Lokalisieren von Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: Ein Hybrid Visualisierung Methodology

Wenn sie in Suspension kultiviert werden, proliferieren aus neurogenen Nischen des Gehirns isolierte neuronale Vorläuferzellen und bilden Neuro­sphären. Hier zeigen wir die Isolierung und serielle Schnittführung von frei schwebenden, aus dem postnatalen Hippocampus stammenden Neuro­sphären, um die Proteinausprägung innerhalb der dreidimensionalen Neuro­sphäre zu lokalisieren. Wir führen eine Immunfärbung für ein Protein der Wahl – in diesem Fall Connexin 29 – durch, gefolgt von der Zusammensetzung und Umwandlung zweidimensionaler Mikroskopiebilder in eine dreidimensionale Rekonstruktion der Neuro­sphäre.

Die Visualisierung von Proteinen im Kontext ihrer nativen dreidimensionalen Strukturen, wie beispielsweise einer frei schwebenden Neurophäre oder eines Gewebes, ermöglicht ein besseres Verständnis der Proteinfunktion basierend auf deren Lokalisation innerhalb dieser Strukturen und erlaubt zudem Rückschlüsse auf mögliche Funktionen von Proteinen mit bekannter Lokalisation, deren Funktion jedoch unbekannt ist. Hallo, ich bin Sophia Ambo vom Neural Regeneration Laboratory an der University of Ottawa. Und ich bin Nicholas Valenzuela vom Carlton Immersive Media Studio an der Carleton University in Ottawa.

Heute werden wir demonstrieren, wie man aus dem Hippocampus stammende postnatale neuronale Vorläuferzellen als Neuro­sphären isoliert, vergrößert und seriell schnittet. Um die Lokalisation der Proteinexpression mittels Immunfärbung zu bestimmen, verwenden wir anschließend zweidimensionale Bilder der seriellen Schnitte von Neuro­sphären, die nach der Immunfärbung gewonnen wurden, um eine Methode zur Rekonstruktion der zellulären und proteinmolekularen Position in der dreidimensionalen Struktur darzustellen und so die räumliche Organisation der Proteinexpression innerhalb der Neuro­sphären zu beurteilen. Beginnen wir also.

Nachdem die Gehirne gesammelt wurden, bereiten Sie sie vor, indem Sie eine ebene Fläche schaffen, auf der die Gehirne ordnungsgemäß aufliegen können, um sie auf den Spannfutter zu platzieren. Dieser Vorgang wird Blockierung genannt. Blockieren Sie das Kleinhirn mit einer Rasierklinge und einer Pinzette.

Danach einen Tropfen Sekundenkleber auf den Spannfutterträger geben und das erste Gehirn darauf befestigen, wobei die vordere Seite nach oben und die dorsale Seite zu Ihnen weist. Fahren Sie auf dieselbe Weise mit den übrigen Gehirnen fort; bei dem letzten Gehirn ist es ratsam, die dorsale Seite von sich weg zu richten, da der Schnitt in dieser Richtung manchmal unvollständig ist. Sollte ein unvollständiger Schnitt auftreten, schneiden Sie mit einem Skalpell nach und sammeln Sie den Schnittabschnitt ein.

Die Geschwindigkeit ist entscheidend für den Klebeschritt, da die Gehirne nicht zu lange Luft ausgesetzt sein dürfen. Sobald alle Gehirne angeklebt sind, wird der Spanner in das Vibroschneidemikrotom eingelegt und der Halter mit eiskalter aCSF gefüllt.

Stellen Sie den Vibratome auf eine Frequenz von 8,5 und eine Geschwindigkeit von 3,5 bis 4,5 ein. Bringen Sie die Klinge mit dem A CSF in Kontakt und stellen Sie den automatischen Schnitt ein. Nun schneiden wir 500-Mikrometer-Schnitte.

Behalten Sie die Schnitte, die den Hippocampus enthalten. Legen Sie sie in eine Schale mit eiskaltem ACSF und entsorgen Sie die übrigen Schnitte. Sobald alle Schnitte gesammelt sind, fahren Sie mit der Hippocampus-Dissektion fort.

