Lokalisieren von Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: Ein Hybrid Visualisierung Methodology

Wenn sie in Suspension gezüchtet werden, vermehren sich neurale Vorläuferzellen, die aus neurogenen Nischen des Gehirns isoliert wurden, zu Neurosphären. Hier zeigen wir die Isolierung und serielle Sektion von frei schwebenden postnatalen hippokampalen Neurosphären, um die Proteinexpression innerhalb der dreidimensionalen Neurosphäre zu lokalisieren. Wir werden eine Immunfärbung für ein in diesem Fall interessantes Protein, Conexion 29, durchführen, gefolgt von der Assemblierung und Translation von zweidimensionalen Mikroskopiebildern in eine dreidimensionale Rekonstruktion der Neurosphäre.

Die Visualisierung von Proteinen im Kontext ihrer nativen dreidimensionalen Strukturen, wie z.B. einer frei schwebenden Neurosphäre oder eines Gewebes, ermöglicht ein besseres Verständnis der Proteinfunktion basierend auf der Position innerhalb dieser Strukturen und ermöglicht auch die Ableitung möglicher Regeln für Proteine mit bekannter Lokalisation, aber unbekannten Funktionen. Hallo, ich bin Sophia Ambo vom Neural Regeneration Laboratory an der University of Ottawa. Und ich bin Nicholas Valenzuela vom Carlton Immersive Media Studio an der Carleton University in Ottawa.

Heute zeigen wir, wie man aus dem Hippocampus stammende postnatale neurale Vorläuferzellen als Nervensphären isolieren, erweitern und seriell durchtrennen kann. Um die Proteinexpression durch Immunfärbung zu lokalisieren, werden wir dann zweidimensionale Bilder der seriellen Neurosphärenschnitte verwenden, die nach der Immunfärbung gesammelt wurden, um eine Methode zur Rekonstruktion der Zell- und Proteinposition in der dreidimensionalen Struktur zu veranschaulichen und dadurch die räumliche Organisation der Proteinexpression in den Neurosphären zu bewerten. Also lasst uns loslegen.

Sobald das Gehirn entnommen wurde, bereiten Sie es darauf vor, es auf das Futter zu legen, indem Sie eine flache Oberfläche schaffen, auf der das Gehirn richtig ruhen kann. Dies wird als Blockieren bezeichnet. Blockieren Sie das Kleinhirn mit einer Rasierklinge und einer Pinzette.

Geben Sie als Nächstes einen Tropfen verrückten Kleber auf das Spannfutter und befestigen Sie das erste Gehirn darauf, mit der vorderen Seite nach oben und mit der dorsalen Seite nach oben. Gehen Sie bei den anderen Gehirnen beim letzten Gehirn so vor, es ist ratsam, die dorsale Seite von Ihnen weg zu positionieren, da der Schnitt in dieser Richtung manchmal unvollständig ist. Sollte es zu einem unvollständigen Schnitt kommen, schneiden Sie den Schnitt mit einem Skalpell durch und sammeln Sie ihn.

Beim Verkleben ist Geschwindigkeit das A und O, da das Gehirn nicht zu lange der Luft ausgesetzt werden kann. Sind alle Gehirne eingeklebt, wird das Bohrfutter in das Vibrato gelegt und die Halterung eiskalt gefüllt. Ein Liquor.

Stellen Sie den Vibrator auf eine Frequenz von 8,5 und eine Geschwindigkeit von 3,5 bis 4,5 ein. Bringen Sie die Klinge in Kontakt mit dem A CSF und stellen Sie den automatischen Schnitt ein. Jetzt schneiden wir 500-Mikron-Scheiben.

Bewahren Sie die Scheiben auf, die den Hippocampus enthalten. Legen Sie sie in eine mit eiskaltem A CSF gefüllte Schüssel und entsorgen Sie die restlichen Scheiben. Sobald alle Scheiben gesammelt sind, fahren Sie mit der Hippocampus-Dissektion fort.

