Name: Heterokaryon Technik zur Analyse von Zelltyp-spezifischen Localization (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Lernen Sie die Heterokaryon-Technik zur Analyse zelltyp-spezifischer Proteinlokalisierung und nukleozytoplasmatischen Shuttling mittels Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in Krebsbiologie und Zellverhalten.

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Wir möchten die Worcester Polytechnic Institute Institut für Chemie und Biochemie für die Finanzierung danken.

1. Transfektion von Zelllinien Transfektion Methode 1 (Lonza Nucleofection für erhöhte primäre Zelle Transfektionseffizienz) <ol><li> Die Zellen sind von den letzten Durchgang und in der log-Phase Wachstum vor der Transfektion werden. Wash-Zellen in phophate Kochsalzlösung (PBS) und Ernte-Zellen durch Trypsinierung. </li><li> Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 xg für 5 Minuten. </li><li> Add sterilisiert Deckgläser mit einem 6-Well-Platte. Deckgläser kann für eine verbesserte Zelladhäsion beschichtet werden. Legen Sie 1,5 ml Kulturmedium (in diesem Fall Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% fötalem Rinderserum (FBS)) in jede Vertiefung und Gleichgewicht der Medien in den Inkubator. </li><li> Ernte der Zellen durch Trypsinierung und resuspendieren in einem minimalen Volumen von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Zählen Sie die Zellen und Zentrifuge die richtige Menge der Resuspension auf ~ 5x10 5 Zellen pro Probe zu erhalten. </li><li> Resuspendieren der Zellen vorsichtig in 100 ul Raumtemperatur Nucleofector Lösung pro Probe. </li><li> Kombinieren Sie 100 ul Zellsuspension mit 5 ug Plasmid-DNA und übertragen Sie die Probe auf eine Nucleofector Cuvette man aufpassen, nicht, um Luftblasen enthalten. </li><li> Wählen Sie das entsprechende Nucleofector Program (dies kann eine frühere Prüfung erforderlich, um eine optimale Transfektionseffizienz mit minimaler Mortalität zu etablieren). </li><li> Legen Sie die Küvette mit der Zelle / DNA-Suspension in den Nucleofector Küvettenhalter und beginnen das ausgewählte Programm. </li><li> Nach der Fertigstellung, entfernen Sie die Küvette und fügen ~ 500 ul der voräquilibriert Kulturmedien, um es (aus dem 6-Well-Platte). </li><li> Unmittelbar Übertragung der Probe in die 6-well-Platte mit Endvolumen von 1,5 ml pro Vertiefung. Die Zellen sind entweder in gemischten Populationen oder separat beschichtet werden, für die Kontrollen. </li></ol> Transfektion Methode 2 (Qiagen Effectene Transfektion für die Zell-Linien) <ol><li> Bereiten Transfektionskomplexe mit dem Qiagen Effectene Reagenz, indem man zunächst 0,8 ug jedes Plasmid-DNA-Probe zu 200 ul EC-Puffer. </li><li> Add 6,4 ul-Enhancer-Reagenz zu jeder Probe, kurz mischen Dazu den Schlauch, und inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Add 20 uL Effectene Reagenz zu jeder Probe, mischen durch flicking das Rohr, und Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Während dieser Inkubation, bereiten sich die beiden Zelllinien von Interesse für die Transfektion. Wash kürzlich passagiert Zellen (&lt;80% Konfluenz) einmal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Fügen Sie wieder 1,5 ml frisch aufgewärmt und äquilibriert Wachstumsmedium (in diesem Fall Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% fötalem Rinderserum (FBS)). </li><li> Nach der Transfektion Komplexe für 15 Minuten inkubiert, Übertragung 1,2 ml Medium zu jeder Probe. Mix durch Pipettieren und sofort in die ~ 700 ul der Komplexe zu jedem der beiden Brunnen in der 6-Well-Platte. Fügen Sie tropfenweise zugeben und durch sanft durch Schwenken der Platte. Lassen Zellen für mindestens 3 Stunden transfizieren (kann mit Zelltyp variieren). </li><li> Add sterilisiert Deckgläser, um eine neue 6-well-Platte. Deckgläser kann für eine verbesserte Zelladhäsion beschichtet werden. </li><li> Nachdem die Zellen transfiziert wurden, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und Ernte der Zellen durch minimale trysinization durch Zugabe von ca. 100 ul Trypsin-Lösung in jede Vertiefung, kurz Schütteln der Platte voll Fell jede Vertiefung, und sofort Absaugen der Trypsin. Sobald die Zellen angehoben haben, fügen Sie 1,5 ml frisches Medium. </li><li> An diesem Punkt sollten die Zellen entweder in gemischten oder getrennten Populationen (für Kontrollen) auf die sterile Deckgläser