Unter Verwendung eines Stereomikroskops entnehmen wir ausschließlich das dorsale Hippocampusgebiet, ungefähr zwischen bregma minus 1,65 Millimetern und minus 2,10 Millimetern. Legen Sie die Hippocampi in eine leere, eiskalte Schale. Sobald alle Hippocampi aus den Schnitten gesammelt wurden, ist es Zeit, sie in die Flusshaube zur mechanischen Dissoziation zu bringen.

Unter Verwendung eines Skalpells sprühen Sie 70 %igen Ethanol auf die Skalpellklinge und flammen sie zur Sterilisation ab. Schneiden Sie das Gewebe mit dem Skalpell, bis es flüssig erscheint. Sammeln Sie nun das Gewebe unter Verwendung eines Dissoziationsmediums, das bereits Pepain-DNAsen und neurale Proteasen enthält, per Pipettierung und geben Sie es in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Bei der enzymatischen Dissoziation wird das Röhrchen in einen rotierenden Ofen bei 37 Grad gestellt und 45 Minuten bis eine Stunde lang verdaut. Nach Abschluss der Verdauung werden 10 Milliliter sterile PBS für die Gewebekultur hinzugefügt, um die enzymatische Reaktion zu stoppen, und die Zellen werden fünf Minuten lang mit 300 × g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Pellet resuspendiert.

In fünf Millilitern PBS verwenden Sie eine Pasteurpipette und pipettieren Sie die Probe, um das Gewebe weiter zu dissoziieren. Fahren Sie mit dem Pipettieren fort, bis die Gewebestücke nicht mehr kleiner werden. Pelletieren Sie die Zellen an diesem Punkt erneut.

Entfernen Sie das PBS und resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter Wartungsmedium. Nachdem Sie die Probe gut trituriert haben, entnehmen Sie ein 15-Mikroliter-Aliquot und mischen es mit einem gleichen Volumen von Trypanblau.

Entnehmen Sie zwei 10-Mikroliter-Proben und geben Sie sie in ein Hämozytometer zur Zellzählung. Zählen Sie die Zellen aus drei Feldern in jedem Abschnitt, insgesamt sechs Felder. Mitteln Sie die Zahlen, um Ihre Zelldichte zu berechnen.

Beachten Sie, dass die Probe verdünnt ist. In der Trypanblau-Platte die Zellen in Nicht-Adhärenz-Schalen mit einer Dichte von 2,5 × 10⁵ Zellen pro Schale in einem Endvolumen von 5 mL Pflegemedium ansäen. Falls Nicht-Adhärenz-Schalen nicht verfügbar sind, können Sie Petrischalen verwenden.

In diesem Fall müssen Sie die Neurosphären jeden Tag morgens und nachmittags während der ersten sechs Tage vorsichtig anstoßen, damit die Neurosphären nicht am Boden der Petrischale haften. Geben Sie EG, F und FGF vor dem Stellen der Schalen in den Inkubator hinzu. Diese Wachstumsfaktoren müssen alle zwei Tage für die gesamte Kulturdauer erneuert werden. Am 14. Tag in vitro fixieren Sie die Neurosphären mit Formaldehyd auf eine Endkonzentration von etwa 4 %, indem Sie es direkt der Kultur zusetzen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für fünf Minuten unter Schütteln. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und resuspendieren Sie sie in einer 15 bis 20 %igen Saccharoslösung, die in 10 mmolar Phosphatpuffer hergestellt wurde. Lassen Sie die Probe zur Kryoschutzung bei vier Grad mindestens 24 Stunden stehen, bevor Sie sie am Kryostaten schneiden.

Entfernen Sie die kryoprotectierten Neurosphären aus dem Kühlschrank und legen Sie sie in eine 60-Millimeter-Schale. Für die serielle Schnittführung, bei der das Sammeln jedes einzelnen Schnitts entscheidend ist, empfiehlt es sich, mithilfe eines Stereomikroskops Neurosphären von geeigneter Größe und Form auszuwählen und mit einer Pipette eine Neurosphäre in eine Kryoschneidform zu geben, die mit OCT-Compound gefüllt ist. Markieren Sie die Stelle, an der sich die Neurosphäre in der Kryoschneidform befindet.

