Name: Lokalisieren von Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: Ein Hybrid Visualisierung Methodology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Immunfärbung postnataler hippocampaler Neuralvorläuferzellen in 3D-Neurosphären. Diese Methode ermöglicht die dreidimensionale Proteinlokalisierung und räumliche Rekonstruktion für die Neurowissenschaft.

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Wir danken Evan Dysart und Marc Léonard für technische Unterstützung durch Experten in der Videoproduktion und-bearbeitung, Matt Cooke für die Unterstützung bei der Datenerhebung und Sarah Gelbard für Experten redaktionelle Unterstützung. Die Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse von der Canadian Institute of Health Research (CIHR, MOP 62626) zu SALB, eine strategische Training Initiative in Health Research Programm zu gewähren SALB und SF (CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics, TGF 9121), und die Infrastruktur finanziert Unterstützung von der kanadischen Stiftung Innovation und Ontario Innovation Trust SF. SI erhielt Ontario Graduate Scholarship in Wissenschaft und Technologie mit Beiträgen der Parkinson Research Consortium. NV erhält Institute of Aging und CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics post-professionellen Gemeinschaft. Wir danken für die Bildungs-Software und technischen Support durch Autodesk Forschung zur Verfügung gestellt.

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurospheres%3A+insights+into+neural+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li>
<li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li>
</ol>

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Ottawa Animal Care Committee und der Canadian Council on Animal Care Set durchgeführt.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Kultur und seriell Gefrier postnatalen Hippocampus NPCs, lokalisieren Proteinexpression durch Immunodetektion und schließlich zu rekonstruieren und zu analysieren, die topographische Lage der immunpositive Zellen innerhalb des gesamten 3D-Neurosphäre. Durch die Kombination zellbiologischer Kultur-und Verarbeitungstechniken, Mikroskopie (OpenLab, Improvisation und andere Bildanalyse Software), Grafik-Editing-Software-Kapazitäten (Adobe Photoshop) und 3D-Animation und Compositing-Software-Kapazitäten (Autodesk Maya), präsentieren wir eine Methode zur Rekonstruktion gesamte zelluläre Zusammensetzung von 3D-Kulturen aus serielles 2D-Bilder ermöglicht die originalgetreue Rekonstruktion der zellulären Position und Protein-Expression während einer Neurosphäre Kultur. Dieses Protokoll kann mit der gleichen Effektivität, um die Registrierung und die Rekonstruktion der epifluoreszenten dünne Schnittserien oder konfokalen Z-Stapel durch dickere Schnittserien kombiniert werden. Da klonale Expansion einzelner NPCs in Neurosphäre Kultur rekapituliert viele der Stufen im Laufe der Neurogenese und Gliogenese in postnatalen Gehirn beobachtet, stellt die Auswirkungen seiner 3D-Struktur ein wichtiger NPC Schicksal bestimmend in Nachkommen ausgesetzt, um die gleichen experimentellen Milieu 1. Divergenz in Linie und Protein-Expression im Kern und Peripherie von seriellen Neurosphäre Abschnitte darauf hin, dass mehrere physische Faktoren wie Zell Lage, mechanische Belastung und Querkraft spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der NPC Biologie 2. Darüber hinaus hat Connexin-Protein-Expression, hier analysierten, wurde gezeigt, dass sich je nachdem, wann NPCs sind als 3D-Neurosphären in Suspension oder vergoldet auf Laminin Substrat mit funktionellen Connexin-vermittelter Kommunikation verändert, ob die Zellen auf Kunststoff-und Substrat oder in 3D-frei sind kultivierte kultivierten -schwimmende Kulturen 3. Die Auswirkungen der zellulären Position auf NPC Schicksal bleibt unklar. Es ist technisch anspruchsvoll, um Auswirkungen der räumlichen Lage innerhalb 3D-Kultur zu analysieren auf NPC Biologie gegeben, dass antigenen Beurteilung der Abstammung und Signalproteine ​​Störung der 3D-Architektur zu Zellpermeabilisierung und Antikörper-Zugriff auf alle Zellen zu aktivieren muss. Hier zeigen wir, dass ein Hybrid-Visualisierung Methodik ein Mittel zur Bestimmung, ob bestimmte Proteine ​​einzigartigen Positions-Lokalisierungen Ausstellung in 3D-Kultur bietet, kann man folgern, und testen Protein Funktion und Regulation im Hinblick auf regionale Lokalisation innerhalb der Neurosphäre werden, und, was vielleicht am wichtigsten , bietet die Positionsdaten benötigt, um die Auswirkungen der 3D-Topographie und zellulären Positionierung auf NPC Schicksal in 3D-Kultur zu studieren.