plattiert werden. </li><li> Lassen Zellen für 12 Stunden zu erholen. </li></ol> 2. Zellverschmelzung <ol><li> Entfernen Kulturmedien aus den Zellen und waschen zweimal mit PBS. </li><li> An dieser Stelle empfiehlt es sich, die Zellen mit Cycloheximid (100 ug / mL) zu behandeln, um die Proteinsynthese zu hemmen. Lassen Sie die Zellen für 2 Stunden inkubiert und dann waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. </li><li> Fuse-Zellen indem sie zu einer Lösung von 50% Polyethylenglykol 1000 (PEG 1000) in serumfreiem DMEM für 125 Sekunden bei Raumtemperatur. </li><li> Wash-Zellen mit PBS, die PEG 1000-Lösung zu entfernen, und fügen Sie 2 mL frisch aufgewärmt und äquilibriert Medien. </li><li> Lassen Zellen für 18 inkubieren - 24 Stunden. </li></ol> Fluoreszenz-Mikroskopie <ol><li> Entfernen Sie den Kulturmedien, und waschen Sie die Zellen zweimal in PBS. </li><li> Fix-Zellen durch Zugabe von 1 ml einer 4% Paraformaldehyd-Lösung (in PBS) in jede Vertiefung. Vorsichtig für 15 Minuten rühren. </li><li> Waschen Sie die fixierten Zellen zweimal in PBS. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser von der Platte, überschüssiges PBS Docht. Invert auf Objektträger geladen mit einem Tropfen Eindeckmedium (90% Glycerin, 100 mM Tris pH 7,5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-Oktan) mit DAPI (4 ',6-Diamino-2-phenylindole). </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium vom Rutschen und Dichtung cover rutscht mit Nagellack. </li><li> Visualisieren Sie die Zellen über konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt ein Beispiel heterokaryon Experiment mit primären Fibroblasten und H1299 nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom-Zellen. Das Protein von Interesse in diesem Experiment (Chicken Anämie Virus-VP3) zeigt in erster Linie zytoplasmatische Lokalisation im primären Zelltypen und nukleare Lokalisation in transformierten Zelltypen wie visualisiert Epifluoreszenzmikroskopie. Das Protein wird als Fusionsprotein entweder GFP (pEGFP-N1-Vektor, Clontech) in primären Vorhaut-Fibroblasten (PFF) oder dsRed (dsRed-N1-Vektor, Clontech) in H1299-Zellen exprimiert. Kontrollproben mit Selbst-Fusionen (obere zwei Zeilen) angezeigt mehrkernige Zellen ohne Veränderung der Steady-State-Lokalisierungs-Muster. Solche Veränderungen könnten sonst entstehen durch Sensibilität für Fusion Bedingungen oder die Bildung von Syncytien. Heterokaryon Fusionen (untere Reihe) zeigen nuklearen Eingabe der GFP-fusionierten primäre cell-derived Protein und Kolokalisation mit dem dsRed-Fusionsprotein in Reaktion auf die Einführung von transformierten Zellmaterial. Das gezeigte Beispiel ist eine relativ seltene heterokaryon Fusion aus nur zwei Zellen, eine von jeder Art, wie durch die Anwesenheit der beiden Fluorprotein Signale gezeigt. Neben der Erkennung dieser Art von Lokalisierungs-Übergänge, kann nukleozytoplasmatischen pendelt Aktivität leicht durch die Anwesenheit eines einzigen Fluorophor in beide Kerne erkannt werden. Dieser Typ der Bestimmung ist klar, bei der Prüfung 01.01 Zelle Fusionen und würde auf der Hemmung der Translation abhängig. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ablaufschema der heterokaryon Methode unter Verwendung von primären Fibroblasten und H1299 non-small cell carcinoma-Zellen. Das Gen von Interesse ist geklont, um eine in-frame Fusion zu einem von zwei fluoreszierende Protein-Gene zu erzeugen. Zelllinien werden dann vorübergehend mit entweder Konstrukt transfiziert und erlaubte sich zu erholen. Heterokaryon Bildung wird durch eine kurze Behandlung mit Polyethylenglykol (PEG) durch weitere Inkubation induziert. Schließlich ist die sub-zelluläre Lokalisation des Proteins von Interesse beobachtet mit verschiedenen Formen der Fluoreszenz-Mikroskopie. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Nukleozytoplasmatischen Menschenhandel und pendelt Aktivität der Hühner Anämie Virus VP3 Protein visualisiert heterokaryon Fusion. Obere Reihe: Repräsentative Bilder selbst verschmolzen H1299 Zellen, dsRed-VP3 Mittlere Reihe:.. Vertreter Epifluoreszenz Bilder von primären Vorhaut-Fibroblasten-Zellen (PFF), die GFP-VP3 nach PEG Fusion Untere Reihe: Heterokaryon Fusion von PFF und H1299 Zellen. Gelb bedeutet Kolokalisation von GFP und DsRed-Signale. Die Zellen wurden aufgenommen mit einem Leica AF6000E Fluoreszenzmikroskop Leica und Imaging-Software.