Dieser Schritt erleichtert das Auffinden der Neurosphäre während des Schneidens. Sobald fünf bis 10 Sphären rasch in die Form gegeben wurden, frieren Sie diese mit CO2 ein. Markieren Sie mithilfe der Hinweise auf der Kryoschablone direkt am gefrorenen OTC-Block die Positionen, an denen sich die Neurosphären befinden.

Entfernen Sie den OCT-Block aus der Form und platzieren Sie ihn auf dem Kryostat-Chuck. Befestigen Sie die Form am Chuck mit CO2 und stellen Sie sie in den Kryostaten. Lassen Sie die Proben mindestens 30 Minuten lang äquilibrieren.

Wenn dies erledigt ist, schneiden Sie rasch entlang der Markierungen am Formstück und beginnen Sie anschließend, jeden Schnittabschnitt einzusammeln. Überprüfen Sie mithilfe eines Lichtmikroskops, an welcher Stelle die Neurosphärenschnitte beginnen. Sobald das Schneiden abgeschlossen ist, bewahren Sie die Objektträger im Gefrierschrank auf, bis Sie bereit sind, die Immunchemie durchzuführen. Entnehmen Sie für diesen Schritt die Objektträger mit einem der seriell geschnittenen Neurosphären und berücksichtigen Sie zusätzlich die Objektträger mit den fünf vorhergehenden und den fünf nachfolgenden Schnitten.

Dadurch stellen Sie sicher, dass Sie die gesamte Neurophäre abbilden. Die Verwendung eines nuklearen Gegenanfärbemittels ist unerlässlich, um alle Abschnitte Ihrer Neurophäre zu finden. Berücksichtigen Sie dies bei der Planung Ihrer Immunfärbung, während die Objektträger mit PBS behandelt und mindestens fünf Minuten lang auf Raumtemperatur erwärmt werden. Wir verwenden einen Antikörperpuffer, der 0,3 % Triton X-100 zur Permeabilisierung und 3 % Rinderserumalbumin zum Blockieren enthält.

Verdünnen Sie Ihren Primärantikörper entsprechend in diesem Puffer und inkubieren Sie ihn über Nacht bei vier Grad in der humanen Kammer. Verwenden Sie PBS, um das Paraform von den Neurosphären abzulösen, und entfernen Sie es vorsichtig mit einer Pinzette. Dies ist die erste von vier fünfundzwanzigminütigen PBS-Spülungen.

Die Sekundärantikörper auf die Objektträger auftragen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Wie zuvor wird das Paraform mit PBS von dem Objektträger abgeschwemmt und mit einer Pinzette entfernt. Auch dies ist der erste von insgesamt vier fünfminütigen PBS-Spülgängen.

Im dritten Waschschritt fügen wir HOS 3 3 2, 5 8 als nukleäres Gegengegenfärbemittel hinzu, das auf 0,5 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt wird. Anschließend erfolgt in PBS ein weiterer Fünf-Minuten-Waschschritt nach dem HOS-Waschschritt. Nach Abschluss aller Waschschritte eine reichliche Menge Einbettmedium auf den Objektträger geben und mit einem Deckgläschen abdecken.

Befestigen Sie die Ecken mit Nagellack. Sobald alle Objektträger mit Deckgläsern versehen sind, befestigen Sie die restlichen Kanten der Deckgläser. Bilden Sie den Objektträger sofort ab oder lagern Sie ihn bei minus 20 °C, bis Sie dazu bereit sind.

Bei der Bildgebung ist das Auffinden der Zellen auf dem Objektträger der schwierigste Teil; es wird einfach sein, Zellen zu erkennen, die der Sphäre angehören, wenn Sie sie mithilfe der Kerngegenanfärbung suchen. Sobald Sie den Beginn der Neurosphäre gefunden haben, der möglicherweise nur aus wenigen Zellen besteht, bilden Sie jeden darauf folgenden Schnitt ab. Machen Sie Aufnahmen der Kernanfärbung, Ihres oder Ihrer Proteine von Interesse sowie ein Phasenkontrastbild.

