Name: Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Lebensdauer von Caenorhabditis elegans in 96-Well-Mikrotiterplatten messen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Identifizierung von Substanzen, die die Lebensdauer verlängern.

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Dieses Protokoll wurde ursprünglich auf Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle durch Xiaolan Ye und Michael Petrascheck entwickelt im Labor von Linda Buck. Die ausführliche Version über wurde erstellt, um das gesamte Verfahren zur Verfügung, um der größeren Gemeinschaft zu machen. Wir bedanken uns bei Carol Taylor, Sarah LeBoeuf und Andy Tomacelli für die kritische Durchsicht des Protokolls. Dies ist Manuskript # 2866 von The Scripps Research Institute. Die Petrascheck Lab wird von der Novartis ADI-Programm finanziert.

Überblick: Das Protokoll ist in vier Teile aufgeteilt. Teil 1 beschreibt, wie die Fütterung Bakterien vorbereiten. Teil 2 beschreibt, wie der Wurm Kultur vorzubereiten. Teil 3 beschreibt die Lebensdauer des Gastes. Teil 4 zeigt einige repräsentative Ergebnisse, und Teil 5 beschreibt, wie die erforderlichen Lösungen herzustellen. Lebensdauer Experimente dauern mehrere Wochen in Anspruch. Für jeden Schritt des Protokolls Woche, Tag und Uhrzeit des Tages aufgenommen, um die Planung zu erleichtern. Die L4 Stadium (Tag 0) wird als Bezugspunkt für das gesamte Protokoll verwendet. 1. Vorbereitung der Fütterung Bakterien Dieser Abschnitt beschreibt die Vorbereitung der Fütterung Bakterien. Die spezifische E. coli-Stamm verwendet, um C.elegans feed heißt OP50. Vor diesem Protokoll, um eine Kreuzkontamination der Wurm Kultur mit anderen Bakterien zu verhindern, hat die OP50 Belastung gemacht Carbenicillin / Ampicillin resistent 21. Bereiten Sie das OP50 vier vor fünf Tage im Voraus. Alle Materialien in Kontakt kommen mit OP50 müssen steril sein. Tag -7: Donnerstag (Woche 1): Impfen 5 ml TB mit 100 ug / ml Ampicillin und 0,1 ug / ml Amphotericin B mit einem OP50 Kolonie und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einem bakteriellen Schüttler. Tag -6: Freitag (Woche 1). Morgen 8:30 Uhr. Impfen früh, um genügend Zeit für die Kultur bis zur Sättigung zu erreichen <ol><li> Verdünnen Sie die Nacht-Kultur von OP50 1:2000 in 300 ml TB mit 50 ug / ml Ampicillin. Inkubieren Sie die Kultur in einem bakteriellen Schüttler für 8-12 Stunden bei 37 ° C bis zur Sättigung erreicht ist. Nicht in die Kultur zu wachsen länger als 14 Stunden. </li><li> Übertragen Sie die OP50 in eine sterile, pre-gewichteten Zentrifugenröhrchen. Pellet der OP50 durch Zentrifugation für 10 min bei 3500 rpm (2200 xg) in einer Tischzentrifuge. </li><li> Überstand verwerfen und wieder aussetzen OP50 Pellet in sterilem Wasser und re-Pellet durch Zentrifugation. Wiederholen Sie diesen waschen zweimal. </li><li> Nach dem zweiten Waschen, entfernen Sie sorgfältig alle das restliche Wasser. Darf kein Wasser in die Röhre gelassen werden. Wiegen Sie das Zentrifugenröhrchen mit dem Pellet und subtrahieren das Gewicht des leeren Zentrifugenröhrchen, um das Gewicht der Pellets zu bestimmen. </li><li> Gründlich resuspendieren Sie das Pellet in S-complete zu einer Konzentration von 100 mg / mL. Keine Klumpen überlassen werden sollte. </li><li> Die Konzentration von 100 mg / mL OP50 auf 2 x10 10 Bakterien / ml entsprechen. Verwenden Sie ein Foto-Spektrometer, um die Anzahl der Bakterien pro ml zu bestimmen, ob die Beziehung zwischen der optischen Dichte und der Anzahl der Bakterien pro ml bekannt ist. Falls erforderlich, die Konzentration der OP50 Fütterung Lösung zu 2 x10 10 Bakterien / ml. </li><li> Bewahren Sie die OP50solution bei 4 ° C, bis es für den Wurm Kultur verwendet. </li></ol> 2. Erstellung eines Synchron-Worm Kultur Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung des Wurms Kultur. Sein Ziel ist es, ein Alter-Synchron-Bevölkerung von Würmern zu generieren. Alle Materialien in Kontakt kommen mit C.elegans nach der Bleiche Behandlung in Schritt 5 müssen steril sein. Die Platten werden bei 20 ° C, sofern nicht anders angegeben. Tag -6: Freitag (Woche 1), 04.00 Uhr: Transfer der Tiere auf eine frische Platte <ol><li> Nehmen Sie etwa 5-10 Tage alten NGM Teller, auf dem die Mehrheit der Wurm Bevölkerung besteht