Mit einem Stereomikroskop nehmen wir nur den dorsalen Hippocampus ungefähr zwischen bgma minus 1,65 Millimeter und minus zwei Punkt 10 Millimeter auf. Legen Sie die Nilpferd-Campi in eine leere eiskalte Schale. Wenn alle Nilpferd-Campi von den Scheiben eingesammelt wurden, ist es an der Zeit, sie zur mechanischen Dissoziation in die Strömungshaube zu bringen.

Besprühen Sie die Skalpellklinge mit einem Skalpell mit 70% Ethanol und flammen Sie sie zur Sterilisation. Schneiden Sie das Taschentuch mit dem Skalpell ein, bis es flüssig erscheint. Verwenden Sie nun Dissoziationsmedien, die bereits Pepan-DNA und neurale Protease enthalten, und sammeln Sie das Gewebe durch Pipettieren und geben Sie es in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Für die enzymatische Dissektion stellen Sie das Röhrchen in einen rotierenden Ofen, der auf 37 Grad eingestellt ist, und lassen Sie den Aufschluss 45 Minuten bis eine Stunde lang stattfinden. Sobald die Verdauung abgeschlossen ist, fügen Sie 10 Milliliter sterile Gewebekultur PBS hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen, und schleudern Sie die Zellen fünf Minuten lang mit dem 300-fachen G herunter. Entfernen Sie das Supra natant und resuspendieren Sie das Pellet

Verwenden Sie in fünf Millilitern PBS eine Weidepipette und entnehmen Sie die Probe, um das Gewebe weiter zu dissoziieren. Takten Sie so lange, bis die Gewebestücke nicht mehr kleiner werden. Pelletieren Sie die Zellen an dieser Stelle erneut.

Entfernen Sie das PBS und resuspendieren Sie das Pellet in drei Millilitern Erhaltungsmedium. Sobald Sie dies getan haben, verreiben Sie die Probe gut. Nehmen Sie ein 15-Mikroliter-Aliquot und mischen Sie es mit einem gleichen Volumen Trianblau.

Entnehmen Sie zwei 10-Mikroliter-Proben und laden Sie ein Hämozytometer für die Zellzählung. Zählen Sie die Zellen aus drei Feldern in jedem Abschnitt, um insgesamt sechs Felder zu erhalten. Durchschnittliche Zahlen in Berechnen Sie Ihre Zelldichte.

Beachten Sie, dass die Probe verdünnt wird. In der Trian-Blau-Platte werden die Zellen in Schalen mit geringer Adhärenz bei einer Dichte von 2,5 mal 10% zu den fünf Zellen pro Schale in einem Endvolumen von fünf Millilitern Erhaltungsmedium gegeben. Wenn keine Schalen mit geringer Adhärenz verfügbar sind, können Sie Petrischalen verwenden.

In diesem Fall müssen Sie in den ersten sechs Tagen jeden Morgen und Nachmittag auf die Neurosphären klopfen, damit die Neurosphären nicht am Boden der Schale kleben. Fügen Sie EG, F und FGF hinzu, bevor Sie die Schalen in den Inkubator stellen. Diese Wachstumsfaktoren müssen alle zwei Tage über die gesamte Dauer der Kultur aufgefüllt werden. Am Tag in vitro 14 fixieren Sie die Neurosphären mit Formaldehyd auf eine Endkonzentration von etwa 4 %, indem Sie es direkt in die Kultur geben und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Mit einem Wipppellet werden die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 mal G für fünf Minuten beschleunigt. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und resuspendieren Sie sie in einer 15 bis 20%igen Saccharoselösung, die in 10 Millimolar Phosphatpuffer besteht. Lassen Sie es mindestens 24 Stunden lang bei vier Grad kryoschützen, bevor Sie auf einem Kryostaten schneiden.

Nehmen Sie die kryogeschützten Neurosphären aus dem Kühlschrank und legen Sie sie in eine 60-Millimeter-Schale. Für serielle Schnitte, bei denen eine Sammlung jedes einzelnen Abschnitts entscheidend ist, fand ich es am besten, Neurosphären von guter Größe und Form mit einem Stereomikroskop unter Verwendung einer Pipettierstelle auszuwählen, eine Neurosphäre in eine Kryoform, die mit OCT-Verbindung gefüllt ist. Markieren Sie die Stelle, an der sich die Neurosphären auf der Kryoform befinden.

