Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Lebensdauer von See-Elgan-Würmern zu messen, die mit interessanten Medikamenten behandelt wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst OP 50, ein Bakterienstamm, hergestellt wird, der zur Fütterung der Würmer verwendet wird. Anschließend wird eine alterssynchronisierte Population von Würmern erzeugt und zusammen mit dem fressenden Bakterium OP 50 in 96-Well-Platten ausgesät

In den nächsten zwei Tagen wachsen die Würmer bis zum vierten Larvenstadium heran und das Medikament FUDR wird hinzugefügt, um die Fortpflanzung zu verhindern. Am nächsten Tag erreichen die Würmer das Erwachsenenalter und die interessierenden Medikamente werden in die einzelnen Vertiefungen gegeben. Ab diesem Zeitpunkt wird alle zwei bis drei Tage die Anzahl der lebenden und toten Würmer bestimmt, bis alle Würmer abgestorben sind.

Die Beobachtung erfolgt mit einem inversen Mikroskop und die Anzahl der toten und lebenden Würmer wird in jeder Sitzung aufgezeichnet. Hallo, ich bin Greg Solis. Ich bin im Petro-Labor in der Abteilung für chemische Physiologie am Scripps Research Institute.

Heute zeige ich Ihnen, wie Sie Würmer synchronisieren und in 96 Wandmikrotiterplatten verteilen können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber Ihren bestehenden Methoden besteht darin, dass sie die schnelle Identifizierung von Molekülen ermöglicht, die die Lebensdauer und die C-Eleganz verlängern. Also lasst uns loslegen.

Um die Fütterung von Bakterien für C elegance vorzubereiten, beginnen Sie am siebten Tag mit der Inokulation von fünf Millilitern TB mit 100 Mikrogramm pro Milliliter und Persin und 0,1 Mikrogramm pro Milliliter und Terin B mit einer einzigen OP 50-Kolonie, inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Bakterienschüttler am frühen Morgen des nächsten Morgens, verdünnen Sie die Übernachtkultur von OP 51 im Jahr 2000 in 300 Millilitern TB mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin. Inkubieren Sie die Kultur in einem Bakterienschüttler acht bis 12 Stunden bei 37 Grad Celsius, bis die Sättigung erreicht ist. Lassen Sie die Kultur nicht länger als 14 Stunden wachsen.

Übertragen Sie den OP 50 in ein steriles, vorgewichtetes Zentrifugationsröhrchen Pelletieren Sie den OP 50 durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 3.500 U/min oder 2.200 Mal G in einer Tischzentrifuge. Entsorgen Sie den S-Überstand, resuspendieren Sie das OP 50-Pellet und sternen Sie unser Wasser- und Rep-Pellet durch Zentrifugation. Wiederholen Sie dies und waschen Sie es zweimal nach dem zweiten Mal.

Waschen Sie sich sorgfältig und entfernen Sie gründlich das restliche Wasser. Wiegen Sie das Zentrifugationsröhrchen mit dem Pellet und ziehen Sie das Gewicht des leeren Zentrifugationsröhrchens ab, um das Gewicht des Pellets zu bestimmen. Anschließend resuspendieren Sie das Pellet in S Complete gründlich auf eine Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter.

Es sollten keine Klumpen zurückbleiben. Die Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter OP 50 sollte zweimal 10 den 10 Bakterien pro Milliliter entsprechen. Verwenden Sie das Photospektrometer, um die Anzahl der Bakterien pro Milliliter zu bestimmen, wenn das Verhältnis zwischen der optischen Dichte und der Anzahl der Bakterien pro Milliliter bekannt ist.

Gegebenenfalls die Konzentration der Fütterungslösung OP 50 auf zweimal 10 bis 10 Bakterien pro Milliliter einstellen. Lagern Sie schließlich die OP 50-Lösung bei vier Grad Celsius, bis sie für die Wurmkultur verwendet wird, um eine alterssynchrone Population von Würmern zu erzeugen. Beginnen Sie am späten Nachmittag an Tag minus sechs mit einer fünf bis 10 Tage alten NGM-Platte, auf der die Wurmpopulation hauptsächlich aus ausgehungerten L 1-Larven besteht.

Sterilisiere einen Metallspatel, indem du ihn kurz über einem Bunsenbrenner erhitzst. Abkühlen lassen. Dann mit dem kühlen Spatel Agar-Stücke aus der Platte mit den ausgehungerten Würmern ausstechen.