aus verhungert L1-Larven. </li><li> Sterilisieren einem Spatel durch kurzes Erhitzen über einem Bunsenbrenner. Lassen Sie sie abkühlen. Verwenden Sie den gekühlten Spatel zum Ausschneiden Agar Stücke von der Platte mit den verhungerten Würmer. Übertragen mehrere dieser Stücke auf eine frische 10 cm NGM-Platte ausgesät mit OP50. Inkubieren für ca.. 65 Stunden bei 20 ° C, bis die Mehrheit der Wurm Bevölkerung besteht aus gravid Erwachsene. Die Zeit, die für die ausgehungerten Tiere L1 in gravid Erwachsenen wachsen kann von Stamm zu Stamm unterschiedlich. </li></ol> Tag -3: Montag (Woche 2) 10.00: Einführung eines synchronen Bevölkerung <ol start="3"><li> Sammeln Sie Würmer aus dem 10 cm Platte durch Waschen Sie die Platte mit 5-10 mL sterilem Wasser. Übertragung der Wurm / Wasser-Lösung in einen 15 mL konischen Rohr. </li><li> Waschen Sie die Würmer durch Zentrifugation 2 min in einer Tischzentrifuge bei 1200 rpm (280 xg). Überstand verwerfen und 10 ml Wasser. Wiederholen. </li><li> Überstand entfernen und 5 ml frisch zubereitete Bleiche / NaOH-Lösung (2,5 ml Bleiche, 1 mL 10 N NaOH, 6,5 mL H 2 O). Inkubieren für 5 Minuten bei RT, bis die Würmer offenen Bruch. Achten Sie darauf, vortexen jede Minute. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion unter dem Binokular. </li><li> Sobald alle Erwachsenen zu lösen, 5 ml M9-Puffer, um die Reaktion zu neutralisieren. </li><li> Waschen Sie die Eier dreimal mit 10 mL M9-Puffer durch Zentrifugation 2 min bei 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Waschen Sie die Eier einmal mit 10 mL S-complete durch Zentrifugation 2 min bei 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Entfernen Sie den Überstand, 10 ml S-complete und die Lösung in ein frisches 50 mL konischen Rohr. 30 ml S-complete, um ein Endvolumen von 40 mL. Schütteln Sie das Rohr über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Kolbenpendel oder ein ähnliches Gerät. </li></ol> Tag -2: Dienstag (Woche 2), 12:00 Uhr: Seed die Tiere in Platten <ol start="10"><li> Unter dem Binokular, zu prüfen, ob die Würmer in der Nacht geschlüpft. Bestimmen Sie die Konzentration von Würmern in der S-Komplettlösung durch Zählen der Anzahl der Würmer in 10 ul Tropfen mit einem Binokular. Graf mindestens 10 Tropfen für jede Probe. </li><li> Re-suspend die Würmer in einer Konzentration von 80-100 Würmer / mL in S-abgeschlossen. Add Carbenicillin (Bestand 100 mg / mL) zu einer Endkonzentration von 50 ug / mL und Amphotericin B (Bestand 250 ug / mL) zu einer Endkonzentration von 0,1 pg / mL. Schütteln auf einem Kolbenpendel. Wenn die Herstellung größerer Mengen von Würmern, verwenden Sie einen 600 mL Nunclon Kolben mit Filterdeckel. </li><li> Am 14.30 Uhr fügen Sie die OP50 in Teil 1 bis zu einer Endkonzentration von 6 mg / mL (= 1,2 x10 9 Bakterien / ml) hergestellt. Senden Sie das OP50 bis 4 ° C. </li><li> Transfer-120 ul der worm/OP50 Lösung in jedes Well einer 96-Well-Platte. Verwenden Sie 96-Well Platten mit transparentem Boden. Vergewissern Sie sich, um die Würmer in der Schwebe zu halten beim Pipettieren. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit einem Tape-Versiegelung auf Kontamination und Verdunstung zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte auf einem Schüttler für 2 min und Inkubation für 2 Tage bei 20 ° C, bis die Tiere die L4 Stadium zu erreichen. </li></ol> Tag 0: Donnerstag (Woche 2) vor dem Mittag: Sterilisieren Tiere, indem Fluordeoxyuridin (FUDR) <ol start="15"><li> Um die Tiere zu sterilisieren add 30 ul einer 0,6 mM FUDR Stammlösung in jede Vertiefung. Dieser Schritt bringt das Endvolumen in jeder Vertiefung zu 150 ul und reduziert die Endkonzentration des OP50 von 6 mg / ml bis 5 mg / mL (1x10 9 Bakterien / ml). Verschließen Sie die Platte mit Klebeband Versiegelungen und schütteln Sie sie für 2-3 min auf einem Schüttler. Wenn das OP50 war um 2:30 am Tag -2 hinzugefügt, ist es wichtig, dass die FUDR vor Mittag wird hinzugefügt. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator </li></ol> Tag 1: Freitag (Woche 2): Fügen Sie Medikamente zur Kultur <ol start="16"><li> Um 9:00 Uhr die meisten der Tiere sollten gravid und enthalten mehrere Eier jeden. Fügen Sie die Medikamente, deren Wirkung auf die Lebensdauer ist in der gewünschten Konzentration getestet werden. Wenn die Auflösung der Drogen in DMSO die Endkonzentrationen von DMSO sollte nicht mehr als 0,6%, wie DMSO-Konzentrationen höher als 0,6% zu verkürzen C.elegans Lebensdauer. Nach Zugabe des Medikaments, dichten die Platten mit Klebeband Versiegelung und schütteln Sie sie für 2-3 min auf einem Schüttler. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator </li><li> Hinzufügen der Medikamente können gelegentlich zu töten ein paar Tiere pro Platte, besonders wenn mit einem anderen Lösungsmittel als Wasser. Verwenden Sie eine inverse Mikroskop für lebende Tiere zu überprüfen. Generell sollte es weniger als 10 tote Tiere pro 96-Well-Platte sein. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator. </li></ol> Tag 4: Montag (Woche 3): Change Versiegelungen <ol start="18"><li> Um frischen Sauerstoff in die Kultur geben entfernen Sie die Versiegelung, warten Sie 1 Minute und verschließen die Platte. Schütteln Sie die Platte für 2-3 Minuten auf einem Schüttler. Wiederholen Sie jede Woche einmal. </li></ol> Tag 5: Dienstag (Woche 3): Add new OP50 zum Verhungern zu verhindern <ol start="19"><li> Add 5 ul der 100 mg / mL OP50-Lösung, die in Teil 1 zu jedem der 96 Löcher, um Hunger zu verhindern, wurde hergestellt. </li></ol> 3. Scoring der Lebensdauer. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie das Überleben der synchronisierten Wurm Bevölkerung von Teil 2 überwacht wird, bis die Tiere starben. Zur Beobachtung der Tiere in den 96-Well-Platten, verwenden Sie einen inversen Mikroskop mit 2x oder 2.5x Ziel. Rekord Überlebensdaten dreimal in der Woche, Montag, Mittwoch und Freitag. Verwenden Bewegung, um festzustellen, ob die Tiere lebend oder tot sind. Starkes Licht, vor allem blaues Licht, induziert die Tiere sich zu bewegen. Entfernen Sie nicht tote Tiere aus dem Test. Gelegentlich kann Tiere, die nicht verschoben hat und tot waren in den vorhergehenden Zählung bestimmt später zu verschieben. <ol><li> Am Tag 0, am Anfang des Experiments zählen die Gesamtzahl der Würmer in jede Vertiefung. Censor Brunnen, die mehr als 18 Tiere aus der Analyse enthalten wie die Tiere in diesen Brunnen nicht mehr genügend OP50 und Effekte der diätetischen Restriktion zeigen. </li><li> Um die Chance, dass die Tiere schütteln den 96-Well-Platte auf einem Schüttler für 2 min bewegen zu erhöhen. vor dem Zählen. </li><li> In jedem Zählen Sitzung record date und Anzahl der Tiere, diebewegen, wie lebende Tiere. Bewegung in flüssiger ist viel einfacher als auf festen Medien und kann durch starkes Licht induziert werden. Die Verwendung einer höheren Vergrößerung kann helfen, sehr subtile Bewegungen wie die der Spitze des Pharynx vor Ort. Solche subtilen Bewegungen sind oft die einzige Bewegung in sehr alten Tieren beobachtet. </li><li> Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2-4 alle zwei vor drei Tagen bis alle Tiere tot sind. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse. Dieser Abschnitt zeigt ein Beispiel, wie man Aufzeichnungen über die Lebensdauer von Daten durch diese Tests und einige repräsentative Ergebnisse generiert halten. Abbildung 1A zeigt ein Beispiel, wie man Lebensdauer Daten während dieses Tests aufzuzeichnen. Eine Excel-Tabelle wird verwendet, um das Überleben der Populationen in jede Vertiefung zu halten. Für jeden gut ist es in der Platte zu koordinieren, Dehnung, Drogen, Konzentration des Medikaments und die Gesamtzahl der Tiere am Leben am Tag 0 (X0) wird am Anfang des Experiments aufgezeichnet. Stichtag sowie die Anzahl der lebenden und toten Tieren dreimal in der Woche, um das Überleben der verschiedenen Bevölkerungsgruppen in jede Vertiefung folgen. Um die Ergebnisse grafisch, berechnen den Anteil der Tiere am Leben für jeden Tag und Handlung als eine Funktion der Zeit in Tagen. P-Werte zu berechnen mit Hilfe statistischer Pakete wie STATA oder ähnliche Software. Das Medium Lebensdauer von C. elegans ist temperaturabhängig. Abbildung 1B zeigt, dass temperaturabhängige Veränderungen in Lebensspanne genau durch die Mikrotiterplatten basierten Lebensdauer Assay 22 wiedergegeben. Ebenso gibt die Mikrotiterplatte Assay Veränderungen in Lebensspanne von Mutanten berichtet, Lebensdauer, die von Wildtyp N2 Tiere 23-24 25 (Abb. 1C) unterscheiden können. Der Test kann auch verwendet werden, um mehr quantitative Aussagen zu machen. In Fig1D bedeuten Lebensdauer beträgt in Abhängigkeit von der Konzentration Mirtazepine 7 dargestellt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert Lebensdauer von 7-12 Bevölkerung, jedes Lebewesen in ein anderes auch. Auch wenn die Anzahl der Tiere pro Well ist relativ gering (5-15 Tiere) der Well-to-Well-Variante ist relativ gering, wie aus der Fehlerbalken zu sehen ist. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Die Mikrotiterbasis Lebensdauer-Test reproduziert Veränderungen in Lebensdauer in der Literatur berichtet. (A) Sample-Daten in eine Excel-Tabelle gesammelt. Während jeder Sitzung Zählen Datum, der gut zu koordinieren und die Anzahl der lebenden und toten Tieren aufgenommen wurde. Zu Beginn des Experiments wurde die Gesamtzahl der Tiere in jeder Vertiefung bestimmt. (B) Survival-Kurve von Wildtyp-(N2) Tiere bei 20 ° C gezüchtet und 25 ° C. (C) Überlebenskurven von Stämmen, die Mutationen, die die Lebensdauer beeinflussen. Alle vier Stämme wurden in parallel bei 20 ° C getestet (D) Dosis-Wirkungs-Kurve von Mirtazepine behandelt N2 Tiere. Mittlere Lebensdauer ist als eine Funktion der Mirtazepine Konzentration aufgetragen. Fehlerbalken zeigen den SEM von 8 Wells pro Zustand. 5. Materials. M9-Puffer, 1000 ml <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g KH 2 PO 4 </li><li> 5 g NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> Potassiumphosphate pH 6,0, 1000 ml <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 900 ml </li><li> Der pH-Wert auf 6,0 mit 5M KOH </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> Trace Metall-Lösung <ul><li> 1,86 g Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,016 g CuSO 4 </li><li> 1000 mL VE-Wasser </li><li> Autoklaven und dunkel lagern. </li></ul> S-Basalmedium, 1000 ml <ul><li> 5,9 g NaCl </li><li> 50 ml 1 M Kaliumphosphat, pH 6,0 </li><li> 1000 mL VE-Wasser </li><li> Autoclave </li><li> Lassen Sie die Lösung abkühlen lassen und dann 1 mL 5 mg / mL Cholesterin (gelöst in Et-OH). </li></ul> Kaliumcitrat 1M, 1000 ml <ul><li> 268,8 g Trikaliumcitrat </li><li> 26,3 Zitronensäuremonohydrat </li><li> Add 900 ml VE-Wasser </li><li> Der pH-Wert auf 6,0 mit 5M KOH </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> S-Vollmedium, 1000 ml <ul><li> 977 ml S-basalen </li><li> 10 mL 1M Kaliumcitrat pH 6 (steril) </li><li> 10 mL Spurenmetalle Lösung (steril) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (steril) </li><li> 3 mL 1M MgSO 4 (steril) </li></ul> NGM-Agar <ul><li> 3.0g NaCl </li><li> 2,5 g Pepton(Aus Casein-, Bauchspeicheldrüsen-Digest) </li><li> 17g Agar </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 975 ml und einen Rührstab </li><li> Autoclave </li><li> Nach dem Autoklavieren abkühlen auf 55 ° C und fügen Sie die folgenden Komponenten: <ul><li> 0,5 ml 1M CaCl 2 (steril) </li><li> 1 ml 5 mg / ml Cholesterin in Ethanol </li><li> 1 ml 1M MgSO 4 (steril) </li><li> 25 mL Potassiumphosphate Puffer, pH 6,0 (steril) </li></ul></li></ul> TB, 1000 ml <ul><li> 12g Bacto Trypton </li><li> 24 g Hefe-Extrakt </li><li> 4 mL Glycerol </li><li> Add 900 ml VE-Wasser </li><li> Autoclave </li><li> Nach dem Autoklavieren abkühlen auf 55 ° C und fügen Sie die folgenden Komponenten: <ul><li> 100 ml 0,17 M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mM Fluordeoxyuridin (FUDR, sigma cat # F0503), 1000 ml <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Man löst in 670 ml sterile S-abgeschlossen ist, machen 10 mL oder 45 mL Aliquots. </li><li> Lagerung bei -20 ° C. </li></ul> 100 mg / mL Carbenicillin, 10 mL <ul><li> 1 g Carbenicillin </li><li> 10 mL sterilem, deionisiertem Wasser </li><li> Sterile Filtrat und aliquoten </li><li> Lagerung bei -20 ° C. </li><li> Verwenden Sie bei einer Endkonzentration von 50 ug / mL </li></ul> 250ug / mL Amphotericin B, 4 ml <ul><li> 1mg Amphotericin B </li><li> 4 mL Et-OH </li><li> Lagerung bei -20 ° C </li><li> Verwenden Sie bei einer Endkonzentration von 0,1 pg / mL </li></ul>

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<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li>
</ol>