Dieses Phasenkontrastbild wird in den Modellierungsstufen sehr wichtig sein. Bilder mit eingebauten Maßstäben von 10 Mikrometern und 50 Mikrometern, die in der Open-Lab-3.56-Software erstellt wurden, werden in Photoshop CS4 mit einer standardmäßigen Leinengröße von 3.300 mal 2.550 Pixeln importiert.

Alle Bilder der Serienschnitte werden als TIFF-Dateien unter Beibehaltung der standardmäßigen Leinwandgröße gespeichert. Öffnen Sie die Phasen- und Kontrastbilder der Serienschnitte der Neurosphären. Erhöhen Sie die Transparenz des zweiten Schnitts unter dem Bildreiter, öffnen Sie die Bildrotation und wählen Sie eine beliebige Ausrichtung.

Drehen Sie den zweiten Abschnitt, bis Sie Punkte geometrischer und struktureller Kontinuität zwischen den Bildern identifizieren können. Wiederholen Sie dies für alle seriellen Abschnitte und speichern Sie jeden Abschnitt als separate Ebene. Stellen Sie sicher, dass die jeweiligen Bildebenen für Phase und Proteinausdruck verknüpft sind, sodass alle Drehungen für jeden Kanal gleichzeitig durchgeführt werden.

Erstellen Sie eine Ebene in Maya mit denselben Proportionen wie die Photoshop-Datei aus der Statusleiste der Maya-Benutzeroberfläche. Wechseln Sie die Menüleiste von der standardmäßigen Animationseinstellung zu „Surfaces“. Verwenden Sie eine primitive Unterteilungskugel, um den Zellkörper zu erstellen, während die Kugel ausgewählt ist.

Beginnen Sie mit der Bearbeitung der Eckpunkte, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Objekt klicken und im Markierungsmenü „Vertex“ auswählen. Verfeinern Sie weiterhin die Oberfläche der Kugel, indem Sie im Markierungsmenü den Anzeigelevel im Reiter „Subdivision Surfaces“ des Hauptmenüs ändern. Öffnen Sie das Optionsfeld „Collapse Hierarchy“ und stellen Sie die Anzahl der Level auf zwei ein.

Reduzieren Sie die Kugel. Wechseln Sie die Menüleiste von Oberflächen zu Polygonen, während die Kugel ausgewählt ist. Öffnen Sie das Werkzeug zur Skulptur von Geometrie über den Mesh-Tab im Hauptmenü.

Verfeinern Sie die Oberfläche der Zelle in ihre endgültige Form. Verwenden Sie dazu den Werkzeugsatz „Sculpt Geometry“ aus der Registerkarte „Tool Settings“. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Zelle Ihrer Typologie, um die Vielfalt der Vorläuferzellen in den Neurosphären zu simulieren.

In dieser Demonstration bilden 10 unterschiedliche Vorläuferzellen die Grundlage der Neurokugel. Wählen Sie die Zelltypologie aus und frieren Sie die Transformationen mit den Zellen Ihrer Typologie ein. Zwei Oberflächen-Shadings werden entworfen, um sowohl Zellen darzustellen, die das Protein in 29 exprimieren, als auch Zellen, in denen das Protein fehlt.

Öffnen Sie das Hyper-Shade-Fenster über die Registerkarte „Windows Rendering Editor“ im Hauptmenü. Wählen Sie einen Ramp-Shader in der Registerkarte „Oberflächenmaterialien“. Öffnen Sie den Attribut-Editor und stellen Sie die Shader-Farbe, die Glutlicht-Umgebungslichtfarbe, Bump-Map und die spekularen Farbattribute ein.

Weisen Sie dem Umgebungsfarbknoten eine braunesche 3D-Textur und dem Bump-Mapping-Knoten eine 2D-Fraktaltextur zu. Wählen Sie die resultierenden Shader-Ein- und -Ausgangsverbindungen aus und exportieren Sie das ausgewählte Netzwerk. Wählen Sie die Zelltypologie aus und öffnen Sie das Auswahlmenü für den Export.