* Alle anderen Standard-chemischen Reagenzien im Protokoll aufgelistet sind von Sigma-Aldrich. Alle anderen Standard-Zellkultur-Reagenzien sind von Invitrogen.

lokalisieren von protein in 3d neural stem cell culture: ein hybrid visualisierung methodology

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Die Bedeutung der 3-dimensional (3D) Topographie beeinflussen neuralen Stamm-und Progenitorzellen (NPC)-Phänotyp ist allgemein anerkannt, aber schwierig zu studieren. Wenn losgelöst von embryonalen oder postnatale Gehirn, werden einzelne NPCs in Suspension vermehren zu Neurosphären bilden. Tochterzellen innerhalb dieser Kulturen spontan annehmen deutliche Entwicklungsstörungen Linien (Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten) im Laufe der Expansion trotz der gleichen extrazellulären Milieu ausgesetzt. Diese Entwicklung rekapituliert viele der Stadien beobachtet im Laufe der Neurogenese und Gliogenese in postnatalen Gehirn und wird häufig verwendet, um grundlegende NPC Biologie in einer kontrollierten Umgebung zu studieren. Die Beurteilung der vollen Auswirkungen der 3D-Topographie und zellulären Positionierung innerhalb dieser Kulturen auf NPC Schicksal ist jedoch schwierig. Zur Lokalisierung von Target-Proteinen und identifizieren NPC Linien Immunzytochemie, muss frei schwebenden Neurosphären auf einem Substrat beschichtet werden oder seriell geschnitten. Diese Verarbeitung ist erforderlich, um gleichwertige Zellpermeabilisierung und Antikörper-Zugang im gesamten Gebiet zu gewährleisten. Als Ergebnis können 2D epifluoreszenten Bilder von Gefrierschnitten oder konfokale 3D-Rekonstruktionen von Z-Stapeln nur stellen räumliche Informationen über Zell-Position innerhalb diskreten physischen oder digitalen 3D-Scheiben und nicht visualisieren zelluläre Position im intakten Bereich. Hier, in der die Topographie des Neurosphäre Kultur bekräftigen und erlauben räumliche Analyse der Proteinexpression in der gesamten Kultur präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung, Expansion und serielle Schnitte von postnatalen Hippocampus Neurosphären für epifluoreszenten oder konfokalen Immundetektion der Zielproteine. Connexin29 (Cx29) wird als Beispiel analysiert. Anschließend mit einem Hybrid aus Grafik-Bearbeitung und 3D-Modellierung Software rigoros angewendet, um biologische Detail zu halten, beschreiben wir, wie der Zusammenbau des 3D strukturelle Positionierung der Bilder und digital map markierten Zellen innerhalb der gesamten Neurosphäre. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung und Analyse der zellulären Position von Target-Proteinen und Zellen über die gesamte 3D-Topographie und Kultur wird eine detailliertere Analyse der räumlichen Beziehungen zwischen den Zellen im Laufe der Neurogenese und Gliogenese in vitro zu erleichtern. Beide Imbeault und Valenzuela gleichermaßen beigetragen und sollte als gemeinsame Erstautoren werden.

Hier beschreiben wir, wie zu produzieren, zu erweitern und immunolabel postnatalen Hippocampus neuronale Vorläuferzellen (NPCs) im dreidimensionalen (3D-) Kultur. Als nächstes mit Hybrid-Visualisierungs-Technologien, demonstrieren wir, wie digitale Bilder von immunolabelled Kryoschnitten verwendet werden, um zu rekonstruieren und Karte der räumlichen Lage der immunpositive Zellen über die gesamte 3D-Neurosphäre werden.

Lokalisieren von Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: Ein Hybrid Visualisierung Methodology

Die Bedeutung der dreidimensionalen (3D) Topographie bei der Beeinflussung des Phänotyps von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen (NPC) ist weithin anerkannt, jedoch schwierig zu ...

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Research

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir die Verwendung eines sich selbst organisierenden 3-dimensionalen Gerüst zur Kultur humaner neuraler Vorläuferzellen. Wir präsentieren ein Protokoll, um die Zellen aus dem Gerüste Freisetzung analysiert anschließend zB mittels Durchflusszytometrie werden. Dieses Protokoll kann zu anderen Zelltypen angepasst werden, um detaillierte mechanistisch Studien durchzuführen.

Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

Dieses Video zeigt die Entwicklung und Differenzierung menschlicher neuronaler Stammzellen innerhalb eines dreidimensionalen Gerüsts. Eine Lamininbeschichtung auf dem Gerüst fördert die Zelladhäsion, während ein wachstumsfaktorfreies neuronales Medium die Zelldifferenzierung in neurale Vorläuferzellen induziert, die ihre Prozesse innerhalb einer porösen Architektur in mehrere Richtungen ausdehnen und eine dreidimensionale Kultur...

Differenzierung menschlicher neuronaler Stammzellen in 3D-Kultur mit Hilfe eines porösen Gerüsts

Quelle: Gómez-Villafuertes, R., et. Al., Live-Bildgebung mit anschließender Einzelzellverfolgung zur Überwachung der Zellbiologie und des Verlaufs der Abstammungslinie mehrerer neuronaler Populationen. J. Vis. Exp. (2017) Die Das Video zeigt den Prozess der Vorbereitung, Bildgebung und Verfolgung adulter neuronaler Stammzellen in Echtzeit, um zelluläres Verhalten, einschließlich Teilung und Differenzierung, zu untersuchen.

 Live-Bildgebung und Einzelzell-Tracking zur Überwachung der neuronalen Abstammung in adulten neuralen Stammzellen

Neuronale Stammzellen aus dem erwachsenen Gehirn geerntet steigen in Anwendungen, die von der Grundlagenforschung der Entwicklung des Nervensystems zu erforschen mögliche klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin eingesetzt. Dies macht eine strenge Kontrolle bei der Isolierung und Kultivierungsbedingungen verwendet werden, um diese Zellen entscheidend für experimentelle Ergebnisse klingen wachsen.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Mit der Absicht, Veränderungen in miRNAs auf differenzierten humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) zu charakterisieren, beschreiben wir die hNSC-Differenzierung auf einem dreidimensionalen System, die Bewertung von Veränderungen in der microRNA-Expression durch miRNA-PCR-Arrays und computergestützte Analysen zur Vorhersage von miRNA-Zielen und deren Validierung durch duale Luciferase-Assays.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Live Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur zelluläre Verhaltensweisen in Echtzeit zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Time-Lapse Video-Mikroskopie des primären Hirnrinde Zellen, die eine detaillierte Untersuchung der Phasen verordnet während der Linie Weiterentwicklung von primäre neurale Stammzellen zu differenzierten Neuronen und Glia ermöglichen.

Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

Die beschriebene Pipeline ist für die Segmentierung von Elektronenmikroskopie-Datensätzen größer als Gigabyte konzipiert, um Ganzzellmorphologien zu extrahieren. Sobald die Zellen in 3D rekonstruiert sind, kann kundenspezifische Software, die auf individuelle Bedürfnisse zugeschnitten ist, verwendet werden, um eine qualitative und quantitative Analyse direkt in 3D durchzuführen, auch mit virtueller Realität, um Die Sichtokklusion zu überwinden.

Eine Methode zur 3D-Rekonstruktion und Virtual Reality-Analyse von Glia- und Neuronalzellen

Die hier vorgestellte Methode verwendet Mikromuster ungemilzt mit quantitativer Bildgebung, um die räumliche Organisation innerhalb von Säugetierkulturen aufzuzeigen. Die Technik ist in einem Standardlabor für Zellbiologie leicht zu etablieren und bietet ein beschreibbares System zur Untersuchung von Mustern in vitro.

Kartierung der Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells mit Mikromustern und quantitativer Bildgebung

Hier präsentieren wir einen einfach zu bedienenden Co-Kultur-Assay zur Analyse der Glioblastom-Migration (GBM) an gemusterten Neuronen. Wir entwickelten ein Makro in der FiJi-Software zur einfachen Quantifizierung der GBM-Zellmigration auf Neuronen und beobachteten, dass Neuronen die invasive Kapazität von GBM-Zellen modifizieren.

Co-Kultur von Glioblastom-Stammzellen auf gemusterten Neuronen zur Untersuchung von Migration und zellulären Interaktionen

Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Erzeugung und Charakterisierung von 2D- und 3D-Modellen für humane induzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC) der neokortikalen Entwicklung sowie ergänzende Methoden, die eine qualitative und quantitative Analyse der primären Cilium (PC) -Biogenese und -Funktion ermöglichen.

2D- und 3D-humaninduzierte pluripotente Stammzell-basierte Modelle zur Sezierung der primären Ciliumbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung

Erfahren Sie die Isolierung und Immunfärbung postnataler hippocampaler Neuralvorläuferzellen in 3D-Neurosphären. Diese Methode ermöglicht die dreidimensionale Proteinlokalisierung und räumliche Rekonstruktion für die Neurowissenschaft.

Lokalisieren von Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: Ein Hybrid Visualisierung Methodology

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