Übertragen Sie mehrere dieser Stücke auf eine frische 10 Zentimeter große NGM-Platte, die mit OP 50 besät ist. Inkubieren Sie die Würmer etwa 65 Stunden lang bei 20 Grad Celsius, bis der Großteil der Wurmpopulation aus ernsten erwachsenen Tieren besteht. Die Zeit, die die ausgehungerten L-One-Tiere brauchen, um zu ernsten Erwachsenen heranzuwachsen, kann von Stamm zu Stamm variieren.

Sammeln Sie nach der Inkubation Würmer von der 10 Zentimeter großen Platte, indem Sie sie mit fünf bis 10 Millilitern sterilem Wasser von der Platte abwaschen. Füllen Sie die Wurmwasserlösung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen um. Waschen Sie die Würmer, indem Sie sie zwei Minuten lang in einer Tischzentrifuge bei 1.200 U/min oder 280 Mal G zentrifugieren. Entsorgen Sie das Supinat und fügen Sie 10 Milliliter Wasser hinzu.

Wiederholen Sie den Waschschritt, entfernen Sie das SUP-Naant und fügen Sie fünf Milliliter frisch zubereitetes Bleichmittel hinzu. Natronlauge inkubiert fünf Minuten lang bei RT, bis die Würmer aufbrechen. Achten Sie darauf, jede Minute sanft zu wirbeln.

Überwachen Sie den Verlauf der Reaktion unter dem Präpariermikroskop, sobald sich alle Erwachsenen aufgelöst haben. Fügen Sie fünf Milliliter M neun Puffer hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Waschen Sie die Eier dreimal mit 10 Millilitern M neun Puffer, indem Sie sie zwei Minuten lang bei 2.500 U/min oder 1.100 Mal G zentrifugieren.Waschen Sie dann die Eier einmal mit 10 Millilitern S vollständig, indem Sie sie zwei Minuten lang bei 2.500 U/min oder 1.100 Mal G zentrifugieren.

Fügen Sie 10 Milliliter S hinzu und geben Sie die Lösung in ein frisches konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 30 Milliliter S vollständig zu einem Endvolumen von 40 Millilitern hinzu. Schütteln Sie das Röhrchen über Nacht bei Raumtemperatur vorsichtig auf einem Mutator oder einem ähnlichen Gerät, um die Tierplatten am nächsten Tag gegen Mittag auszusäen.

Prüfen Sie unter einem Präparierfernrohr, ob die Würmer in der Nacht geschlüpft sind. Bestimmen Sie die Konzentration von Würmern in der S-Komplettlösung, indem Sie die Anzahl der Würmer in 10-Mikroliter-Tropfen zählen. Zählen Sie mit einem Präparierskop mindestens 10 Tropfen pro Probe. Wiederbelebung.

Suspendieren Sie die Würmer in einer Konzentration von 80 bis 100 Würmern pro Milliliter. In S vollständiges Medium Carbenicillin bis zu einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter und Amphotericin B bis zu einer Endkonzentration von 0,1 Mikrogramm pro Milliliter zugeben. Schütteln Sie an einem Mutator.

Bei der Zubereitung größerer Mengen von Würmern ist ein 600-Milliliter-Nicht-Klonkolben mit Filterkappe zu verwenden. Um 14:30 Uhr wird das im ersten Teil hergestellte OP 50 in eine Endkonzentration von sechs Milligramm pro Milliliter gegeben. Bringen Sie den OP wieder auf 50 Grad Celsius. Übertragen Sie 120 Mikroliter der Wurmlösung OP 50 in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit dem transparenten Boden.

Achten Sie darauf, dass die Würmer und die Suspension während des Pipettierens aufbewahrt werden, und versiegeln Sie die Platte mit einem Klebeband, um Kontamination und Verdunstung zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte auf einem Mikrotiterplattenschüttler zwei Minuten lang und inkubieren Sie sie zwei Tage lang bei 20 Grad Celsius, bis die Tiere die Stufe L vier erreichen. Geben Sie anschließend zur Sterilisation der Tiere 30 Mikroliter einer 0,6 millimolaren FUDR-Stammlösung in jede Vertiefung

Dieser Schritt bringt das Endvolumen in jeder Vertiefung auf 150 Mikroliter und reduziert die Endkonzentration von OP 50 von sechs Milligramm pro Milliliter auf fünf Milligramm pro Milliliter. Verschließen Sie die Platte mit Klebebandschweißern und schütteln Sie sie zwei bis drei Minuten lang auf einem Mikrot-Plattenschüttler. Wenn der OP 50 am zweiten Tag um zwei 30 hinzugefügt wurde, ist es wichtig, dass der FUDR hinzugefügt wird, bevor die Platten am nächsten Tag bis 9:00 Uhr mittags in den 20 Grad Celsius Inkubator zurückgebracht werden.