Wählen Sie den Dateityp Maya A-S-C-I-I aus und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen „Diese Eingaben einschließen“, um die Auswahl zu exportieren. Öffnen Sie die Datei mit den ausgerichteten Serienschnitten in Adobe Photoshop. Legen Sie einen Schlüssel aus Bleistiftstrichen fest, um die Position jeder Vorläuferzelle in den Serienschnitten zu markieren.

In dieser Darstellung wird ein Schlüssel aus drei Strichen verwendet. Ein ausgefülltes Quadrat, ein Quadrat mit gestrichelter Linie und ein Quadrat mit einem Kreuz zeigen an, ob sich eine Zelle in einem, zwei oder drei Abschnitten befindet.

Dieser Strichschlüssel ist weiterhin durch die Farbe Rot definiert, die Zellen darstellt, die Connexin 29 exprimieren, und Weiß, das Zellen darstellt, die Connexin 29 nicht exprimieren. Schalten Sie die Phasenschicht ein und markieren Sie den Mittelpunkt jeder Vorläuferzelle mit einem weißen Strich. Verwenden Sie eine separate Ebene innerhalb des Abschnittsordners, um Ihre Karten anzulegen.

Wechseln Sie zwischen den Abschnitten, um die Position der Zelle zu bestimmen, und stellen Sie sicher, dass Zellen, die sich über mehrere Abschnitte erstrecken, ordnungsgemäß gekennzeichnet sind. Aktivieren Sie die CX 29-Ebene. Wählen Sie die Zellen aus, die in den Bereichen liegen, in denen CX 29 positiv exprimiert ist.

Wählen Sie den Befehl „Füllen“ aus dem Bearbeiten-Tab in der Hauptmenüleiste von Photoshop und ändern Sie die weißen Striche in Rot, nachdem die Karten vollständig sind. Speichern Sie jeden Abschnitt als separates JPEG-Bild im Ordner mit den Quellbildern des Maya-Projekts. Erstellen Sie dazu zunächst ein neues Maya-Projekt über die Statusleiste der Maya-Benutzeroberfläche.

Ändern Sie die Menüleiste von der standardmäßigen Animationseinstellung zu Polygonen, importieren Sie die Ebenen. Importieren Sie MA- und Skalierungsleisten-MA-Dateien aus dem Projektordner „seen“ mit der ausgewählten Ebene.

Weisen Sie einen Lambert-Shader zu, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Objekt klicken und im Attributeditor die Registerkarte „Neues Material zuweisen“ öffnen. Klicken Sie im Popup-Menü auf das karierte Feld rechts neben dem Attribut „Materialfarbe“. Wählen Sie im Attributeditor im Abschnitt „Datei“ unter dem Abschnitt „2D-Textur“ den Eintrag „Datei“.

Klicken Sie auf das Dateisymbol rechts neben dem Bildnamensattribut. Wählen Sie den ersten Abschnitt aus dem Quellbilderordner aus. Wechseln Sie die Kamera der Arbeitsbereichsansicht von der perspektivischen Ansicht zur standardmäßigen orthografischen Draufsicht, indem Sie die Registerkarte dieses Bereichs öffnen.

Wählen Sie das Werkzeug „Polygon erstellen“ aus dem Mesh-Tab des Hauptmenüs und verfolgen Sie den Umriss des Abschnitts. Wählen Sie die erste Karte aus dem Ordner mit den Quellbildern aus und weisen Sie sie der neu erstellten Polygon-Ebene zu. Gehen Sie nach den Schritten vor, um die Polygon-Ebene zu erstellen, wählen Sie bei ausgewähltem Objekt mit einem Rechtsklick auf die Ebene im Markierungsmenü UV aus.