Das Protokoll vorgestellt ermöglicht die Messung von C.elegans Lebensdauer in 96-Well Mikrotiterplatten. Wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt Abschnitt es zuverlässig repliziert bisherigen Erkenntnisse und liefert quantitative Informationen. Mit diesem Test haben wir erfolgreich mehr als 89.000 Molekülen auf ihre Wirkung auf C.elegans Lebensdauer untersucht. Für die Zwecke der Drogen-Screening, Mess-Lebensdauer in einer 96-well Mikrotiterplatten-Format hat mehrere Vorteile gegenüber den klassischen festen Medien-Assay. Es reduziert die Arbeitskosten für die mediale Aufbereitung, die Höhe der Inkubation Raum, und die Menge des Medikaments erforderlich erforderlich. Der 96-well-Format und die Mikroskopie Setup ermöglicht die Automatisierung des gesamten Tests für hohen Durchsatz-Screenings. Bei der Entwicklung des Assays mehrere Werte für jede Variable und deren Kombinationen wurden auf ihre Auswirkungen auf C.elegans Lebensdauer getestet. Diese Tests enthalten verschiedene OP50 Konzentration im Bereich von 3 bis 10 mg / mL (3, 4, 6, 8, 10 mg / mL), unterschiedliche Anzahl von Würmern pro Vertiefung reicht von 7 bis 45 (7, 10, 15, 22, 45 Würmer / well), andere Kultur Volumina von 40 bis 150 ul pro Well (40, 60, 80, 100, 120, 150 mL), und Änderungen in der Zusammensetzung des Puffers. Wenn gefüttert mit Carbenicillin-resistente OP50, angegeben weder Carbenicillin noch Amphotericin B in den Konzentrationen gefunden wurden, um C.elegans Lebensdauer beeinflussen. Kontinuierliche leichtem Schütteln der Platten, wie so oft in C. elegans Flüssigkultur empfohlen, wurde festgestellt, entbehrlich für die kleinen Volumina in diesem Test verwendet. Leichtem Schütteln ist jedoch erforderlich, wenn Mikrotiterplatten mit größeren Bohrungen verwendet werden sollen. Die angegebenen Werte in diesem Protokoll wurden sorgfältig auf der Grundlage statistischer Vergleich der verschiedenen Bedingungen getestet ausgewählt. Die größte Überraschung an diesem Test ist wohl die Tatsache, dass C.elegans in 96-Well-Platten, die mit Klebeband verschlossen werden kann gehalten werden. Side-by-Side-Vergleiche zeigten keine Unterschiede in Lebensspanne von Tieren in unverschlossenen Platten kultiviert, in Platten mit einer Kunststoff-Versiegelung versiegelt, oder in Platten mit Versiegelungen, die den Luftaustausch ermöglichen versiegelt. In allen drei Bedingungen, entwickelten die Tiere sehr homogen von L1 bis gravid Erwachsenen innerhalb von 65 Stunden und zeigte sehr vergleichbar Lebensdauer. Tiere parallel auf NGM gewachsen entwickelt etwas schneller, aber dieser Unterschied war unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von einer Versiegelung. Das vorgestellte Protokoll ist am lebenden Bakterien, sondern kann für tote Bakterien adaptiert werden. Allerdings in einer Flüssigkeit Assay einem einzigen überlebenden Bakterien schnell vermehren, und füllen Sie die Kultur. In unsere Hände ist die einzige zuverlässige Methode, um Bakterien in dem Maße, dass sie für flüssige Kultur verwendet werden kann töten bei längerer Behandlung der Bakterien mit Gamma-Bestrahlung. Ein wichtiger Punkt bei der Planung von einer Lebensdauer Experiment prüfen, ist die Macht der Nachweisgrenze. Abhängig von der Größe des Effekts, muss die Wirkung der Droge von Interesse in mehreren Bohrlöchern getestet werden. In einem typischen Assay 4 Arzneimittel-behandelten und 4 Kontroll-Wells, was in etwa auf 40-50 Tiere jeder sollte ausreichen, um eine 30% ige Erhöhung der Lebensdauer in mehr als 95% der Versuche zu erkennen. Erhöht um 14% sind nur in 60% der Fälle erkannt und daher mehr replizieren Brunnen. Der Reichtum der Lebensdauer von Daten mit diesem Test erzeugt wird, kann genutzt werden für Versuche zu entwickeln oder sich anstrengen, bestimmte parametrische Modelle Gompertz 1 sein. Diese Gompertz Modelle sind nützlich, um die Macht der Erkennung zu ermitteln und die Anzahl der False Positives und Negative für große Bildschirme zu schätzen. Wir überprüfen die Vorhersagen der Modelle in blinden Experimente und nutzte sie, um die Zahl der falsch-negativen in großen Bildschirmen (unveröffentlichte Ergebnisse) zu schätzen. Zusammenfassend erwarten wir, dass die vorgelegten Test wird von großem Nutzen, um kleine Moleküle, die Lebensdauer von C. elegans zu erweitern und die zugrunde liegenden Mechanismen zu studieren zu identifizieren.