<ol><li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li>
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<li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP%2FNXF1%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li>
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<li>Lin, X. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RXR%CE%B1+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li>
<li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li>
<li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li>
</ol>

Die heterokaryon Protokoll hier vorgestellten bietet eine effiziente und leicht interpretierbare Methode für die Charakterisierung von Zelltyp-spezifische Lokalisation Verhalten sowie nukleozytoplasmatischen pendelt Aktivität. Diese Methode nutzt die Empfindlichkeit des Fluoreszenz-Analyse sowie die Fähigkeit, Bilder lebender Zellen und führen Studien von Protein Dynamik. Die Technik ist einfach für viele verschiedene Zelltypen angepasst und ist zugänglich sowohl live als auch feste Cell Imaging. Zum Beispiel kann invertiert Fluoreszenzmikroskopie für Live-Imaging-und Zeitraffer-Video-Capture verwendet werden. Im Gegensatz dazu kann montiert Zellen entweder Epifluoreszenzmikroskopie zur Bestimmung der steady-state Lokalisierungen oder detailliertere konfokale Bildgebung von diskreten Lokalisierungen verwendet werden. Darüber hinaus können Techniken wie die Fluoreszenz-Erholung nach Ausbleichen (FRAP), oder Fluoreszenz Verlust in photobleaching (FLIP) bei der Bestimmung der Lokalisierung Kinetik 1 verwendet werden. Die Einbindung von alternativen Fluorophoren in das Protokoll wäre für Protein-Wechselwirkung Experimente wie Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) in concert 2 durchgeführt werden können. Verschiedene Inhibitoren von zellulären Menschenhandel wie Leptomycin B oder dominant negative Ran GTPase Konstrukte verwendet werden, um die Abhängigkeit von bestimmten Ein-oder Ausfuhr Wege 5,6,9 etablieren. <ul><li> In bestimmten Experimenten mit Pendeln Aktivität, muss darauf geachtet werden Lokalisierung Effekte durch die Synthese neuer Proteine ​​zu vermeiden. In diesen Fällen müssen Übersetzung Inhibitoren oder zeitlich begrenzt benutzt werden können. Dennoch bleiben Artefakte durch Inhibition der Translation eine Möglichkeit. Zellfusionen mit einer jeden Zelltyp sind die meisten für eine klare Interpretation der Shuttle-und Lokalisierungs-Verhalten gewünscht. Optimierung der Zellzahl und Fusion Bedingungen (Timing und Konzentration) kann es notwendig sein, um so günstige 1.01 Fusion Veranstaltungen zu fördern. </li><li> Es ist wichtig, dass die Optimierung bestimmter Schritte in das Protokoll wird notwendig sein, abhängig von der jeweiligen Zelltypen verwendet beachten. Aspekte in der experimentellen Verfahren wie Fusion Effizienz, Transfektionseffizienz und Lebensfähigkeit nach der Fusion kann stark variieren zwischen Zelltypen. Insbesondere können primäre Zelltypen eine Herausforderung für die Verwaltung aufgrund der komplexen Kultur und niedrige Transfektionseffizienz. Einsatz von Technologien wie der Lonza Nucleofector Gerät kann für die schnelle Verarbeitung von Zellen sowie drastisch erhöht Transfektionseffizienz zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglichen Elektroporation Methoden für die einfache Übertragung von Zellen in Suspension zur Fusion Schritte, die folgen. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Effectene-Reagenz</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023602</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modifiziertes Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td>Hohes Glukose</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone-Serum (fetales Rinderserum)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6-Loch-Platten</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>528875-25GM</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2522-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector HDF-Kit</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