Wählen Sie alle UV-Punkte der Ebenen aus und öffnen Sie den UV-Texturbeditor über den Windows-Tab im Hauptmenü. Skalieren Sie die UVs proportional, um sie an die Schnittebene anzupassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Abschnitt der Neurosphäre, wobei die Abstände zwischen den einzelnen Abschnitten der Höhe der Maßstabsleiste aus der Statuszeile der Maya-Benutzeroberfläche entsprechen sollen. Wechseln Sie die Menüleiste von der standardmäßigen Animations-Einstellung zu Dynamics und lassen Sie nur den ersten Abschnitt der Neurosphäre sichtbar.

Blenden Sie alle anderen Abschnitte aus, indem Sie die Anzeigeeinstellungen im Anzeigereiter des Hauptmenüs ändern, während das Optionenfeld für die CV-Kurvenwerkzeuge geöffnet ist; wählen Sie dann eine lineare Einstellung in den CV-Kurven-Einstellungen aus. Beginnen Sie ausgehend von der Kameraperspektive der Draufsicht, Punkte den Zellenkarten zuzuweisen, wobei Sie jeweils eine Kurve für die CX 29-negativen Zellen und die CX 29-positiven Zellen erstellen. Die resultierenden Kurven erscheinen flach, wenn sie aus der Seitenansicht betrachtet werden.

Schätzen Sie die Dicke der Schnitte ab, indem Sie die Punkte der Kurve entlang der Y-Achse verschieben. Verwenden Sie dazu die Maßstabsleiste als Orientierung. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Abschnitt der Neurokugel.

Importieren Sie die Zelltypologie-Datei „ma“ aus dem Szenenordner des Projekts und duplizieren Sie die Zelltypologie sowohl für die CX 29-negative als auch für die CX 29-positive Progenitorzelle. Öffnen Sie das Hyper-Shade-Fenster über den Reiter „Fenster – Rendering-Editoren“ im Hauptmenü.

Importieren Sie die zuvor erstellten Shader und weisen Sie sie den Zellen der Typologie aus dem Übersichtsfenster zu. Entfernen Sie den Dateinamen vom Anfang der importierten Objekte. Dies wird in späteren Phasen des Modellierungsprozesses wichtig werden.

Wählen Sie im Hauptmenü die Registerkarte „Particles“ aus und erstellen Sie einen Partikelemitter für die erste CV-Kurve. Öffnen Sie die Partikel-Shape-Registerkarte, und ändern Sie unter Emissionsattributen die Maximalanzahl von negativ eins auf die Anzahl der Punkte Ihrer ersten Kurve. Ändern Sie in der Registerkarte Render-Attribute den Partikel-Render-Typ zu „blobby surface“.

Klicken Sie auf das unten stehende Feld für den aktuellen Render-Typ und ändern Sie den Radius der Partikel auf 0,01. Befestigen Sie die Partikel an den Eckpunkten der Kurve, indem Sie zuerst die Partikel auswählen und dann bei gedrückter Umschalttaste die Kurve auswählen.

Öffnen Sie die Zieloptionen im Partikel-Tab des Hauptmenüs und stellen Sie das Zielgewicht auf eins ein. Klicken Sie auf Erstellen. Wählen Sie die Zellen nacheinander von Nummer eins bis 10 im Übersichtsfenster aus und öffnen Sie das Fenster für sofortige Ersetzungsoptionen im Partikel-Tab des Hauptmenüs.

Im Feld „Instanzobjekte“ sollten alle 10 Zellen der Reihe nach aufgelistet sein. Wählen Sie den korrekten Partikelform-Namen aus der Dropdown-Liste des Tabs „Partikelobjekt zur Instanziierung“. Klicken Sie auf „Erstellen“. Standardmäßig ersetzt nur die erste ausgewählte Zelle die Partikel entlang der Kurve. Um sicherzustellen, dass alle 10 Zellen erscheinen und zufällig unter den Partikeln rotieren, ist ein Ausdruck erforderlich.

Ein zweiter Ausdruck stellt sicher, dass die Zellen jedes Mal auf die gleiche Weise zufällig emittieren. Der Bereichsregler wird neu positioniert, während der Emitter ausgewählt ist. Öffnen Sie den Attribut-Editor im Partikelform-Tab unter „Dynamisches Attribut hinzufügen“.