Dieser Schritt hilft dabei, die Neurosphäre während des Schneidens zu finden. Sobald fünf bis 10 Kugeln schnell in die Form eingelegt wurden, frieren Sie sie mit CO2 ein. Anhand der Angaben auf der Kryoform markieren Sie, wo sich die Neurosphären direkt in den gefrorenen OTC-Block befinden.

Nehmen Sie den OCT-Block aus der Form und setzen Sie ihn auf das Kryostat-Futter. Befestigen Sie die Form mit CO2 am Futter und setzen Sie sie in den Kryostaten. Lassen Sie die Proben mindestens 30 Minuten lang äquilibrieren.

Sobald dies erledigt ist, schneiden Sie schnell zu den Markierungen auf der Form und beginnen Sie von da an mit dem Sammeln aller Abschnitte. Mit einem Lichtmikroskop überprüfen, wo die Schnitte der Neurosphäre beginnen Sobald die Schnitte abgeschlossen sind, lagern Sie die Objektträger in einem Gefrierschrank, bis Sie bereit sind, die Immunchemie durchzuführen. Nehmen Sie für diesen Schritt die Objektträger heraus, die eine der seriell geschnittenen Neurosphären enthalten, und fügen Sie die Objektträger mit fünf vorherigen und fünf nachfolgenden Abschnitten hinzu.

Dies wird sicherstellen, dass Sie die gesamte Neurosphäre abbilden. Die Verwendung eines nuklearen Gegenflecks ist ein Muss, um alle Bereiche Ihrer Neurosphäre zu finden. Denken Sie also daran, wenn Sie Ihre Immunfärbung planen, während wir die Objektträger durch Auftragen von PBS und mindestens fünf Minuten auf Raumtemperatur erwärmen lassen, einen Antikörperpuffer verwenden, der 0,3 % Triton X 100 für die Permeation und 3 % Rinderserumalbumin für die Blockierung enthält.

Verdünnen Sie Ihren Primärantikörper entsprechend in diesem Puffer und inkubieren Sie über Nacht in der menschlichen Kammer bei vier Grad. Verwenden Sie PBS, um das Paraform von den Neurosphären zu schweben und entfernen Sie es vorsichtig mit einer Pinzette. Dies ist die erste von vier fünfminütigen PBS-Wäschen.

Tragen Sie den Sekundärantikörper auf Objektträger auf und inkubieren Sie diese eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Schweben Sie wie zuvor mit PBS vom Objektträger und entfernen Sie ihn mit einer Pinzette. Auch dies ist die erste von vier fünfminütigen PBS-Wäschen.

In der dritten Wäsche fügen wir HOS 3 3 2, 5 8 als nuklearen Gegenfleck hinzu, der auf 0,5 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt wird. In PBS gibt es nach der Hos-Wäsche eine weitere fünfminütige Wäsche. Sobald alle Wäschen abgeschlossen sind, tragen Sie eine großzügige Menge Eindeckmedium auf die Unterseite des Objektträgers auf und bedecken Sie ihn mit einem Glasdeckglas.

Sichern Sie die Ecken mit Nagellack. Sobald alle Objektträger Deckglas sind, befestigen Sie die restlichen Kanten des Deckglases. Stellen Sie sich die Folie sofort vor oder rühren Sie sie bei minus 20 Grad um, bis Sie dazu bereit sind.

Bei der Bildgebung ist das Auffinden der Zellen auf dem Objektträger der schwierigste Teil, es wird leicht sein, Zellen zu erkennen, die zur Kugel gehören, wenn Sie sie mit der Kerngegenfärbung suchen. Sobald Sie den Anfang der Neurosphäre gefunden haben, die vielleicht nur aus wenigen Zellen besteht, stellen Sie sich von da an jeden Abschnitt vor. Machen Sie Aufnahmen des Kernflecks, Ihres Proteins oder Ihrer Proteine von Interesse und eines Phasenkontrastbildes.

