Heterokaryon Technik zur Analyse von Zelltyp-spezifischen Localization

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Bewegung von Proteinen zu verfolgen, indem ein einzelnes Protein, das zwei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe trägt, in zwei getrennten Zelllinien exprimiert und diese Zelllinien anschließend miteinander fusioniert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Plasmide, die das Gen der gewünschten Proteine, jeweils fusioniert mit einem von zwei verschiedenen Fluoreszenzprotein-Genen, in zwei verschiedene Zelltypen transfiziert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen zu vermischen und jedem Zelltyp die Anreicherung des Proteins zu ermöglichen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Proteinsynthese zu hemmen und anschließend die Zellen mittels Polyethylenglykol zu fusionieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Visualisierung der Proteinlokalisation mittels Fluoreszenzmikroskopie. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Fluoreszenzmikroskopie eine Veränderung der Proteinlokalisation oder des Transportverhaltens zeigen.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsbiologie zu beantworten, beispielsweise wie sich spezifische Proteinfunktionen und -verhalten verändern, während Zellen transformiert werden. Obwohl diese Methode Einblicke in zellspezifische Veränderungen während der Transformation ermöglicht, kann sie ebenfalls auf andere Untersuchungen angewendet werden, wie beispielsweise Zellunterscheidung, Entwicklungsbiologie und Zellsignalgebung.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Optimierung der Transfektionsbedingungen sowie der Fusionsbedingungen für jeden unterschiedlichen Zelltyp erforderlich ist. Die erste in diesem Protokoll demonstrierte Methode zur Einführung von Plasmid-DNA in Zellen ist die NU Nuclear Affection-Methode, bei der die Lonza Nuclear Effector-Lösung verwendet wird, um kürzlich passagierte Zellen, die sich im logischen Wachstum befinden, mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zu waschen und sie durch Zentrifugation zu gewinnen. Sobald die Zellen ihre Anhaftung verloren haben, neutralisieren Sie die Trypsin-Behandlung durch Zugabe von Medium, das Serum enthält, und sammeln die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 ×g für fünf Minuten, während die Zellen zentrifugiert werden.

Geben Sie sterilisierte Deckgläser in eine sechsfach aufgeteilte Platte im Gewebekulturhaubenraum, dann pipettieren Sie 1,5 Milliliter vollständiges Kulturmedium in jede Vertiefung. Decken Sie die Platte ab und stellen Sie sie in den Zellkultur-Inkubator, um sie zu äquilibrieren.

Nach der Zentrifugation die Röhrchen in die Haube bringen, den Überstand absaugen und die Zellpellets in einem minimalen Volumen PBS resuspendieren. Anschließend die Zellen zählen und das Volumen der Zellsuspension auf sterile Mikrozentrifugenröhrchen aufteilen. Dies ergibt etwa fünf mal 10 hoch fünf Zellen pro Probe; erneut bei 1500 ×g für fünf Minuten zentrifugieren.

Nach Abschluss der Zentrifugation die Röhrchen in die Zellkulturfume bringen, die SNA abpipettieren und die Zellen vorsichtig resuspendieren. Suspendieren Sie die Zellen in jedem Röhrchen mit 100 Mikrolitern nukleärer Effektorlösung bei Raumtemperatur. Geben Sie dann fünf Mikrogramm Plasmadna zu jeder Probe hinzu und überführen Sie die Probe in eine nukleäre Effektor-Q-Vete, und decken Sie sie ab.

Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Führen Sie die Probenkvette in den Qvet-Halter ein. Wählen Sie das geeignete Kernresonanz-Programm aus und starten Sie es.

Die Auswahl des am besten geeigneten Programms erfordert möglicherweise vorherige Tests, um eine optimale Transfektionseffizienz bei minimaler Sterblichkeit zu gewährleisten. Anschließend die Zellen entweder als gemischte Populationen oder separat als Kontrollen in die 6-Loch-Platte aussäen. Die Platte zurück in den Inkubator stellen und die Zellen 12 Stunden lang regenerieren lassen.

Die zweite Methode zur transienten Expression von Plasmiden ist die Transfektion mit einem kagenwirksamen Reagenz. Geben Sie zunächst 0,8 Mikrogramm jeder Plasmid-DNA-Probe zu 200 Mikrolitern EC-Puffer in einem sterilen Zentrifagenröhrchen. Fügen Sie dann 6,4 Mikroliter Enhancer-Reagenz zu jeder Probe hinzu.

Verquirlen Sie kurz durch leichtes Anstoßen des Röhrchens und inkubieren Sie zwei Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie nach dieser kurzen Inkubation 20 Mikroliter Wirkstoffreagenz zu jeder Probe hinzu. Vermischen Sie jedes Röhrchen durch leichtes Anstoßen und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Während der Inkubation bereiten Sie die beiden Zelllinien vor, die im Experiment verwendet werden sollen. Für die Transfektion sollten die Zellen kürzlich passagiert worden sein und sich im logarithmischen Wachstum bei etwa 80 % Konfluenz befinden. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und geben Sie 1,5 Milliliter frisches DMEM mit 10 % FBS zurück.