Klicken Sie auf das allgemeine Feld unter „long name“. Geben Sie „random_underscore_index“ im Attributtyp ein, wechseln Sie von Skalar zu Partikel-Array und klicken Sie im Reiter „Per Particle Array Attributes“ auf „Add“. Ein Feld mit „random_underscore_index“ wurde hinzugefügt.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den leeren Bereich und wählen Sie im Dropdown-Feld „create expression“ aus. Geben Sie den folgenden Text in das Ausdrucksfeld ein, um den Ausdruck zu vervollständigen. Öffnen Sie die Registerkarte „instant search geometry replacement“ im Attribut-Editor und im Abschnitt „general options object index“.

Wählen Sie einen zufälligen Unterstrich-Index aus der Dropdown-Liste aus. Bringen Sie den Zeitregler zum ersten Frame und klicken Sie auf Abspielen. Die Zelltypen sind nun zufällig unter den Partikeln verteilt.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Abschnitt der Neurokugel. Stellen Sie sicher, dass jede neue Emitter-Instanz und jeder zufällige Index durch den Namen unterschieden wird und im Outliner-Fenster des Renderings angemessen organisiert ist. Verwenden Sie den Abschnitt des Render-Einstellungs-Fensters, um das Rendering von Maya-Software auf Mental Ray umzustellen.

Öffnen Sie die Registerkarte „Qualität“ und ändern Sie unter Raytracing die Reflexionseinstellung auf null. Öffnen Sie die Registerkarte „Frame-Buffer“ und ändern Sie den Farbbereich von „raw“ auf „alpha“ und deaktivieren Sie die Vorabmultiplikation.

Öffnen Sie den Kanal-Box-Ebenen-Editor und ändern Sie die Einstellungen des Ebenen-Editors von Anzeige auf Rendern. Wählen Sie die importierten Zellen der Typologie aus und klicken Sie auf das Symbol „Neue Ebene erstellen und ausgewählte Objekte zuweisen“. Benennen Sie die Ebene in Ambient Occlusion um.

Rechtsklicken Sie auf die neu erstellte Ebene und wählen Sie im Menü rechts neben dem Render-Layer-Feld die Attribute aus. Klicken Sie auf die Voreinstellungen-Schaltfläche und wählen Sie „Occlusion“ aus der Dropdown-Liste. Wählen Sie die Registerkarte MIB_amb_occlusion_one aus und ändern Sie die Samples von 16 auf 256.

Öffnen Sie erneut den Kanal-Box-Layer-Editor und aktivieren Sie im Reiter „Optionen“ das Optionsfeld „Alle Layer rendern“. Wählen Sie „Komposit“ aus und behalten Sie die Layer mit aktiviertem Ambient-Occlusion-Layer bei. Ändern Sie den Blendmodus von „Normal“ auf „Multiplizieren“ über das Dropdown-Menü direkt über der Layer-Liste. Rendern Sie zwei Durchgänge der Neurosphäre, einmal mit aktiviertem Ambient-Occlusion-Layer und einmal mit aktiviertem Master-Layer. Speichern Sie die Bilder als IFF-Dateien im Bilderordner des Projekts.

Öffnen Sie beide Bilder in Adobe Photoshop. Legen Sie die Ambient-Occlusion-Schicht über der Master-Schicht ab und stellen Sie sie auf „Multiplizieren“ ein. Erstellen Sie einen Hintergrund und reduzieren Sie das Bild zu einer Ebene.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Hippocampus-abstammende neurogene Zellen als Neurosphären kultiviert, wie man Neurosphärenkulturen seriell mit einem Kryostaten schneidet und wie man eine Immunfärbung für ein Protein von Interesse durchführt. Außerdem haben wir Ihnen gezeigt, wie man die räumliche Lokalisation der Expression dieses Proteins in drei Dimensionen mithilfe einer Kombination aus Zellkultur-Registration und dreidimensionaler Modellierungssoftware modelliert.

Wir hoffen, dass Ihnen dies hilft, und wünschen Ihnen viel Erfolg bei Ihren Experimenten.