Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Lebensdauer von Seegurken-Würmern zu messen, die mit Wirkstoffen der Forschung behandelt wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst OP 50, ein Bakterienstamm, vorbereitet wird, der zur Fütterung der Würmer verwendet wird. Anschließend wird eine alterssynchronisierte Population von Würmern erzeugt und gemeinsam mit den Futterbakterien OP 50 in 96-Well-Platten ausgesät.

In den nächsten zwei Tagen wachsen die Würmer bis zum L4-Larvenstadium heran, und das Medikament FUDR wird hinzugefügt, um die Fortpflanzung zu verhindern. Am folgenden Tag erreichen die Würmer das Erwachsenenstadium, und die Substanzen von Interesse werden den einzelnen Vertiefungen zugegeben. Von diesem Zeitpunkt an wird alle zwei bis drei Tage die Anzahl lebender und toter Würmer bestimmt, bis alle Würmer verstorben sind.

Die Beobachtung erfolgt mit einem umgekehrten Mikroskop, und die Anzahl der toten und lebenden Würmer wird in jeder Sitzung erfasst. Hallo, ich bin Greg Solis. Ich befinde mich im Petro-Labor der Abteilung für Chemische Physiologie am Scripps Research Institute.

Heute zeige ich Ihnen, wie man Würmer synchronisiert und sie in 96er-Mikrotiterplatten verteilt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber Ihren bestehenden Methoden liegt darin, dass sie die schnelle Identifizierung von Molekülen ermöglicht, die die Lebensdauer von C. elegans verlängern. Beginnen wir also.

Um die Futterbakterien für C. elegans vorzubereiten, beginnen Sie am Tag minus sieben mit der Inokulation von fünf Millilitern TB, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin und 0,1 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin B enthält, mit einer einzelnen OP50-Kolonie. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Bakterienschüttler. Am frühen nächsten Morgen verdünnen Sie die Übernachtkultur von OP50 im Verhältnis 1:200 in 300 Milliliter TB, das 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält. Inkubieren Sie die Kultur im Bakterienschüttler acht bis zwölf Stunden bei 37 Grad Celsius, bis die Sättigung erreicht ist. Lassen Sie die Kultur nicht länger als 14 Stunden wachsen.

Überführen Sie OP 50 in ein steriles, vorher gewogenes Zentrifugenröhrchen. Pellettieren Sie OP 50 durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 3.500 U/min oder 2.200 × g in einer Tischzentrifuge. Entsorgen Sie das Überstand-Supernatant, resuspendieren Sie das OP-50-Pellet in Sterilwasser und zentrifugieren Sie erneut. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt zweimal; nach dem zweiten Waschgang.

Sorgfältig waschen und das restliche Wasser vollständig entfernen. Die Zentrifugenröhre mit dem Pellet wiegen und das Gewicht der leeren Zentrifugenröhre subtrahieren, um das Gewicht des Pellets zu bestimmen. Anschließend den Pellet gründlich in S Complete so resuspendieren, dass eine Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter vorliegt.

Es sollten keine Klumpen zurückbleiben. Die Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter OP 50 sollte zwei mal 10 hoch 10 Bakterien pro Milliliter entsprechen. Verwenden Sie das Photospektrometer, um die Anzahl der Bakterien pro Milliliter zu bestimmen, falls die Beziehung zwischen der optischen Dichte und der Anzahl der Bakterien pro Milliliter bekannt ist.

Falls erforderlich, stellen Sie die Konzentration der OP 50-Fütterungslösung auf zwei mal 10 hoch 10 Bakterien pro Milliliter ein. Bewahren Sie die OP 50-Lösung schließlich bei vier Grad Celsius auf, bis sie zur Wurmkultur verwendet wird, um eine alterssynchrone Population von Würmern zu erzeugen. Beginnen Sie am späten Nachmittag des Tages minus sechs mit einer fünf bis zehn Tage alten NGM-Platte, auf der die Wurmpopulation hauptsächlich aus verhungerten L1-Larven besteht.

Einen Metallspatel durch kurzes Erhitzen über einem Bunsenbrenner sterilisieren. Abkühlen lassen. Anschließend mit dem abgekühlten Spatel Agar-Stücke von der Platte mit den verhungerten Würmern ausschneiden.

Überführen Sie mehrere dieser Stücke auf eine frische 10 cm große NGM-Platte, die mit OP50 beimpft wurde. Inkubieren Sie die Würmer etwa 65 Stunden bei 20 Grad Celsius, bis der Großteil der Wurmpopulation aus ausgewachsenen Tieren besteht. Die Zeit, die benötigt wird, damit die hungerstarren L1-Tiere zu ausgewachsenen Würmern heranwachsen, kann je nach Stamm variieren.