Dieses Phasenkontrastbild wird in der Modellierungsphase sehr wichtig sein. Bilder mit residenten Maßstabsbalken von 10 Mikrometern und 50 Mikrometern, die in der Open Lab 3.56-Software erstellt wurden, werden in Photoshop importiert. CS four mit einer Standard-Leinwandgröße von 3.300 x 2.550 Pixeln.

Alle Serienschnittbilder werden als TIFF-Dateien gespeichert, wobei die Standard-Leinwandgröße beibehalten wird. Öffnen Sie die erste und zweite Phase, kontrastieren Sie Bilder der seriellen Schnitte der Neurosphären. Erhöhen Sie die Transparenz des zweiten Abschnitts unter der Registerkarte Bild, öffnen Sie die Bilddrehung und wählen Sie Beliebig.

Drehen Sie den zweiten Abschnitt, bis Sie in der Lage sind, Punkte der geometrischen und strukturellen Kontinuität zwischen den Bildern zu identifizieren. Wiederholen Sie den Vorgang für alle seriellen Abschnitte, wobei jeder Abschnitt als separate Ebene gespeichert wird. Stellen Sie sicher, dass jede Bildschicht, die der Phasen- und Proteinexpression entspricht, Verknüpfungen sind, sodass alle Rotationen für jeden Kanal gleichzeitig ausgeführt werden.

Erstellen Sie in Maya eine Ebene, die die gleichen Proportionen wie die Photoshop-Datei hat, in der Statuszeile der Benutzeroberfläche von Maya. Ändern Sie die Standardeinstellung für die Animation in der Menüleiste in Oberflächen. Verwenden Sie eine primitive Unterteilungskugel, um den Zellenkörper mit der ausgewählten Kugel zu erstellen.

Beginnen Sie mit der Bearbeitung der Scheitelpunkte, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Objekt klicken und den Scheitelpunkt aus dem Markierungsmenü auswählen. Verfeinern Sie außerdem die Oberfläche der Kugel, indem Sie die Anzeigeebene über das Markierungsmenü auf der Registerkarte Unterteilungsflächen des Hauptmenüs ändern. Öffnen Sie das Optionsfeld zum Reduzieren der Hierarchie, und legen Sie die Anzahl der Ebenen auf zwei fest.

Klappen Sie die Kugel ein. Ändern Sie die Menüleiste von Flächen in Polygone, wobei die Kugel ausgewählt ist. Öffnen Sie das Sculpting-Geometrie-Werkzeug über die Registerkarte Netz des Hauptmenüs.

Verfeinern Sie die Oberfläche der Zelle in ihre endgültige Form. Verwenden des Werkzeugsatzes "Sculpting-Geometrie" auf der Registerkarte "Werkzeugeinstellungen". Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Zelle Ihrer Typologie, um die Vielfalt der in den Neurosphären vorhandenen Vorläuferzellen zu simulieren.

In dieser Demonstration bilden 10 unterschiedliche Vorläuferzellen die Grundlage der Neurosphäre. Wählen Sie die Zelltypologie aus, und frieren Sie die Transformationen mit den Zellen Ihrer Typologie ein. Etablierte zwei Oberflächen-Shader werden so konzipiert, dass sie sowohl Zellen darstellen, die das Protein exprimieren, als auch Zellen, in denen das Protein nicht vorhanden ist.

Öffnen Sie das Hyper-Shade-Fenster auf der Registerkarte des Windows-Rendering-Editors im Hauptmenü. Wählen Sie einen Rampen-Shader auf der Registerkarte Oberflächenmaterialien aus. Öffnen Sie den Attribut-Editor, und legen Sie die Attribute für Shader-Farbe, Glühlampen, Umgebungsfarbe, Relief, Map und Specular-Farbe fest.