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Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Wird auch Fungizone genannt</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>FUDR wird durch Hitze inaktiviert, im kalten Wasser auftauen</td></tr><tr><td>Mianserin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>Als positiven Kontrollwert bei 50&amp;#x03BC;M Endkonzentration verwenden</td></tr><tr><td>Cyproheptadin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>Alternativer positiver Kontrollwert bei 10 &amp;#x03BC;M Endkonzentration</td></tr><tr><td>Dichtfolie</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>Polyester, nicht steril</td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>Nicht beschichtet, transparent, steril einzeln verpackt, Polystyrol</td></tr><tr><td>Nunclon-Flasche</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>Wird für große Volumina verwendet</td></tr></tbody></table>

messung caenorhabditis elegans life span in 96 well mikrotiterplatten

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lebensdauer ist ein biologischer Prozess, durch mehrere genetische Signalwege reguliert. Eine Strategie, um die Biologie des Alterns befassen, ist es, Tiere zu erforschen, die Hafen-Mutationen in Komponenten des Alters-Regulationswege. Wenn diese Mutationen stören die Funktion des Alters-Regulationsweg und somit verändern die Lebensdauer des gesamten Organismus, liefern sie wichtige mechanistische Einblicke 1-3. Eine andere Strategie, um die Regulierung der Lebensdauer zu untersuchen ist, um kleine Moleküle zu stören Alter Regulationswege verwenden. Bis heute sind eine Reihe von Molekülen bekannt Lebensdauer in verschiedenen Modell-Organismen zu erweitern und werden als Instrumente verwendet werden, um die Biologie des Alterns 4-16 zu studieren. Die Zahl der identifizierten Moleküle so weit ist klein im Vergleich zu den genetischen &quot;Toolset&quot; findest, die Biologie des Alterns zu studieren. Caenorhabditis elegans ist einer der bedeutendsten Modelle zur Untersuchung Alterung wegen seiner ausgezeichneten Genetik und kurze Lebensdauer von drei Wochen. In jüngerer Zeit hat C.elegans als Modellorganismus für Phänotyp basierte Drogen-Bildschirme 5,7,16-20 wegen seiner geringen Größe und seiner Fähigkeit, in Mikrotiterplatten wachsen entstanden. Hier präsentieren wir einen Test, um C.elegans Lebensdauer in 96 well Mikrotiterplatten zu messen. Der Assay wurde entwickelt und erfolgreich eingesetzt, um große Bibliotheken für Moleküle, die C.elegans Lebensdauer 7 erstrecken Bildschirm. Die Zuverlässigkeit des Tests wurde in mehreren Tests untersucht: erstens durch die Messung der Lebensdauer von Wildtyp-Tieren bei unterschiedlichen Temperaturen angebaut, zweitens durch die Messung der Lebensdauer von Mutanten mit veränderten Lebenserwartung, drittens durch die Messung von Veränderungen der Lebenserwartung in Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen des Antidepressivums Mirtazepine. Mirtazepine wurde zuvor gezeigt, auf Lebenszeit in C.elegans 7 erstrecken. Die Ergebnisse dieser Tests zeigen, dass der Test in der Lage, frühere Ergebnisse aus anderen Untersuchungen repliziert wird und quantitativ. Die Mikrotiter-Format macht es auch Lebensdauer-Test mit automatisierten Liquid-Handling-Systeme und ermöglicht die Integration in automatisierte Plattformen.

In diesem Protokoll wird eine Methode zur Messung<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Lebensdauer in 96-Well Mikrotiterplatten.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Die Lebensspanne ist ein biologischer Prozess, der durch verschiedene genetische Signalwege reguliert wird. Eine Strategie zur Untersuchung der Biologie des Alterns besteht darin, Tiere zu untersuchen, die ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Lebensdauer von Seegurken-Würmern zu messen, die mit Wirkstoffen der Forschung behandelt wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst OP 50, ein Bakterienstamm, vorbereitet wird, der zur Fütterung der Würmer verwendet wird. Anschließend wird eine alterssynchronisierte Population von Würmern erzeugt und gemeinsam mit den Futterbakterien OP 50 in 96-Well-Platten ausgesät.In den nächsten zwei Tagen wachsen die Würmer bis zum L4-Larvenstadium heran, und das Medikament FUDR wird hinzugefügt, um die Fortpflanzung zu verhindern. Am folgenden Tag erreichen die Würmer das Erwachsenenstadium, und die Substanzen von Interesse werden den einzelnen Vertiefungen zugegeben. Von diesem Zeitpunkt an wird alle zwei bis drei Tage die Anzahl lebender und toter Würmer bestimmt, bis alle Würmer verstorben sind.Die Beobachtung erfolgt mit einem umgekehrten Mikroskop, und die Anzahl der toten und lebenden Würmer wird in jeder Sitzung erfasst. Hallo, ich bin Greg Solis. Ich befinde mich im Petro-Labor der Abteilung für Chemische Physiologie am Scripps Research Institute.Heute zeige ich Ihnen, wie man Würmer synchronisiert und sie in 96er-Mikrotiterplatten verteilt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber Ihren bestehenden Methoden liegt darin, dass sie die schnelle Identifizierung von Molekülen ermöglicht, die die Lebensdauer von C. elegans verlängern. Beginnen wir also.Um die Futterbakterien für C. elegans vorzubereiten, beginnen Sie am Tag minus sieben mit der Inokulation von fünf Millilitern TB, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin und 0,1 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin B enthält, mit einer einzelnen OP50-Kolonie. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Bakterienschüttler. Am frühen nächsten Morgen verdünnen Sie die Übernachtkultur von OP50 im Verhältnis 1:200 in 300 Milliliter TB, das 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält. Inkubieren Sie die Kultur im Bakterienschüttler acht bis zwölf Stunden bei 37 Grad Celsius, bis die Sättigung erreicht ist. Lassen Sie die Kultur nicht länger als 14 Stunden wachsen.Überführen Sie OP 50 in ein steriles, vorher gewogenes Zentrifugenröhrchen. Pellettieren Sie OP 50 durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 3.500 U/min oder 2.200 × g in einer Tischzentrifuge. Entsorgen Sie das Überstand-Supernatant, resuspendieren Sie das OP-50-Pellet in Sterilwasser und zentrifugieren Sie erneut. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt zweimal; nach dem zweiten Waschgang.Sorgfältig waschen und das restliche Wasser vollständig entfernen. Die Zentrifugenröhre mit dem Pellet wiegen und das Gewicht der leeren Zentrifugenröhre subtrahieren, um das Gewicht des Pellets zu bestimmen. Anschließend den Pellet gründlich in S Complete so resuspendieren, dass eine Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter vorliegt.Es sollten keine Klumpen zurückbleiben. Die Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter OP 50 sollte zwei mal 10 hoch 10 Bakterien pro Milliliter entsprechen. Verwenden Sie das Photospektrometer, um die Anzahl der Bakterien pro Milliliter zu bestimmen, falls die Beziehung zwischen der optischen Dichte und der Anzahl der Bakterien pro Milliliter bekannt ist.Falls erforderlich, stellen Sie die Konzentration der OP 50-Fütterungslösung auf zwei mal 10 hoch 10 Bakterien pro Milliliter ein. Bewahren Sie die OP 50-Lösung schließlich bei vier Grad Celsius auf, bis sie zur Wurmkultur verwendet wird, um eine alterssynchrone Population von Würmern zu erzeugen. Beginnen Sie am späten Nachmittag des Tages minus sechs mit einer fünf bis zehn Tage alten NGM-Platte, auf der die Wurmpopulation hauptsächlich aus verhungerten L1-Larven besteht.Einen Metallspatel durch kurzes Erhitzen über einem Bunsenbrenner sterilisieren. Abkühlen lassen. Anschließend mit dem abgekühlten Spatel Agar-Stücke von der Platte mit den verhungerten Würmern ausschneiden.Überführen Sie mehrere dieser Stücke auf eine frische 10 cm große NGM-Platte, die mit OP50 beimpft wurde. Inkubieren Sie die Würmer etwa 65 Stunden bei 20 Grad Celsius, bis der Großteil der Wurmpopulation aus ausgewachsenen Tieren besteht. Die Zeit, die benötigt wird, damit die hungerstarren L1-Tiere zu ausgewachsenen Würmern heranwachsen, kann je nach Stamm variieren.Nach der Inkubation die Würmer von der 10-Zentimeter-Platte sammeln, indem sie mit fünf bis 10 Milliliter sterilem Wasser von der Platte abgespült werden. Die Wurm-Wasser-Lösung in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführen. Die Würmer waschen, indem sie zwei Minuten in einer Tischzentrifuge bei 1.200 U/min oder 280 × g zentrifugiert werden. Das Überstand entfernen und 10 Milliliter Wasser hinzufügen.Wiederholen Sie den Waschschritt, entfernen Sie das Überstandsgemisch und geben Sie fünf Milliliter frisch zubereitete Bleichlösung hinzu. Inkubieren Sie die Natriumhydroxidlösung fünf Minuten bei Raumtemperatur, bis die Würmer aufbrechen. Achten Sie darauf, jede Minute vorsichtig zu wirbeln.Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion am Stereomikroskop, sobald alle erwachsenen Tiere aufgelöst sind. Geben Sie fünf Milliliter M-neun-Puffer hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Waschen Sie die Eier dreimal mit je 10 Milliliter M-neun-Puffer durch Zentrifugation für zwei Minuten bei 2.500 U/min oder 1.100 × g. Anschließend waschen Sie die Eier einmal mit 10 Milliliter S-complete durch Zentrifugation für zwei Minuten bei 2.500 U/min oder 1.100 × g. Entfernen Sie den Überstand.Geben Sie 10 Milliliter S complete hinzu und überführen Sie die Lösung in ein frisches kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 30 Milliliter S complete hinzu, um ein Endvolumen von 40 Millilitern zu erreichen. Schütteln Sie das Röhrchen über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Mutator oder einem ähnlichen Gerät, um die Tierplatten am nächsten Tag gegen Mittag zu besiedeln.Unter einem Stereomikroskop überprüfen, ob die Würmer während der Nacht geschlüpft sind. Die Konzentration der Würmer in der S-complete-Lösung bestimmen, indem die Anzahl der Würmer in 10-Mikroliter-Tropfen gezählt wird. Mit einem Stereomikroskop mindestens 10 Tropfen pro Probe zählen. Resus.Suspendieren Sie die Würmer in einer Konzentration von 80 bis 100 Würmern pro Milliliter. Geben Sie in S-vollständigem Medium Carbenicillin auf eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter und Amphotericin B auf eine Endkonzentration von 0,1 Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Schütteln Sie auf einem Mutator. Wenn größere Mengen an Würmern vorbereitet werden, verwenden Sie einen 600-Milliliter-Nonclon-Flask mit Filterkappe. Um 14:30 Uhr geben Sie das in Teil eins vorbereitete OP 50 in einer Endkonzentration von sechs Milligramm pro Milliliter hinzu. Stellen Sie das OP 50 wieder auf vier Grad