heterokaryon technik zur analyse von zelltyp-spezifischen localization

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Eine beträchtliche Anzahl von Proteinen durch subzelluläre Menschenhandel oder nucleocytolasmic pendelt geregelt. Diese Proteine ​​zeigen eine Vielfalt von zellulären Funktionen, einschließlich nuklearer Import / Export von RNA und Protein, Regulation der Transkription und Apoptose. Interessanterweise wichtigen zellulären Reorganisationen einschließlich Zellteilung, Differenzierung und Transformation, oft mit solchen Aktivitäten 3,4,8,10. Die detaillierte Untersuchung dieser Proteine ​​und ihre jeweiligen Regulationsmechanismen kann als Anregung für diese Lokalisierung Veränderungen können schwer zu fassen, und die Bewegungen selbst recht dynamisch und schwer zu verfolgen, kann eine Herausforderung. Studien mit zellulären Onkogenese, zum Beispiel weiterhin von Verständnis Wege-und Protein-Aktivitäten, die zwischen normalen primären Zellen und transformierten Zellen 6,7,11,12 unterscheiden profitieren. Da viele Proteine ​​zeigen veränderte Lokalisation während der Transformation oder als Ergebnis der Transformation, Methoden zur effizienten Charakterisierung dieser Proteine ​​und die Wege, in denen sie sich beteiligen, stehen für das Verständnis der Onkogenese und neue Bereiche für Drug Targeting zu verbessern. Hier präsentieren wir eine Methode zur Analyse von Protein-Handel und pendelt Aktivität zwischen Primär-und transformierter Säugetierzellen. Diese Methode kombiniert die Erzeugung von heterokaryon Fusionen mit Fluoreszenzmikroskopie zu einem flexiblen Protokoll, mit dem steady-state oder dynamischen Protein-Lokalisierungen erkennen werden können. Wie in Abbildung 1 gezeigt, sind zwei getrennte Zelltypen transient mit Plasmid-Konstrukte die mit einem Fluorprotein Gens an das Gen von Interesse transfiziert. Nach Expression werden die Zellen verschmolzen unter Verwendung von Polyethylenglykol, und Protein-Lokalisation kann dann aufgenommen mit einer Vielzahl von Methoden. Das Protokoll hier vorgestellten ist ein grundlegendes Konzept, um die speziellen Techniken hinzugefügt werden kann.