Nach der Inkubation die Würmer von der 10-Zentimeter-Platte sammeln, indem sie mit fünf bis 10 Milliliter sterilem Wasser von der Platte abgespült werden. Die Wurm-Wasser-Lösung in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführen. Die Würmer waschen, indem sie zwei Minuten in einer Tischzentrifuge bei 1.200 U/min oder 280 × g zentrifugiert werden. Das Überstand entfernen und 10 Milliliter Wasser hinzufügen.

Wiederholen Sie den Waschschritt, entfernen Sie das Überstandsgemisch und geben Sie fünf Milliliter frisch zubereitete Bleichlösung hinzu. Inkubieren Sie die Natriumhydroxidlösung fünf Minuten bei Raumtemperatur, bis die Würmer aufbrechen. Achten Sie darauf, jede Minute vorsichtig zu wirbeln.

Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion am Stereomikroskop, sobald alle erwachsenen Tiere aufgelöst sind. Geben Sie fünf Milliliter M-neun-Puffer hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Waschen Sie die Eier dreimal mit je 10 Milliliter M-neun-Puffer durch Zentrifugation für zwei Minuten bei 2.500 U/min oder 1.100 × g. Anschließend waschen Sie die Eier einmal mit 10 Milliliter S-complete durch Zentrifugation für zwei Minuten bei 2.500 U/min oder 1.100 × g. Entfernen Sie den Überstand.

Geben Sie 10 Milliliter S complete hinzu und überführen Sie die Lösung in ein frisches kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 30 Milliliter S complete hinzu, um ein Endvolumen von 40 Millilitern zu erreichen. Schütteln Sie das Röhrchen über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Mutator oder einem ähnlichen Gerät, um die Tierplatten am nächsten Tag gegen Mittag zu besiedeln.

Unter einem Stereomikroskop überprüfen, ob die Würmer während der Nacht geschlüpft sind. Die Konzentration der Würmer in der S-complete-Lösung bestimmen, indem die Anzahl der Würmer in 10-Mikroliter-Tropfen gezählt wird. Mit einem Stereomikroskop mindestens 10 Tropfen pro Probe zählen. Resus.

Suspendieren Sie die Würmer in einer Konzentration von 80 bis 100 Würmern pro Milliliter. Geben Sie in S-vollständigem Medium Carbenicillin auf eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter und Amphotericin B auf eine Endkonzentration von 0,1 Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Schütteln Sie auf einem Mutator.

Wenn größere Mengen an Würmern vorbereitet werden, verwenden Sie einen 600-Milliliter-Nonclon-Flask mit Filterkappe. Um 14:30 Uhr geben Sie das in Teil eins vorbereitete OP 50 in einer Endkonzentration von sechs Milligramm pro Milliliter hinzu. Stellen Sie das OP 50 wieder auf vier Grad Celsius. Überführen Sie 120 Mikroliter der Wurm-OP-50-Lösung in jedes Loch einer 96-Loch-Platte mit transparentem Boden.

Stellen Sie sicher, dass die Würmer und die Suspension während des Pipettierens erhalten bleiben; versiegeln Sie die Platte mit einem Klebebandverschluss, um Kontamination und Verdunstung zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte zwei Minuten lang auf einem Mikrotiterplatten-Shaker und inkubieren Sie sie zwei Tage bei 20 Grad Celsius, bis die Tiere das L4-Stadium erreicht haben. Als Nächstes sterilisieren Sie die Tiere, indem Sie 30 Mikroliter einer 0,6-Millimolar-FUDR-Stammlösung zu jedem Well hinzufügen.

Dieser Schritt bringt das Endvolumen in jedem Well auf 150 Mikroliter und verringert die Endkonzentration von OP 50 von sechs Milligramm pro Milliliter auf fünf Milligramm pro Milliliter. Versiegeln Sie die Platte mit Klebeverschlüssen und schütteln Sie sie zwei bis drei Minuten lang auf einem Mikroplatten-Shaker. Wenn das OP 50 am 23:00 Uhr am Tag minus zwei zugegeben wurde, ist es wichtig, dass das FUDR vor Mittag zugegeben wird, und die Platten müssen bis 9:00 Uhr am nächsten Tag in den 20 °C-Inkubator zurückgebracht werden.