Celsius. Überführen Sie 120 Mikroliter der Wurm-OP-50-Lösung in jedes Loch einer 96-Loch-Platte mit transparentem Boden.Stellen Sie sicher, dass die Würmer und die Suspension während des Pipettierens erhalten bleiben; versiegeln Sie die Platte mit einem Klebebandverschluss, um Kontamination und Verdunstung zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte zwei Minuten lang auf einem Mikrotiterplatten-Shaker und inkubieren Sie sie zwei Tage bei 20 Grad Celsius, bis die Tiere das L4-Stadium erreicht haben. Als Nächstes sterilisieren Sie die Tiere, indem Sie 30 Mikroliter einer 0,6-Millimolar-FUDR-Stammlösung zu jedem Well hinzufügen.Dieser Schritt bringt das Endvolumen in jedem Well auf 150 Mikroliter und verringert die Endkonzentration von OP 50 von sechs Milligramm pro Milliliter auf fünf Milligramm pro Milliliter. Versiegeln Sie die Platte mit Klebeverschlüssen und schütteln Sie sie zwei bis drei Minuten lang auf einem Mikroplatten-Shaker. Wenn das OP 50 am 23:00 Uhr am Tag minus zwei zugegeben wurde, ist es wichtig, dass das FUDR vor Mittag zugegeben wird, und die Platten müssen bis 9:00 Uhr am nächsten Tag in den 20 °C-Inkubator zurückgebracht werden.Die meisten Tiere sollten adult sein und mehrere Eier enthalten. Geben Sie jeweils die Wirkstoffe hinzu, deren Effekt auf die Lebensdauer in der gewünschten Konzentration getestet werden soll. Falls die Wirkstoffe in DMSO gelöst werden, sollte die Endkonzentration von DMSO 0,6 % nicht überschreiten, da DMSO-Konzentrationen über 0,6 % die Lebensdauer von C. elegans nach Zugabe des Wirkstoffs verkürzen.Versiegeln Sie die Platten mit einem Klebebandverschluss und schütteln Sie sie zwei bis drei Minuten lang auf einem Mikrotiterplattenschüttler. Stellen Sie die Platten anschließend in den 20 Grad Celsius warmen Inkubator zurück. Das Hinzufügen der Wirkstoffe kann gelegentlich einige Tiere pro Platte töten, insbesondere wenn ein anderes Lösungsmittel als Wasser verwendet wird.Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um auf tote Tiere zu prüfen. In der Regel sollten weniger als 10 tote Tiere pro 96-Well-Platte vorhanden sein. Stellen Sie die Platten zwei Tage lang in den 20 Grad Celsius warmen Inkubator, damit frischer Sauerstoff in die Kultur eindringen kann. Entfernen Sie den Versiegelungsdeckel.Warten Sie eine Minute und verschließen Sie die Platte erneut. Schütteln Sie die Platte für zwei bis drei Minuten auf einem Mikrotiterplatten-Shaker. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal pro Woche am fünften Tag der adulten Lebensspanne. Geben Sie fünf Mikroliter der zuvor hergestellten OP50-Lösung mit einer Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter in jedes der 96 Wells, um Verhungern zu verhindern. Die Würmer werden ab Beginn des Experiments bis zu ihrem Tod dreimal pro Woche anhand ihrer Bewegung auf ihre Lebensspanne hin überprüft.Verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop mit einem 2x- oder 2,5x-Objektiv, um die Würmer an Tag null zu Versuchsbeginn in 96-Loch-Platten zu beobachten. Zählen Sie die Gesamtanzahl der Würmer in jedem Loch.Sensorgruben, die mehr als 18 Tiere aus der Analyse enthalten, weisen nicht genügend OP 50 auf, sodass die Tiere in diesen Gruben in jeder Zählsitzung Effekte der Nahrungsrestriktion zeigen. Notieren Sie das Datum und die Anzahl der Tiere, die sich als lebende Tiere bewegen. Bewegung und Flüssigkeit sind viel einfacher als auf festem Medium und können durch helle Lichtquellen induziert werden.Die Verwendung einer höheren Vergr&ouml;&szlig;erung kann helfen, sehr feine Bewegungen wie jene an der Spitze der Pharynx zu erkennen. Solch feine Bewegungen sind h&auml;ufig die einzigen Bewegungen, die bei sehr alten Tieren beobachtet werden. Stellen Sie die Platten zur&uuml;ck in den Inkubator bei 20 Grad Celsius.Wiederholen Sie die Zählungen alle zwei bis drei Tage, bis alle Tiere verendet sind. Dies ist ein Entwurf eines Excel-Arbeitsblatts zur Erfassung der Lebensdauerdaten für jede Vertiefung. Die Koordinaten in der Platte, die Stammbezeichnung, die Wirkstoffkonzentration sowie die Gesamtanzahl der lebenden Tiere am Tag null werden zu Versuchsbeginn erfasst.Notieren Sie dreimal pro Woche das Datum sowie die Anzahl der lebenden und toten Tiere, um das Überleben der verschiedenen Populationen in jedem Brunnen zu verfolgen. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse von *C. elegans*-Längsschnitten, Lebensdauer-Kurven, die bei 20 Grad Celsius und 25 Grad Celsius aufgezeichnet wurden. Der mikrotiterplattenbasierte Lebensdauer-Assay reproduziert präzise temperaturabhängige Veränderungen der Lebensdauer.Ebenso reproduziert, wie hier gezeigt, der Mikrotiterplatten-Assay Veränderungen der Lebensdauer von Mutanten, von denen berichtet wurde, dass sie eine von der Wildtyp-N2-Tieren abweichende Lebensdauer aufweisen. Diese Abbildung zeigt, wie steigende Dosen von Mirtazapin die mittlere Lebensdauer von C. elegans beeinflussen. Die mit dem Mikrotiterplatten-Assay gewonnenen Daten sind quantitativ ausreichend, um Dosis-Wirkungs-Beziehungen zu bestimmen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um große chemische Bibliotheken auf Moleküle zu screenen, die die Lebensdauer verlängern, und C. elegans zu untersuchen.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

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