Eine flexible und effiziente Verfahren zur Charakterisierung von Zelltyp-spezifische Protein-Lokalisierung und nukleozytoplasmatischen pendelt beschrieben. Dieser Ansatz nutzt heterokaryon fluoreszenzmarkierten Fusionsproteinen Bild Protein Lokalisierungen nach Zellfusion. Das Protokoll ist offen für Steady-State-Lokalisierungen oder mehrere dynamische Bestimmungen auf Live Cell Imaging basiert.

Heterokaryon Technik zur Analyse von Zelltyp-spezifischen Localization

Eine beträchtliche Anzahl von Proteinen wird durch subzellulären Transport oder nukleozytoplasmatisches Shuttling reguliert. Diese Proteine weisen eine vielfältige Palette an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Bewegung von Proteinen zu verfolgen, indem ein einzelnes Protein, das zwei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe trägt, in zwei getrennten Zelllinien exprimiert und diese Zelllinien anschließend miteinander fusioniert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Plasmide, die das Gen der gewünschten Proteine, jeweils fusioniert mit einem von zwei verschiedenen Fluoreszenzprotein-Genen, in zwei verschiedene Zelltypen transfiziert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen zu vermischen und jedem Zelltyp die Anreicherung des Proteins zu ermöglichen.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Proteinsynthese zu hemmen und anschließend die Zellen mittels Polyethylenglykol zu fusionieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Visualisierung der Proteinlokalisation mittels Fluoreszenzmikroskopie. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Fluoreszenzmikroskopie eine Veränderung der Proteinlokalisation oder des Transportverhaltens zeigen.Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsbiologie zu beantworten, beispielsweise wie sich spezifische Proteinfunktionen und -verhalten verändern, während Zellen transformiert werden. Obwohl diese Methode Einblicke in zellspezifische Veränderungen während der Transformation ermöglicht, kann sie ebenfalls auf andere Untersuchungen angewendet werden, wie beispielsweise Zellunterscheidung, Entwicklungsbiologie und Zellsignalgebung.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Optimierung der Transfektionsbedingungen sowie der Fusionsbedingungen für jeden unterschiedlichen Zelltyp erforderlich ist. Die erste in diesem Protokoll demonstrierte Methode zur Einführung von Plasmid-DNA in Zellen ist die NU Nuclear Affection-Methode, bei der die Lonza Nuclear Effector-Lösung verwendet wird, um kürzlich passagierte Zellen, die sich im logischen Wachstum befinden, mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zu waschen und sie durch Zentrifugation zu gewinnen. Sobald die Zellen ihre Anhaftung verloren haben, neutralisieren Sie die Trypsin-Behandlung durch Zugabe von Medium, das Serum enthält, und sammeln die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 ×g für fünf Minuten, während die Zellen zentrifugiert werden.Geben Sie sterilisierte Deckgläser in eine sechsfach aufgeteilte Platte im Gewebekulturhaubenraum, dann pipettieren Sie 1,5 Milliliter vollständiges Kulturmedium in jede Vertiefung. Decken Sie die Platte ab und stellen Sie sie in den Zellkultur-Inkubator, um sie zu äquilibrieren.Nach der Zentrifugation die Röhrchen in die Haube bringen, den Überstand absaugen und die Zellpellets in einem minimalen Volumen PBS resuspendieren. Anschließend die Zellen zählen und das Volumen der Zellsuspension auf sterile Mikrozentrifugenröhrchen aufteilen. Dies ergibt etwa fünf mal 10 hoch fünf Zellen pro Probe; erneut bei 1500 ×g für fünf Minuten zentrifugieren.Nach Abschluss der Zentrifugation die Röhrchen in die Zellkulturfume bringen, die SNA abpipettieren und die Zellen vorsichtig resuspendieren. Suspendieren Sie die Zellen in jedem Röhrchen mit 100 Mikrolitern nukleärer Effektorlösung bei Raumtemperatur. Geben Sie dann fünf Mikrogramm Plasmadna zu jeder Probe hinzu und überführen Sie die Probe in eine nukleäre Effektor-Q-Vete, und decken Sie sie ab.Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Führen Sie die Probenkvette in den Qvet-Halter ein. Wählen Sie das geeignete Kernresonanz-Programm aus und starten Sie es.Die Auswahl des am besten geeigneten Programms erfordert möglicherweise vorherige Tests, um eine optimale Transfektionseffizienz bei minimaler Sterblichkeit zu gewährleisten. Anschließend die Zellen entweder als gemischte Populationen oder separat als Kontrollen in die 6-Loch-Platte aussäen. Die Platte zurück in den Inkubator stellen und die Zellen 12 Stunden lang regenerieren lassen.Die zweite Methode zur transienten Expression von Plasmiden ist die Transfektion mit einem kagenwirksamen Reagenz. Geben Sie zunächst 0,8 Mikrogramm jeder Plasmid-DNA-Probe zu 200 Mikrolitern EC-Puffer in einem sterilen Zentrifagenröhrchen. Fügen Sie dann 6,4 Mikroliter Enhancer-Reagenz zu jeder Probe hinzu.Verquirlen Sie kurz durch leichtes Anstoßen des Röhrchens und inkubieren Sie zwei Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie nach dieser kurzen Inkubation 20 Mikroliter Wirkstoffreagenz zu jeder Probe hinzu. Vermischen Sie jedes Röhrchen durch leichtes Anstoßen und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.Während der Inkubation bereiten Sie die beiden Zelllinien vor, die im Experiment verwendet werden sollen. Für die Transfektion sollten die Zellen kürzlich passagiert worden sein und sich im logarithmischen Wachstum bei etwa 80 % Konfluenz befinden. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und geben Sie 1,5 Milliliter frisches DMEM mit 10 % FBS zurück.Nachdem die DNA-Transfektionsreagenzien 15 Minuten lang inkubiert wurden, geben Sie 1,2 Milliliter DMEM mit 10 % FBS-Medium zu jeder Probe hinzu, mischen Sie durch Pipettieren und übertragen Sie sofort etwa 700 Mikroliter der Komplexe tropfenweise auf jeweils zwei Vertiefungen. In der 6-Loch-Platte mischen Sie durch Schwenken der Platte. Lassen Sie die Zellen mindestens drei Stunden im Inkubator im Zellkulturschrank transfizieren und geben Sie gegebenenfalls je einen sterilisierten Deckgläser pro Vertiefung in eine 6-Loch-Platte.Beschichtete Deckgläser können verwendet werden, um die Zelladhäsion zu verbessern. Waschen Sie die transfizierten Zellen anschließend zweimal mit PBS und gewinnen Sie die Zellen durch minimale Trypsinisierung. Dies wird erreicht, indem 100 Mikroliter Trypsinlösung zu jedem Well gegeben und die Platte geschwenkt werden, um eine vollständige Benetzung sicherzustellen.Danach sofort den restlichen Trypsin abpipettieren. Den verbleibenden Trypsin durch Resuspendieren der Zellen in 1,5 Milliliter frischem DMEM mit 10 % FBS neutralisieren und die Zellen entweder als gemischte Populationen oder getrennt als Kontrollen ansäen. In der 6-Loch-Platte mit Deckgläsern die Zellen 12 Stunden lang im Zellkultur-Inkubator regenerieren lassen.Unabhängig von der Transfektionsmethode ist das Verfahren zur Erzeugung von heterologen Partikeln identisch. Nach der Transfektion entfernen Sie das Kulturmedium aus den Vertiefungen und waschen die Zellen zweimal mit PBS. Anschließend wird empfohlen, die Zellen mit Cycloheximid zu behandeln, um die weitere Proteinsynthese zu hemmen.Fügen Sie Cycloheide in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter in Kulturmedium hinzu, um die Zellen zu bedecken, und inkubieren Sie zwei Stunden im Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie nach zwei Stunden die Zellen