Weisen Sie dem Knoten für die Umgebungsfarbe eine Brownsche 3D-Textur und dem Bump-Mapping-Knoten eine fraktale 2D-Textur zu. Wählen Sie die resultierenden Shader-Ein- und Ausgabeverbindungen aus und exportieren Sie das ausgewählte Netzwerk. Wählen Sie die Zellentypologie aus und öffnen Sie das Feld für die Exportauswahloptionen.

Wählen Sie den Dateityp Maya A-S-C-I-I und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen "Diese Eingaben einschließen" für die Exportauswahl. Öffnen Sie die Datei mit den ausgerichteten Serienabschnitten in Adobe Photoshop. Legen Sie eine Tonart mit Bleistiftstrichen fest, um die Position jeder Vorläuferzelle in den seriellen Abschnitten zu markieren.

In dieser Demonstration eine Taste mit drei Schlägen. Ein solides Quadrat. Ein Quadrat mit einer gestrichelten Linie und ein Quadrat mit einem Kreuz werden verwendet, um anzuzeigen, ob sich eine Zelle in einem, zwei oder drei Abschnitten befindet.

Diese Strichtaste wird ferner durch die Farbe Rot definiert, die Zellen darstellt, die Conexion 29 exprimieren, und Weiß, die Zellen repräsentieren, die Conexion 29 nicht exprimieren. Schalten Sie die Phasenschicht ein und beginnen Sie, das Zentrum jeder Vorläuferzelle mit einem weißen Bleistiftstrich zu markieren. Verwenden Sie einen separaten Layer innerhalb des Abschnittsordners, mit dem Sie Ihre Karten erstellen können.

Wechseln Sie zwischen den Abschnitten, um die Position der Zelle zu lokalisieren, und stellen Sie sicher, dass Zellen in mehr als einem Abschnitt korrekt gekennzeichnet werden. Wenn die CX 29-Schicht eingeschaltet ist. Wählen Sie die Zellen aus, die in die Regionen fallen, in denen CX 29 positiv exprimiert wird.

Wählen Sie den Befehl "Füllen" auf der Registerkarte "Bearbeiten" in der Hauptmenüleiste von Photoshop und ändern Sie die weißen Striche in rot, wenn die Maps fertig sind. Speichern Sie jeden Abschnitt als separates JPEG-Bild im Quellbildordner des Maya-Projekts. Dazu muss zunächst ein neues Maya-Projekt aus der Statuszeile der Benutzeroberfläche von Maya erstellt werden.

Ändern Sie die Standardeinstellung für die Animation der Menüleiste in Polygone, um die Ebenen zu importieren. Do ma und Maßstabsleiste. MA-Dateien aus dem Ordner "Gesehene Projekte" mit ausgewählter Ebene.

Weisen Sie einen Lambert-Shader zu, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Objekt klicken und die Registerkarte Neues Material zuweisen im Attributeditor öffnen. Klicken Sie im Einblendmenü auf das markierte Kästchen rechts neben dem Attribut "Materialfarbe". Wählen Sie im Attribut-Editor im Abschnitt "2D-Textur" unter dem Abschnitt "Dateiattribut" die Option "Datei" aus.

Klicken Sie auf das Dateisymbol rechts neben dem Attribut "Bildname". Wählen Sie den ersten Abschnitt aus dem Ordner mit den Quellbildern aus. Schalten Sie die Kamera des Arbeitsbereichsfensters von der perspektivischen Ansicht auf die orthogonale Standardansicht von oben um, indem Sie die Registerkarte "Bereiche" öffnen.

Wählen Sie das Werkzeug Polygon erstellen auf der Registerkarte Netz des Hauptmenüs aus und zeichnen Sie den Umriss des Abschnitts nach. Wählen Sie die erste Karte aus dem Quellbildordner aus, und weisen Sie sie der neu erstellten Polygonebene zu. Befolgen Sie die Schritte zum Erstellen der Polygonebene mit dem ausgewählten Objekt und wählen Sie UV aus dem Markierungsmenü, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Ebene klicken.

