Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Ich bin Troy Gasai. Wir werden über einen organotypischen Schnittassay sprechen, der in meinem Labor in den letzten Jahren perfektioniert wurde. Ben Jacket aus meinem Labor wird Ihnen demonstrieren, wie dieser Assay durchgeführt wird.

Der organspezifische Schnittpräparat-Test des postnatalen Gehirns ist eine leistungsstarke Methode, um verschiedene Faktoren und deren Rolle bei der neuronalen Migration im postnatalen Gehirn und im TRO-Migrationsstrom zu untersuchen. Hallo, ich bin Ben Jakay. Ich bin Postdoktorand im Labor von Dr. Troy GGE am College of Veterinary Medicine der North Carolina State University, und ich möchte Ihnen heute zeigen, wie wir Gewebetransplantationen zwischen organspezifischen Mausgehirnschnitten durchführen, um migrierende Neuroblasten im postnatalen Gehirn sichtbar zu machen.

Alle in diesem Video beschriebenen Techniken sollten in einem sterilen Umfeld durchgeführt werden, vorzugsweise in einer laminaren Luftströmungskammer unter Verwendung sterilisierter Werkzeuge. Ein Tropfen Slice-Medium von 150 Mikrolitern wird mit einer Einwegspritze, die mit einer 23-Gauge-Nadel ausgestattet ist, in die Mitte des runden Glasbodens der Schale gegeben. Mehrere Klebestellen werden außerhalb des kreisförmigen Glasbodens angebracht, wobei eine Seite zum Flüssigkeitsaustausch ungeklebt bleibt. Anschließend wird vorsichtig mit Mikrozangen eine Nukleoporenmembran auf das Medium gelegt, wobei darauf geachtet werden muss, dass sich keine Luftblasen unter der Membran befinden.

Die gebogenen Pinzetten werden dann verwendet, um die Klebestellen zu glätten und die Membran an ihrem Platz zu befestigen. Ein Milliliter Schnittmedium wird auf die Membran gegeben, und schließlich werden die Schalen bis zur Verwendung in einen Inkubator gestellt. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn Schnitte von jungen postnatalen Mäusen im Alter von P1 bis P10 angefertigt werden. Zuerst wird der Kopf stabilisiert, indem man die Schnauze mit einer Mikrozange festhält.

Die Haut wird vom Nacken bis zur Schnauze längs ausgeschnitten. Die Kopfhaut wird abgezogen, um den Knochen freizulegen, und der Schädel wird längs und anterior beginnend am Sternum magna durch einen medianen und zwei laterale Schnitte, jeweils einen auf jeder Seite, durchtrennt. Dabei sollte darauf geachtet werden, den Kontakt mit dem darunterliegenden kortikalen Gewebe so gering wie möglich zu halten.

Während die Schädeldeckenlappen zur Verbesserung der Gewebestabilität vom Gehirn abgezogen werden. Bei der Vibratomschnitte werden die am stärksten lateralen und kaudalen Anteile des Gehirns mit einer Rasierklinge entfernt. Die beiden Hemisphären werden vorsichtig aus dem Schädel herausgeschöpft und mit der medialen Fläche nach unten in eine Einbettungsschale gelegt.

Sie werden sofort mit geschmolzenem, DNA-gradigem AGA-Rosen-Gel, das in Puffer für die Gewebepräparation gelöst und bei 37 Grad Celsius gehalten wird, bedeckt. Nach zwei Minuten Stabilisierung auf einer flachen, horizontalen Oberfläche werden die Formen zur vollständigen Aushärtung des AGA-Rosen-Gels auf Eis gestellt, um eine gleichmäßige Erstarrung sicherzustellen.

Nachdem das Gel mit den Hemisphären erstarrt ist, wird es aus der Form genommen und rund um das Gehirngewebe zurechtgeschnitten. Das in das Gel eingebettete Gewebe wird anschließend mit der medialen Fläche nach oben auf die Probenscheibe des Vibroschneidegeräts montiert und mit Cyanoacrylatkleber befestigt. Die Scheibe wird dann in das Vibrationsprobentablett eingesetzt, das mit eiskaltem Gewebepräparationsmedium gefüllt ist, und das Gehirn wird in Schnitten von 150 Mikrometer Dicke präpariert.

Einmal freigegebene Schnitte aus der Riechrinde-Stammzellzone werden vorsichtig mit einem kleinen flachen Spatel herausgenommen und flach in die Mitte der Kulturschalen gelegt. Es ist entscheidend, dass die Handhabung der Schnitte auf ein Minimum beschränkt bleibt, da das Gewebe sehr empfindlich ist. Die Menge an Kulturmedium in den Schalen wird so angepasst, dass sie ausreicht, um die Gehirnschnitte zu bedecken, sie aber gleichzeitig daran hindert, sich zu bewegen.

Die Petrischalen werden beschriftet und in einen Inkubator überführt. Die Gehirne der Spender werden ähnlich wie die der Empfänger präpariert, mit dem Unterschied, dass die Schnitte mit einer Dicke von 250 µm angefertigt werden und die Schnitte auf Eis gesammelt werden.

Kalte Gewebepräparation. Die Puffer-Schnitte werden sofort unter ein Stereomikroskop mit Epifluoreszenz-Einrichtung gelegt. Die RMS ist als graue, U-förmige Struktur sichtbar, die sich von der subependymalen Zone bis zum Riechkolben erstreckt.