Die meisten Tiere sollten ernst sein und mehrere Eier enthalten. Jedes fügt die Medikamente hinzu, deren Wirkung auf die Lebensdauer in der gewünschten Konzentration getestet werden soll. Beim Auflösen der Arzneimittel in DMSO sollten die Endkonzentrationen von DMSO 0,6 % nicht überschreiten, da DMSO-Konzentrationen über 0,6 % die Lebensdauer der Elgans nach Zugabe des Arzneimittels verkürzen

Verschließen Sie die Platten mit Klebeband und schütteln Sie sie zwei bis drei Minuten lang auf einer Mikrotiterplatte. Mit dem Schüttler werden die Platten wieder in den 20 Grad Celsius heißen Inkubator zurückgeführt. Die Zugabe der Medikamente kann gelegentlich einige Tiere pro Teller töten, insbesondere wenn ein anderes Lösungsmittel als Wasser verwendet wird.

Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um nach toten Tieren zu suchen. Im Allgemeinen sollte es weniger als 10 tote Tiere pro 96 Weltteller geben. Bringen Sie die Platten für zwei Tage in den 20 Grad Celsius Inkubator, damit frischer Sauerstoff in die Kultur gelangen kann. Entfernen Sie die Versiegelung.

Warten Sie eine Minute und verschließen Sie die Platte wieder. Schütteln Sie die Platte zwei bis drei Minuten lang auf einem Mikrot-festeren Plattenschüttler, wiederholen Sie dies einmal pro Woche am fünften Tag der Erwachsenenlebensspanne, fügen Sie fünf Mikroliter der 100 Milligramm pro Milliliter OP 50-Lösung, die zuvor hergestellt wurde, in jede der 96 Vertiefungen hinzu, um Hunger zu verhindern. Die Lebensdauer der Würmer wird durch ihre Bewegung dreimal pro Woche vom Beginn des Experiments bis zu ihrem Tod bewertet.

Verwenden Sie ein inverses Mikroskop mit einem zweifachen oder 2,5-fachen Objektiv, um Würmer in 96 zu beobachten. Well-Platten am Tag Null zu Beginn des Experiments. Zähle die Gesamtzahl der Würmer in jeder Vertiefung.

Sensorvertiefungen, die mehr als 18 Tiere aus der Analyse enthalten, da die Tiere in diesen Vertiefungen nicht genügend OP 50 enthalten und in jeder Zählsitzung Auswirkungen einer diätetischen Einschränkung aufweisen. Notieren Sie das Datum und die Anzahl der Tiere, die sich als lebende Tiere bewegen. Bewegung und Flüssigkeit ist viel einfacher als auf festen Medien und kann durch starkes Licht induziert werden.

Die Verwendung einer höheren Vergrößerung kann helfen, sehr subtile Bewegungen wie die an der Spitze des Rachens zu erkennen. Solche subtilen Bewegungen sind oft die einzigen Bewegungen, die bei sehr alten Tieren beobachtet werden. Stellen Sie die Platten wieder in den 20 Grad Celsius heißen Inkubator.

Wiederholen Sie die Zählungen alle zwei bis drei Tage, bis alle Tiere tot sind. Dabei handelt es sich um den Entwurf einer Excel-Tabelle, in der die Lebensdauerdaten für jedes Bohrloch aufgezeichnet werden. Zu Beginn des Experiments werden die Koordination im Plattenstamm, die Wirkstoffkonzentration des Medikaments und die Gesamtzahl der am Tag Null lebenden Tiere erfasst.

Notieren Sie dreimal pro Woche das Datum sowie die Anzahl der lebenden und toten Tiere, um das Überleben der verschiedenen Populationen in jedem Brunnen zu verfolgen. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der Eleganz des Meeres, der Lebensdauer und der Kurven, die bei 20 Grad Celsius und 25 Grad Celsius aufgezeichnet wurden. Der auf Mikrotitern basierende Lebensdauer-Assay reproduziert präzise temperaturabhängige Änderungen der Lebensdauer.

In ähnlicher Weise, wie hier gezeigt, reproduziert der Mikrotiterplatten-Assay Veränderungen in der Lebensdauer von Mutanten, von denen berichtet wurde, dass sie eine andere Lebensdauer als bei Wildtyp-N-Zwei-Tieren aufweisen. Diese Abbildung zeigt, wie sich steigende Dosen von Mirtazapin auf die mittlere Lebensdauer der Eleganz des Meeres auswirken. Die durch den Mikrotiterplatten-Assay erhaltenen Daten sind quantitativ genug, um Dosis-Wirkungs-Beziehungen zu bestimmen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um große chemische Bibliotheken nach Molekülen zu durchsuchen, die die Lebensdauer verlängern und Eleganz zeigen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.