Die meisten Tiere sollten adult sein und mehrere Eier enthalten. Geben Sie jeweils die Wirkstoffe hinzu, deren Effekt auf die Lebensdauer in der gewünschten Konzentration getestet werden soll. Falls die Wirkstoffe in DMSO gelöst werden, sollte die Endkonzentration von DMSO 0,6 % nicht überschreiten, da DMSO-Konzentrationen über 0,6 % die Lebensdauer von C. elegans nach Zugabe des Wirkstoffs verkürzen.

Versiegeln Sie die Platten mit einem Klebebandverschluss und schütteln Sie sie zwei bis drei Minuten lang auf einem Mikrotiterplattenschüttler. Stellen Sie die Platten anschließend in den 20 Grad Celsius warmen Inkubator zurück. Das Hinzufügen der Wirkstoffe kann gelegentlich einige Tiere pro Platte töten, insbesondere wenn ein anderes Lösungsmittel als Wasser verwendet wird.

Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um auf tote Tiere zu prüfen. In der Regel sollten weniger als 10 tote Tiere pro 96-Well-Platte vorhanden sein. Stellen Sie die Platten zwei Tage lang in den 20 Grad Celsius warmen Inkubator, damit frischer Sauerstoff in die Kultur eindringen kann. Entfernen Sie den Versiegelungsdeckel.

Warten Sie eine Minute und verschließen Sie die Platte erneut. Schütteln Sie die Platte für zwei bis drei Minuten auf einem Mikrotiterplatten-Shaker. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal pro Woche am fünften Tag der adulten Lebensspanne. Geben Sie fünf Mikroliter der zuvor hergestellten OP50-Lösung mit einer Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter in jedes der 96 Wells, um Verhungern zu verhindern. Die Würmer werden ab Beginn des Experiments bis zu ihrem Tod dreimal pro Woche anhand ihrer Bewegung auf ihre Lebensspanne hin überprüft.

Verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop mit einem 2x- oder 2,5x-Objektiv, um die Würmer an Tag null zu Versuchsbeginn in 96-Loch-Platten zu beobachten. Zählen Sie die Gesamtanzahl der Würmer in jedem Loch.

Sensorgruben, die mehr als 18 Tiere aus der Analyse enthalten, weisen nicht genügend OP 50 auf, sodass die Tiere in diesen Gruben in jeder Zählsitzung Effekte der Nahrungsrestriktion zeigen. Notieren Sie das Datum und die Anzahl der Tiere, die sich als lebende Tiere bewegen. Bewegung und Flüssigkeit sind viel einfacher als auf festem Medium und können durch helle Lichtquellen induziert werden.

Die Verwendung einer höheren Vergrößerung kann helfen, sehr feine Bewegungen wie jene an der Spitze der Pharynx zu erkennen. Solch feine Bewegungen sind häufig die einzigen Bewegungen, die bei sehr alten Tieren beobachtet werden. Stellen Sie die Platten zurück in den Inkubator bei 20 Grad Celsius.

Wiederholen Sie die Zählungen alle zwei bis drei Tage, bis alle Tiere verendet sind. Dies ist ein Entwurf eines Excel-Arbeitsblatts zur Erfassung der Lebensdauerdaten für jede Vertiefung. Die Koordinaten in der Platte, die Stammbezeichnung, die Wirkstoffkonzentration sowie die Gesamtanzahl der lebenden Tiere am Tag null werden zu Versuchsbeginn erfasst.

Notieren Sie dreimal pro Woche das Datum sowie die Anzahl der lebenden und toten Tiere, um das Überleben der verschiedenen Populationen in jedem Brunnen zu verfolgen. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse von *C. elegans*-Längsschnitten, Lebensdauer-Kurven, die bei 20 Grad Celsius und 25 Grad Celsius aufgezeichnet wurden. Der mikrotiterplattenbasierte Lebensdauer-Assay reproduziert präzise temperaturabhängige Veränderungen der Lebensdauer.

Ebenso reproduziert, wie hier gezeigt, der Mikrotiterplatten-Assay Veränderungen der Lebensdauer von Mutanten, von denen berichtet wurde, dass sie eine von der Wildtyp-N2-Tieren abweichende Lebensdauer aufweisen. Diese Abbildung zeigt, wie steigende Dosen von Mirtazapin die mittlere Lebensdauer von C. elegans beeinflussen. Die mit dem Mikrotiterplatten-Assay gewonnenen Daten sind quantitativ ausreichend, um Dosis-Wirkungs-Beziehungen zu bestimmen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um große chemische Bibliotheken auf Moleküle zu screenen, die die Lebensdauer verlängern, und C. elegans zu untersuchen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.