Nachdem die DNA-Transfektionsreagenzien 15 Minuten lang inkubiert wurden, geben Sie 1,2 Milliliter DMEM mit 10 % FBS-Medium zu jeder Probe hinzu, mischen Sie durch Pipettieren und übertragen Sie sofort etwa 700 Mikroliter der Komplexe tropfenweise auf jeweils zwei Vertiefungen. In der 6-Loch-Platte mischen Sie durch Schwenken der Platte. Lassen Sie die Zellen mindestens drei Stunden im Inkubator im Zellkulturschrank transfizieren und geben Sie gegebenenfalls je einen sterilisierten Deckgläser pro Vertiefung in eine 6-Loch-Platte.

Beschichtete Deckgläser können verwendet werden, um die Zelladhäsion zu verbessern. Waschen Sie die transfizierten Zellen anschließend zweimal mit PBS und gewinnen Sie die Zellen durch minimale Trypsinisierung. Dies wird erreicht, indem 100 Mikroliter Trypsinlösung zu jedem Well gegeben und die Platte geschwenkt werden, um eine vollständige Benetzung sicherzustellen.

Danach sofort den restlichen Trypsin abpipettieren. Den verbleibenden Trypsin durch Resuspendieren der Zellen in 1,5 Milliliter frischem DMEM mit 10 % FBS neutralisieren und die Zellen entweder als gemischte Populationen oder getrennt als Kontrollen ansäen. In der 6-Loch-Platte mit Deckgläsern die Zellen 12 Stunden lang im Zellkultur-Inkubator regenerieren lassen.

Unabhängig von der Transfektionsmethode ist das Verfahren zur Erzeugung von heterologen Partikeln identisch. Nach der Transfektion entfernen Sie das Kulturmedium aus den Vertiefungen und waschen die Zellen zweimal mit PBS. Anschließend wird empfohlen, die Zellen mit Cycloheximid zu behandeln, um die weitere Proteinsynthese zu hemmen.

Fügen Sie Cycloheide in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter in Kulturmedium hinzu, um die Zellen zu bedecken, und inkubieren Sie zwei Stunden im Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie nach zwei Stunden die Zellen aus dem Inkubator und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Um die Fusion einzuleiten, bedecken Sie die Zellen mit einer Lösung aus 50 % Polyethylenglykol 1000 in serumfreiem DMEM und inkubieren Sie 125 Sekunden lang.

Entfernen Sie bei Raumtemperatur die PEG-Lösung und waschen Sie die Zellen mit PBS, um restliches PEG zu entfernen. Geben Sie dann zwei Milliliter DMEM mit 10 % FBS, die auf 37 Grad Celsius erwärmt wurden, hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 18 bis 24 Stunden im Zellkultur-Inkubator.

Nach der 18 bis 24-stündigen Inkubation entnehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und waschen die Zellen zweimal mit PBS. Danach pipettieren Sie je ein Milliliter 4 % Paraformaldehyd in PBS in jedes Loch und schwenken vorsichtig für 15 Minuten.

Während der Inkubation bereiten Sie die Mikroskopobjektträger vor, indem Sie einen einzelnen Tropfen Einbettmedium, das dpi enthält, hinzufügen. Waschen Sie die fixierten Zellen anschließend zweimal mit PBS und entfernen Sie vorsichtig jede Deckglasabdeckung mit einer kleinen Pinzette. Entfernen Sie restliches PBS durch Andrücken an ein Stück Papier, bevor Sie das Deckglas mit der Zellseite nach unten auf einen Mikroskopobjektträger mit Einbettmedium plus tappi legen.

Entfernen Sie das überschüssige Eindeckmedium vom Objektträger mit einem Tuch und versiegeln Sie die Ränder der Deckgläser. Mit Nagellack können die Zellen nun mittels konfokaler oder epifluoreszenzmikroskopischer Bildgebung sichtbar gemacht werden. In diesem Flussdiagramm ist die Heteromethode zur Analyse der zelltypspezifischen Lokalisation von Proteinen in drei grundlegenden Schritten dargestellt.

Transfektion des Plasmids, das ein fluoreszenzmarkiertes Protein exprimiert, Zellfusion mit Polyethylenglykol 1000 und fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, wie in diesen Epi-Fluoreszenzbildern zu sehen ist: Primäre Vorhautfibroblasten, Selbstfusionskontrollen, die das mit GFP markierte VP3-Protein des Hühneranämievirus exprimieren, zeigen hauptsächlich zytoplasmatische Lokalisation des Proteins in der nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomlinie H 1299. Selbstfusionskontrollen mit dem gleichen VP3-Protein, das mit DS.RED markiert ist, zeigen hauptsächlich nukleäre Lokalisation. Die heterogene Zellfusion von primären Vorhautfibroblasten und H 1299-Zellen führt zur Aufnahme transformierten Zellmaterials in die primären Vorhautfibroblasten und bewirkt eine Veränderung der Lokalisation des mit GFP markierten, aus primären Zellen stammenden VP3-Proteins in den Zellkern.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass der Erfolg stark von der Transfektionseffizienz in den verwendeten Zelltypen sowie von der Optimierung der Fusionsbedingungen für diese speziellen Zellen abhängt. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Flip und FRAP angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen im Zusammenhang mit der Echtzeitanalyse von Lokalisationsdynamiken zu beantworten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zelltypspezifische Proteinlokalisationen bewertet, indem fluoreszenzmarkierte Proteine eingeführt und Zellfusionen erzeugt werden.