Wählen Sie alle UV-Punkte der Ebenen aus und öffnen Sie den UV-Textureditor auf der Registerkarte "Fenster" des Hauptmenüs. Skalieren Sie den UVS proportional, um ihn an die Schnittebene anzupassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Abschnitt der Neuros-Sphäre und stellen Sie sicher, dass die Abstände zwischen den einzelnen Abschnitten der Höhe des Maßstabsbalkens in der Statuszeile von Mayas Benutzeroberfläche entsprechen. Ändern Sie die Standardeinstellung für die Animation in die Menüleiste, sodass nur der erste Abschnitt der Neurosphäre sichtbar bleibt.

Blenden Sie alle anderen Abschnitte aus, indem Sie die Anzeigeeinstellungen auf der Registerkarte "Anzeige" des Hauptmenüs ändern, während das Optionsfeld für die CV-Kurvenwerkzeuge geöffnet ist, und wählen Sie einen linearen Abschnitt aus den Einstellungen für die CV-Kurve aus. Wenn Sie die Szene von oben betrachten, beginnen Sie mit der Zuweisung von Punkten zu den Zellenkarten, indem Sie eine Kurve für die negativen Zellen CX 29 und die positiven Zellen CX 29 erstellen. Die resultierenden Kurven sind flach, wenn sie von der Seitenkamera aus betrachtet werden.

Nähern Sie sich der Dicke der Schnitte an, indem Sie die Punkte der Kurve in der Y-Achse verschieben. Verwenden Sie die Maßstabsleiste als Richtlinie. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Abschnitt der Neurosphäre.

Importieren Sie die Datei "Cell typology.ma" aus dem Ordner "Szenen" des Projekts, und duplizieren Sie die Zellentypologie sowohl für das Negative CX 29 als auch für das Positive für CX 29. Vorfahre. Öffnen Sie das Hyper-Shade-Fenster auf der Registerkarte Windows-Rendering-Editoren des Hauptmenüs.

Importieren Sie die zuvor erstellten Shader und weisen Sie sie den Zellen der Typologie aus dem Outliner-Fenster zu. Entfernen Sie den Dateinamen am Anfang der importierten Objekte. Dies wird in späteren Phasen des Modellierungsprozesses wichtig werden.

Wählen Sie im Hauptmenü den Reiter "Partikel" und erstellen Sie einen Partikel-Emitter für die erste CV-Kurve. Öffnen Sie die Registerkarte Partikelform eins, und ändern Sie unter Emissionsattribute die maximale Anzahl von minus eins in die Anzahl der Punkte auf der ersten Kurve. Ändern Sie auf der Registerkarte Renderattribute den Partikelrendertyp in Blobby surface.

Klicken Sie unten auf das Feld für den aktuellen Rendertyp, und ändern Sie den Radius der Partikel auf 0,01. Hängen Sie die Partikel an die Eckpunkte der Kurve an, indem Sie zuerst die Partikel auswählen. Schalten Sie dann die Umschalttaste und wählen Sie die Kurve aus.

Öffnen Sie die Zieloptionen auf der Registerkarte "Partikel" des Hauptmenüs und stellen Sie die Zielgewichtung auf eins ein. Klicken Sie auf Erstellen. Wählen Sie die Zellen von Nummer eins bis 10 in der Reihenfolge im Outliner-Fenster aus und öffnen Sie das Feld für die Optionen für die sofortige Ersetzung auf der Registerkarte "Partikel" des Hauptmenüs.

Im Feld Instanzobjekte sollten alle 10 Zellen der Reihe nach aufgelistet werden. Wählen Sie den korrekten Namen der Partikelform aus der Dropdown-Liste der Registerkarte Partikelobjekt zur Instanz aus. Klicken Sie auf Erstellen Standardmäßig werden die Partikel entlang der Kurve nur durch die erste ausgewählte Zelle ersetzt. Damit alle 10 Partikel angezeigt werden und zufällig zwischen den Partikeln wechseln, ist eine Expression erforderlich.

Eine zweite Expression stellt sicher, dass die Zellen jedes Mal auf die gleiche Weise zufällig emittieren. Der Bereichsschieberegler wird neu positioniert, wenn der Emitter ausgewählt ist. Öffnen Sie den Attributeditor auf der Registerkarte "Partikelförmig" unter "Dynamisches Attribut hinzufügen".