aus dem Inkubator und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Um die Fusion einzuleiten, bedecken Sie die Zellen mit einer Lösung aus 50 % Polyethylenglykol 1000 in serumfreiem DMEM und inkubieren Sie 125 Sekunden lang.Entfernen Sie bei Raumtemperatur die PEG-Lösung und waschen Sie die Zellen mit PBS, um restliches PEG zu entfernen. Geben Sie dann zwei Milliliter DMEM mit 10 % FBS, die auf 37 Grad Celsius erwärmt wurden, hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 18 bis 24 Stunden im Zellkultur-Inkubator.Nach der 18 bis 24-stündigen Inkubation entnehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und waschen die Zellen zweimal mit PBS. Danach pipettieren Sie je ein Milliliter 4 % Paraformaldehyd in PBS in jedes Loch und schwenken vorsichtig für 15 Minuten.Während der Inkubation bereiten Sie die Mikroskopobjektträger vor, indem Sie einen einzelnen Tropfen Einbettmedium, das dpi enthält, hinzufügen. Waschen Sie die fixierten Zellen anschließend zweimal mit PBS und entfernen Sie vorsichtig jede Deckglasabdeckung mit einer kleinen Pinzette. Entfernen Sie restliches PBS durch Andrücken an ein Stück Papier, bevor Sie das Deckglas mit der Zellseite nach unten auf einen Mikroskopobjektträger mit Einbettmedium plus tappi legen.Entfernen Sie das überschüssige Eindeckmedium vom Objektträger mit einem Tuch und versiegeln Sie die Ränder der Deckgläser. Mit Nagellack können die Zellen nun mittels konfokaler oder epifluoreszenzmikroskopischer Bildgebung sichtbar gemacht werden. In diesem Flussdiagramm ist die Heteromethode zur Analyse der zelltypspezifischen Lokalisation von Proteinen in drei grundlegenden Schritten dargestellt.Transfektion des Plasmids, das ein fluoreszenzmarkiertes Protein exprimiert, Zellfusion mit Polyethylenglykol 1000 und fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, wie in diesen Epi-Fluoreszenzbildern zu sehen ist: Primäre Vorhautfibroblasten, Selbstfusionskontrollen, die das mit GFP markierte VP3-Protein des Hühneranämievirus exprimieren, zeigen hauptsächlich zytoplasmatische Lokalisation des Proteins in der nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomlinie H 1299. Selbstfusionskontrollen mit dem gleichen VP3-Protein, das mit DS.RED markiert ist, zeigen hauptsächlich nukleäre Lokalisation. Die heterogene Zellfusion von primären Vorhautfibroblasten und H 1299-Zellen führt zur Aufnahme transformierten Zellmaterials in die primären Vorhautfibroblasten und bewirkt eine Veränderung der Lokalisation des mit GFP markierten, aus primären Zellen stammenden VP3-Proteins in den Zellkern.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass der Erfolg stark von der Transfektionseffizienz in den verwendeten Zelltypen sowie von der Optimierung der Fusionsbedingungen für diese speziellen Zellen abhängt. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Flip und FRAP angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen im Zusammenhang mit der Echtzeitanalyse von Lokalisationsdynamiken zu beantworten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zelltypspezifische Proteinlokalisationen bewertet, indem fluoreszenzmarkierte Proteine eingeführt und Zellfusionen erzeugt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Video zeigt eine Methode zur Isolierung intakter Zellkerne aus Glia- und Stammzellen im Hippocampus dentatus Gyrus (DG) der Maus. Das DG-Gewebe wird in einem kalten Homogenisierungspuffer mechanisch dissoziiert, um die Zellkerne freizusetzen. Gewebetrümmer und andere freigesetzte Organellen werden verworfen, und die Zellkerne werden mit einer DNA-Färbung und einem Fluorophor-konjugierten Antikörper gefärbt, der spezifisch für das neuronale nukleäre Antigen (NeuN) ist. Die...