Der RMS wird vorsichtig mit einer Mikrozange mikrodisseziert. Eine Zange dient dazu, das Schnittpräparat zu stabilisieren, während mit der anderen kleine Einschnitte um den RMS herum vorgenommen werden, bis dieser vom Präparat gelöst ist. Der entnommene RMS wird anschließend in kleine Explantate mit einem Durchmesser von etwa 200 bis 500 Mikrometern zerschnitten.

In diesem Beispiel werden Explantate von Mäusen, die das rote fluoreszierende Protein TD-Tomato exprimieren, präpariert. Die unteren Schalen mit Wirtsschnitten werden aus dem Inkubator genommen und unter das Stereomikroskop mit sichtbarem Licht platziert. Ein kleiner Einschnitt wird im Anfangssegment des RMS vorgenommen, und mithilfe einer Pipette mit einer 20-Mikroliter-Spitze wird ein einzelner Spender-RMS-Explant an die eingeschnittene Stelle im Wirts-RMS übertragen.

Das Explant wird vorsichtig in den Einschnitt geschoben, um den Kontakt zwischen den beiden Geweben herzustellen. Um sicherzustellen, dass dieser Kontakt stabil ist, werden die Explante leicht zwischen das Schnittpräparat und die kernarme Membran geschoben. Die Schalen werden dann für mindestens eine Stunde in den Inkubator zurückgebracht, damit sich die Schnitte auf der Membran absetzen können.

Neuroblasten sollten etwa ein bis zwei Stunden nach der Aussaat mit der Migration aus der Explantate in die Wirt-RMS beginnen. Die Zellmigration lässt sich am besten mit Objektiven mit extra langer Arbeitsdistanz und 20facher Vergrößerung visualisieren. Das kultivierte Gewebe wird vom Inkubator in eine beheizte Kammer am Mikroskop überführt.

Fluoreszierende Neuroblasten können in Abständen von null bis 10 Minuten abhängig von der gewünschten Art der Analyse abgebildet werden. Unser organisches Protokoll für Schnittkulturen wurde in den letzten Jahren gründlich geprüft und hinsichtlich der Konsistenz von Migrationsmustern und Orientierung im RMS optimiert. In diesem Beispiel zeigt die Analyse von Zellen, die aus Explantaten stammen, die von Mäusen gewonnen wurden, in denen TD-Tomato unter der Kontrolle des Nestin-Promotors exprimiert wird, eine stark orientierte und schnelle Migration in den Wirt-RMS.

Hohe Vergrößerung. Die Zeitrafferauswertung zeigt eine ausgezeichnete Auflösung der gesamten Länge eines wandernden Neuroblasts während einer 20-minütigen Aufnahmesitzung. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, können die Schnitte mit kaltem, frisch zubereitetem 4 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend mittels Immunfärbung auf verschiedene Bestandteile des Migrationsstroms untersucht werden.

In diesem Fall werden GFAP-positive Astrozyten in Blau und CD31-positive Blutgefäße in Grün mittels fluoreszenter Immunhistochemie sichtbar gemacht. Die Analyse mit hoher Vergrößerung von Schnitten, die für die Zytoskelettproteine Aktin in Blau und Tubulin in Grün gefärbt wurden, zeigt eine nicht einheitliche Expression dieser Bestandteile durch eine Zelle während der Migration. Unser Protokoll bringt einige Herausforderungen mit sich, die Geduld, Übung und einen erheblichen Zeitaufwand sowohl für die Vorbereitung als auch für die Analyse der Ergebnisse erfordern.

Hier sind einige nützliche Vorschläge, die Ihnen helfen, die besten Ergebnisse aus Ihren Experimenten herauszuholen. Nach unserer Erfahrung liefern Mäuse im Alter von P1 bis P10 die besten Ergebnisse. Eine Altersanpassung zwischen Spender- und Empfängerhirnen verbessert ebenfalls die Reproduzierbarkeit der Experimente.

Da die meisten Reagenzien und Kulturschalen frisch hergestellt werden müssen, erfordert unser Schnittpräparat-Assay mehrere Stunden ununterbrochene Vorbereitung und Bildgebung an einem einzigen Tag. Sobald die Gehirne entnommen wurden, müssen die nachfolgenden Schritte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Zwischen der Enthauptung und der Herstellung der Schnitte sollten alle Arbeitsschritte unter Verwendung von Eis und kalten Reagenzien erfolgen, und die Manipulation des Gewebes sollte auf ein Minimum beschränkt werden, um anatomische Störungen zu vermeiden.

Die für diese Dissektionen verwendeten Werkzeuge sollten steril sein und ausschließlich für Manipulationen an lebendem Gewebe vorbehalten bleiben. Niemals Werkzeuge verwenden, die jemals mit Fixierungslösungen wie Formaldehyd in Kontakt gekommen sind. Die Schnitte sind im Allgemeinen bis zu 36 Stunden lang vital, wobei zwischen 24 und 36 Stunden ein sichtbarer Rückgang der Migration, Geschwindigkeit und Orientierung festzustellen ist.

Beachten Sie diese Einschränkung bei der Planung Ihrer Experimente und Analysen.