dem Klebeband auf dem Deckglas auf. Legen Sie das Deckglas auf einen Objektträger.

Drücken Sie die Embryonen leicht auf das doppelseitige Klebeband und lassen Sie sie etwa 10 Minuten lang an der Luft trocknen. Bedecken Sie die Embryonen mit einer dünnen Schicht 700-Halokohlenwasserstofföl. Warten Sie etwa 10 Minuten, bis die Embryonen unter dem Mikroskop klar erscheinen.

Nadeln werden für die Mikroinjektion hergestellt, indem Glas-Kapillarrohre gezogen werden. Wir verwenden einen Nadelzieher von World Precision Instruments mit den Programmeinstellungen: Heat one, delay four, back.

Füllen Sie die Nadel mit zwei Mikrolitern doppelsträngiger RNA unter Verwendung einer Einor P 20-Pipette mit Einor-Mikrolader-Spitzen. Bereiten Sie einen Objektträger mit einem sauberen Deckglas darauf vor und befestigen Sie beide mit Klebeband. Führen Sie die gefüllte Nadel an die Kante des Deckglases heran, um eine scharfe Spitze zu erzeugen.

Doppelsträngige RNA tritt aus der Nadelspitze aus. Wenn das Fußpedal der Pico-Pumpe betätigt wird, bereiten Sie einen Objektträger mit einem Tropfen Öl in der Mitte vor. Führen Sie die Nadel in den Öltropfen ein.

Stellen Sie die Einstellung der Piko-Pumpe so ein, dass beim Betätigen des Fußpedals 100 bis 200 Pikoliter doppelsträngige RNA ausgestoßen werden. Doppelsträngige RNA ist als kleiner Tropfen sichtbar.

Die Nadelspitze am hinteren Teil des ersten Embryos drückt das Fußpedal der Pico-Pumpe. Doppelsträngige RNA erscheint als ein kleiner Tropfen an der Injektionsstelle.

Schließen Sie die Injektion von doppelsträngiger RNA in die Embryonen auf dem Objektträger ab. Töten Sie alle Embryonen, die nicht vom Typ Blaster Derm sind. Legen Sie den Deckglaser in eine befeuchtete Kammer mit Deckel, beispielsweise eine Plastik-Petri-Schale, bei 18 Grad Celsius, bis die Embryonen das gewünschte embryonale oder larvale Stadium erreicht haben.

Für Embryonen, die das gewünschte embryonale Entwicklungsstadium erreicht haben, verwenden Sie eine Sonde, um die Embryonen vom doppelseitigen Klebeband zu lösen, und schieben Sie sie an den Rand der Deckglasplatte. Spülen Sie die Embryonen mit Heptan in ein Sammelgefäß mit Nylongewebe am Boden. Waschen Sie die Embryonen dreimal mit PBS, jeweils fünf Minuten in 50 % Bleiche, und waschen Sie die Embryonen anschließend erneut dreimal mit PBT.

Überführen Sie die Embryonen mit einer Pipette aus dem Sammelgefäß auf ein Stück Nylonnetz und tauchen Sie das Stück Nylonnetz in die Fixierungslösung ein. Fixieren Sie die Embryonen 30 Minuten lang. Entfernen Sie die untere Schicht der Fixierungslösung.

Dann fixieren Sie die Embryonen mit Methanol, überführen Sie sie in ein Eppendorf-Röhrchen und führen Sie eine Immunfärbung mit den Antikörpern A 12 und Diffusionsantikörpern durch, unter Verwendung standardmäßiger Antikörper-Färbeprotokolle für Embryonen, die bis zum gewünschten Larvenstadium entwickelt wurden. Bereiten Sie einen Objektträger mit einem Tropfen Halokohlenstofföl 700 in der Mitte und zwei kleinen Deckgläsern auf jeder Seite des Öltropfens vor. Überführen Sie eine Larve auf den Objektträger und legen Sie anschließend ein Deckglas auf den Öltropfen.

Beobachten Sie die Larven unter einem Hellfeldmikroskop. Dargestellt sind repräsentative Ergebnisse sowohl der diffusionsbasierten doppelsträngigen RNA- als auch der GFP-doppelsträngigen RNA-Injektion.

Zweisträngige GFP-RNA-injizierte Embryonen zeigen eine normale Tracheenfusion, und das Diffusionsprotein ist in den Fusionzellen vorhanden. Die Pfeile zeigen auf laterale, diffusionspositive Fusionzellen im Hauptstamm, und der Stern zeigt die Position der normalen Fusion an.

Jedoch zeigen Embryonen mit injizierter doppelsträngiger RNA eine fehlgeschlagene Verzweigungsfusion, und Diffusionsproteine sind in den Fusionszellen nicht vorhanden. Das Dreieck markiert die Stelle der fehlgeschlagenen Verzweigungsfusion, wenn Embryonen mit injizierter doppelsträngiger RNA bis zum Larvenstadium entwickelt sind. Die G-F-P-R-N AI-Larven zeigen eine normale tracheale Verzweigungsfusion, wie durch einen Stern markiert.

Andererseits zeigten die Diffusions-RN-A-Larven eine fehlgeschlagene Verzweigungsverschmelzung, wie durch Dreiecke angegeben. Diese Ergebnisse zeigen die Wirkung der Herabregulierung der endogenen Diffusions-Genexpression durch Injektion von doppelsträngiger RNA in Drosophila-Embryonen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alle Enseal-Blaster-Embryonen nach ihrer Entwicklung zu töten.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Entwicklungsbiologie, die Funktion neuartiger Gene für die Organentwicklung bei Drosophila zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie endogene Gene durch die Injektion von doppelsträngiger RNA in Drosophila-Embryonen herunterreguliert werden können.