Eine Technik zur Isolierung von Zellkernen aus nicht-neuronalen Zellen im Gyrus dentatus des Hippocampus

Wir beschreiben eine robuste und vielseitige Protokoll zur Analyse von 3D-Kern Architektur DNA FISH mit direkt markierten fluoreszierenden Sonden.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

Drosophila-Gewebe enthalten häufig eine heterogene Mischung von Zelltypen. Um die Genexpression in spezifischen Zelltypen aus einem bestimmten Gewebe zu untersuchen, können Keime genetisch markiert und anschließend mit einer Affinität-basierten Ansatz isoliert. Isolierte Kerne für nachgelagerte Anwendungen wie Genexpressionsanalyse und Chromatinimmunpräzipitation verwendet werden.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Tücher für Genexpressionsanalyse

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Technik zu verwenden, um bestimmte Arten von Nervenzellen für die anschließende Analyse der zelltypspezifischen Genexpression, epigenetischen Markern und/oder Proteinexpression zu sortieren.

Mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung die zelltypspezifische Genexpression im Hirngewebe von Ratten untersuchen

Hier berichten wir über Protokolle zum Nachweis endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen und quantifizieren diese Proteinspiegel an Zentromeren-Kinetochoren durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung durch Verwendung von Fixierung (Paraformaldehyd-, Aceton- oder Methanol-Fixierung).

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

Hier präsentieren wir einen kombinatorischen Ansatz zur Klassifizierung von neuronalen Zelltypen vor der Isolierung und für die anschließende Charakterisierung von einzelligen Transkriptomen. Dieses Protokoll optimiert die Probenvorbereitung für eine erfolgreiche RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und beschreibt eine Methodik, die speziell für das verbesserte Verständnis der zellulären Vielfalt entwickelt wurde.

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und bequeme Methode zum Beschriften und visualisieren live Chromosomen in mitotischen Zellen mit Histone2B-GFP BacMam 2.0-Gütezeichen und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskopie System.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die multi-Color Lokalisierung der einzelnen Membranproteine in Organellen der lebenden Zellen. Um Fluorophore zu befestigen, sind selbst Kennzeichnung Proteine verwendet. Proteine, befindet sich in verschiedenen Membranen Kompartimenten des die gleichen Organellen lokalisiert werden können, mit einer Genauigkeit von ~ 18 nm.

Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen

Bulk-gen Ausdruck Messungen Wolke Einzelzelle Unterschiede in heterogenen Zellpopulationen. Hier beschreiben wir ein Protokoll wie einzellige gen Expressionsanalyse und Index Sortierung durch die Blüte aktiviert Zelle sortieren (FACS) kann kombiniert werden, um die Heterogenität zu umreißen und immunophenotypisch charakterisieren molekular unterschiedliche Zellpopulationen.

Eine kombinatorische einzellige Ansatz zur molekularen Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität der menschlichen Stammzellen und Vorläuferzellen Populationen

Wir präsentieren ein dreifarbiges Chromatin-Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie-(SMLM)-Färbungs- und Analyseverfahren, das eine reproduzierbare Abbildung von Euchromatin, Heterochromatin und RNAP II für die räumliche Analyse ermöglicht. Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente mehrfarbige Markierung in dichten nuklearen Umgebungen, einschließlich chromatinassoziierter Ziele, und ermöglicht eine zuverlässige gleichzeitige Erkennung.

Ein mehrschichtiges Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopieprotokoll zur Untersuchung von Chromatin in der dichten Kernumgebung

Wir berichten über ein DNA-FISH-Metaphasen-Spread-Protokoll, das die Locus-Kopiennummer und -Position im Genom visuell erkennt. Dieser Ansatz ermöglicht die Einzelzellauflösung von Amplifikationszuständen, insbesondere in Krebszelllinien mit extrachromosomaler DNA und homogen gefärbten Regionen.

Die DNA-FISH-Metaphase breitet sich aus, um extrachromosomale DNA von homogen färbenden Regionen in menschlichen Krebszelllinien zu unterscheiden

Lernen Sie die Heterokaryon-Technik zur Analyse zelltyp-spezifischer Proteinlokalisierung und nukleozytoplasmatischen Shuttling mittels Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in Krebsbiologie und Zellverhalten.

Heterokaryon Technik zur Analyse von Zelltyp-spezifischen Localization

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