Klicken Sie auf das Feld allgemein unter Langname. Schreiben Sie einen zufälligen Unterstrich-Index in den Attributtyp, wechseln Sie vom Skalierer zum Pro-Partikel-Array und klicken Sie auf der Registerkarte "Attribute pro Partikel-Array" auf Hinzufügen. Ein zufälliges Indexfeld für Unterstriche wurde hinzugefügt.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die leere Stelle und wählen Sie Ausdruck erstellen aus dem Dropdown-Feld aus. Geben Sie den folgenden Text in das Ausdrucksfeld ein, um den Ausdruck zu vervollständigen. Öffnen Sie die Registerkarte Geometrieersetzung für die Sofortsuche im Attributeditor und im Objektindex der allgemeinen Optionen.

Wählen Sie den zufälligen Unterstrich-Index aus der Dropdown-Liste aus. Bringen Sie den Zeitschieberegler auf das erste Bild und drücken Sie auf Wiedergabe. Die Zelltypen sind nun zufällig auf die Partikel verteilt.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Abschnitt der Neurosphäre. Stellen Sie sicher, dass jede neue Emitterinstanz und jeder Zufallsindex nach Namen unterschieden und im Gliederungsfenster des Renderings entsprechend organisiert wird. Ändern Sie im Abschnitt des Fensters mit den Rendereinstellungen das Rendern von Maya-Software in mental ray.

Öffnen Sie die Registerkarte "Qualität" und ändern Sie unter "Raytracing" die Reflexionseinstellung auf Null. Öffnen Sie die Registerkarte Framebuffer, ändern Sie den Farbclip von raw in alpha und deaktivieren Sie ihn. Vorvermehren.

Öffnen Sie den Channel-Box-Layer-Editor, und ändern Sie die Einstellungen des Layer-Editors von Anzeige in Rendern. Wählen Sie die importierten Zellen der Typologie aus und klicken Sie auf das Symbol Neuen Layer erstellen und ausgewählte Objekte zuweisen. Benennen Sie die Ebene in Umgebungsokklusion um.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den neu erstellten Layer und wählen Sie Attribute aus dem Menü rechts neben dem Feld für den Render-Layer aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Voreinstellungen" und wählen Sie "Okklusion" aus der Dropdown-Liste aus. Wählen Sie den MIB-Unterstrich, AMB-Unterstrich, Okklusion, eine Registerkarte und ändern Sie die Samples von 16 auf 2, 56.

Öffnen Sie den Channelbox-Ebeneneditor erneut und öffnen Sie auf der Registerkarte "Optionen" das Optionsfeld "Alle Ebenen rendern", wählen Sie "Composite" aus und behalten Sie die Ebenen bei, bei denen die Umgebungsverdeckungsebene ausgewählt ist. Ändern Sie es von normal in multiplizieren aus dem Dropdown-Feld direkt über der Ebenenliste, rendern Sie zwei Durchgänge der Neuros-Sphäre, einmal mit eingeschalteter Umgebungs-Okklusionsschicht und einmal mit eingeschalteter Master-Ebene. Speichern Sie die Bilder als IFF-Dateien im Ordner "Projektbilder".

Öffnen Sie beide Bilder in Adobe Photoshop. Platzieren Sie die Umgebungsverdeckungsebene auf der Masterebene und stellen Sie sie auf Multiplizieren ein. Erstellen Sie einen Hintergrund und reduzieren Sie das Bild.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Kultur betreibt. Hippocampus leitet Neurogenzellen als Neurosphären ab Wie man eine Neurosphärenkultur seriell schneidet und wie man eine Immunfärbung für ein Protein von Interesse durchführt. Wir haben Ihnen auch gezeigt, wie Sie die räumliche Lokalisation dieser Proteinexpression in drei Dimensionen modellieren können, indem Sie eine Kombination aus Zellkulturregistrierung und dreidimensionaler Modellierungssoftware verwenden.

Wir hoffen, dass dies Ihnen hilft und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.