Elektrophysiologische Messungen von einer Moth Riechsystem

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die einfache Aufzeichnung olfaktorischer Reaktionen aus dem Nervensystem von Insekten zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem man einen lebenden Schmetterling fixiert und Elektroden an der Antenne oder an einem einzelnen Neuron befestigt, um auf Duftstoffe zurückgehende Reaktionen aufzuzeichnen. Als erster Schritt wird eine mit Salzlösung gefüllte Glaselektrode in das Auge eingestochen, um eine Erdung zu schaffen, und als zweiter Schritt wird einer der fixierten Schmetterlinge in eine mit Salzlösung gefüllte Glaselektrode eingeführt, wodurch die Aufzeichnung elektrischer Reaktionen in Form eines Antennengramms zur Erfassung von Einzelzellantworten aus einem olfaktorischen Rezeptorneuron ermöglicht wird.

Die Ableitelektrode wird an der Basis einer Sonne eingeführt. Anschließend wird das Antennensignal verstärkt und einem Analog-Digital-Wandler zugeführt, um die Signale aufzuzeichnen und zu speichern. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen dosisabhängige, durch Duftstoffe hervorgerufene Antworten, die auf dem aufgezeichneten elektrischen Signal in Form eines EAG-Signals oder eines Spikes basieren.

Wir haben eine neue Methode zur Ableitung des Enterogramms von der fixierten lebenden Motte der Naval-Orange entwickelt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Präparation lange hält und dieselbe Motte mehrfach zur Aufzeichnung mehrerer Antworten verwendet werden kann; zudem kann dieselbe Motte auch zur Aufzeichnung von Einzelzellantworten von einem einzelnen Sensor des Antennens verwendet werden. Wir konzentrieren uns auf die Naval-Orange, da sie eine wichtige landwirtschaftliche Kulturpflanze in Kalifornien ist.

Diese Methode kann jedoch auch für andere Epi-Dotter-Insekten verwendet werden, nicht nur, um grundlegende Fragen zur alten Funktion zu beantworten, sondern auch zur Entwicklung neuer Lockstoffe. Diese Untersuchung des olfaktorischen Systems von Motten verwendet die Navelschabe. Ullo Ella.

Die Insektenkolonie wird in Umweltkammern bei etwa 28 Grad Celsius, etwa 75 % relativer Luftfeuchtigkeit und unter einem 16- zu 8-Stunden-Licht-Dunkel-Photoperioden mit einer Weizengrießdiät gehalten. Stellen Sie Behälter für frisch geschlüpfte Motten bereit, indem Sie bis zu 10 Lagen mit Wasser getränkter Papiertücher in eine Plastikbox legen. Sammeln und bestimmen Sie täglich das Geschlecht der schlüpfenden Motten und überführen Sie sie anschließend in die Plastikbox. Decken Sie die Box mit einem perforierten Deckel ab, um Luftzirkulation zu ermöglichen, um die elektrophysiologischen Ableitungen vorzubereiten.

Stellen Sie zunächst einen Halter für den Schmetterling her, indem Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze so abschneiden, dass der Durchmesser der Spitze etwa zwei Millimeter beträgt. Wählen Sie für EAG oder SSR einen Schmetterling, der zwei bis vier Tage nach dem Schlüpfen ist. Führen Sie den Schmetterling mit einem befeuchteten Papiertupfer von der dem Spitzenende gegenüberliegenden Seite in die Pipettenspitze ein und schieben Sie ihn vorsichtig in Richtung der Pipettenspitze.

Drücken Sie den Schmetterling weiter, bis die Antennen und ein Teil des Kopfes aus der Spitze hervortreten. Fixieren Sie den freiliegenden Kopf, indem Sie ihn mit einer nicht austrocknenden Tonmasse bedecken, wobei ein kleiner Teil eines Auges und die beiden Antennen frei bleiben. Stellen Sie die Schmetterlingspräparation auf die Plattform des Elektrogramm-Mikromanipulators zwischen die beiden Elektrodenhalter und verwenden Sie Glas-Mikroelektroden mit einer Spitzenöffnung von weniger als einem Mikrometer. Befüllen Sie die Elektroden rückwärts mit Centum-Limb-Ringer-Lösung.

Sehen Sie durch das Mikroskop und penetrieren Sie den freigelegten Augenbereich mit einer Elektrode. Diese dient als Referenzelektrode. Als nächster Schritt werden Ableitelektroden auf den Antennen platziert.

Das Antennenorgan des männlichen Orangewurmmottens ist mehrsegmentiert, und jedes Segment ist mit einer Vielzahl haarähnlicher Strukturen besetzt. Die Illa, im Einzelbild dargestellt, ist ein Rasterelektronenmikrogramm, das Details der Illa zeigt, um die Ableitung von Signalen aus den Antennen zu erleichtern. Schneiden Sie das distale eine bis zwei tenale Segmente ab.

Als Nächstes werden beide Antennen in die Ableitelektrode eingeführt. Alternativ dazu wird für die Ableitung von einem einzelnen Sensillum die Ableitelektrode an der Basis eines Sensillums platziert. Die Aktionspotentiale des Sensillums werden mittels eines hochohmigen Vorverstärkers verstärkt und über einen intelligenten USB-Digital-Analog-Wandler geleitet, um anschließend offline mit der Autos-Spike-Software analysiert zu werden.

Der nächste Schritt besteht darin, den chemischen Reizstoff mithilfe von ZZ 1113 HEXA deca Now vorzubereiten, einem Hauptbestandteil des Pheromon-Gemischs des Orangenbaum-Kernbohrers, indem die Chemikalie mit Hexan verdünnt wird, um DIC-Verdünnungen herzustellen. Geben Sie 10 Mikroliter einer Stimuluslösung mittels einer Eloqua-Pipette auf ein Watman-Filterpapier. Entfernen Sie das Lösungsmittel durch vorsichtiges Schütteln für 10 Sekunden.

Unter einem Abzug den Streifen in eine fünf Milliliter fassende Polypropylen-Spritze geben, als Kontrolle jeweils nur Hexan und eine leere Spritze zur Vorbereitung verwenden. EAG oder SSR werden in einem befeuchteten Luftstrom gehalten, der vom Stimulationskontroller mit 20 Millilitern pro Sekunde bereitgestellt wird. Die Spritze, die den chemischen Reizstoff enthält, an den Luftstromkontroller anschließen.

Registrieren Sie zwei Sekunden lang elektrische Basissignale. Geben Sie dann einen 500 Millisekunden langen Stimulusimpuls von vier Millilitern pro Sekunde in den Luftstrom. Setzen Sie die Aufzeichnung der elektrischen Signale weitere acht Sekunden fort.

Warten Sie mindestens eine Minute zwischen den Stimuli. Diese Abbildung zeigt eine starke dosisabhängige Antwort der Antennen eines fixierten männlichen Mottes. Stimuliert mit der weiblichen Pheromonkomponente, CZ 1113 hexaco.

Die Reaktion auf Hexan. Die Fahrzeugkontrolle wird nacheinander durch die blaue Linie dargestellt. Größere Dosen des Pheromons erzeugen nacheinander größere Elektrogrammaufzeichnungen.

Diese Abbildung zeigt extrazelluläre Einzelzellableitungen von einem Trichum als Reaktion auf die Stimulation durch eine weibliche Pheromonkomponente. Diese Ableitungen zeigen eine dosisabhängige exzitatorische Antwort. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie in einigen Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.

Bei Verwendung dieser Methode ist darauf zu achten, Kontaminationen zu vermeiden und Chemikalien so rein wie möglich zu verwenden.