Closed System Cell Culture Protocol Mit HyperStack Schiffe mit gasdurchlässigen Material Technology

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die korrekte Verwendung der Corning Hypers Stack-Gefäße in geschlossenen Systemen zu demonstrieren. Dazu werden die Gefäße zunächst im Schwerkraftzufuhrverfahren beimpft und mit Medien befüllt. Als nächstes wird die Zellsuspension in jeder der Schichten isoliert und die Zellen werden inkubiert.

Nach der Inkubation werden die verbrauchten Medien entfernt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen aus den Hypers-Stack-Gefäßen zu gewinnen. Letztendlich werden Ergebnisse der Gasdiffusion erzielt, um die Fähigkeit der Zellen zu zeigen, während des Wachstums auf Sauerstoff zuzugreifen, bis hin zur Kofluenz, wenn das geschlossene Hypers-Stack-System verwendet wird.

Der Hauptvorteil des Hypers-Stack-Gefäßes mit gasdurchlässigem Material besteht darin, dass es eine vergrößerte Oberfläche für das Zellwachstum bietet. Durch die Eliminierung des Kopfraums im Gefäß wird mein Kollege p pardo nun ein geschlossenes Systemprotokoll für die Verwendung des Hypers-Stack-Gefäßes demonstrieren. Das Hypers-Stack-Gefäß besteht aus einem Stat, dem einzelnen Zellkulturkompartiment, das aus der Deckplatte und dem gasdurchlässigen Film besteht.

In diesem Kompartiment werden die Zellen kultiviert. Der Flüssigkeitsverteiler verbindet jede der ette-Schichten innerhalb eines Moduls miteinander. Die Module werden mit Schläuchen zu Gefäßen in Vielfachen von 12 Schichten verbunden.

Der Verteiler ermöglicht es dem Benutzer, eine einzige Flüssigkeitsmanipulation am gesamten Gefäß vorzunehmen. Der Luftverteiler verbindet auch die Stat-Schichten miteinander, wird jedoch verwendet, um Luft aus dem Behälter zu verdrängen, wenn Flüssigkeitszusätze auftreten, und enthält eine Fülllinie für die Verwendung während der Befüllung zwischen den einzelnen Schichten. Die Stat-Schicht ist ein offener Luftraum, der als Trachealraum bezeichnet wird und den Gasaustausch durch den gasdurchlässigen Film jeder Schicht ermöglicht.

Der Liquid-Handling-Schlauch ist mit dem Flüssigkeitsverteiler verbunden und ist eine anpassbare Komponente, die verwendet wird, um alle Flüssigkeitsmanipulationen des geschlossenen Systems durchzuführen, um überschüssige Luft abzulassen und gleichzeitig die Sterilität zu erhalten. Es kommt der Entlüftungsschlauch zum Einsatz. Der Entlüftungsschlauch ist mit dem Luftverteiler verbunden und enthält einen Luftfilter.

Mit dem Liquid-Handling-Schlauch verbunden sind der Chase-Schlauch und der Filter, die verwendet werden, um die Flüssigkeit nach dem Befüllen des Behälters aus dem Liquid-Handling-Schlauch zu evakuieren. In diesem Protokoll wird auch der Corning Stack Manipulator oder CSM verwendet, bei dem es sich um ein Handhabungsgerät handelt, das dabei hilft, die Gefäße während des Gebrauchs in die richtigen Positionen zu bringen. In dieser Demonstration wird die Zellkultur eines geschlossenen Systems für ein gasdurchlässiges 36-Schicht-Gefäß demonstriert.

Bei Verwendung eines CSM sind jedoch Einzelheiten zur Durchführung dieses Verfahrens an einem 12-Schicht-Gefäß unter Verwendung eines Füllkeils in dem beigefügten schriftlichen Protokoll zu finden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von 3,9 Litern Beutelmedien, bevor Sie das Medienröhrchen inokulieren. Befeuchten Sie den Serumbeutel mit dem Medienbeutel und mischen Sie ihn gründlich, um die gewünschte Serumkonzentration zu erreichen.

Klemmen Sie ca. 300 Milliliter Medium im Beutel mit großen Beutelklammern ab. Dadurch wird sichergestellt, dass alle inokulierten Zellen während der Befüllung verwendet werden und keine im Medienbeutel verbleiben. Legen Sie das Medium auf einen Beutelständer, um das Medium zu impfen.

Füllen Sie eine an den Schlauch befestigte Spritze mit Zellsuspension. Befestigen Sie die Spritze mit der Zellsuspension durch Schlauchschweißen am Medienbeutel. Drei über 16-Zoll-Schläuche von der Spritze zum Beutel.

Die Zellsuspension in den Medienbeutel injizieren und gut mischen. Der inokulierte Medienbeutel kann durch Rohrschweißen oder mit Mehrzweckverbindern an den drei über acht Zoll großen Liquid-Handling-Schläuchen des Behälters befestigt werden. Heute werden wir uns mit dem Rohrschweißen beschäftigen.

Schließen Sie die Klemmen am Liquid Handling und verfolgen Sie die Rohre des Behälters. Setzen Sie das 36-Lagen-Gefäß in der Ladeposition in ein CSM ein. Haken Sie das Entlüftungsfilterrohr in die Halteklammer am CSM ein.

Ziehen Sie den Deckel fest und bringen Sie den CSM in die Füllposition, um den Luftfilter in die höchste Position zu bringen und eine Benetzung während des Füllvorgangs zu verhindern. Der 10-Grad-Winkel ermöglicht auch eine Äquilibrierung der Flüssigkeit zu den Schichten beim Befüllen von Klarluft aus der Fülllinie. Indem der Medienbeutel auf der gleichen Höhe wie das Gefäß positioniert wird, bleibt die Verfolgungsrohrklemme geschlossen.

Öffnen Sie die Schelle des Liquid-Handling-Schlauchs und die Klemme des Medienbeutels, damit die Flüssigkeit in den Behälter eindringen kann. Heben Sie den Medienbeutel mit dem Beutelständer an, damit die Zellsuspension in das Gefäß fließen kann. Füllen Sie das Gefäß, bis das gesamte inokulierte Medium in das Gefäß gelangt.

Der obere Teil des Medienbeutels sollte noch 300 Milliliter Medium enthalten. Entfernen Sie die Klemme vom Medienbeutel, um das Gefäß weiter zu füllen, wenn sich die Flüssigkeit dem oberen Luftverteiler nähert. Verlangsamen Sie die Füllrate, indem Sie den Medienbeutel absenken, um eine Überfüllung zu vermeiden.

Bringen Sie den Flüssigkeitsstand langsam zur Fülllinie und verklumpen Sie den Liquid-Handling-Schlauch. Bringen Sie das Gefäß im CSM in die Isolationsposition, indem Sie beide Verteilersätze in die höchste Position bringen. Senken Sie den Medienbeutel unter die Höhe des Behälters ab.

Halten Sie den Chase-Filter in aufrechter Position und öffnen Sie die Chase-Rohrklemme. Dadurch wird das Medium im Liquid-Handling-Rohr entleert oder zurück in den Medienbeutel gejagt. Sobald der Schlauch leer ist, schließen Sie die Klemme am Schlauch des Medienbeutels.

Halten Sie den Chase-Tube-Filter in einer aufrechten Position. Öffnen Sie die Klemme am Liquid-Handling-Rohr des Behälters, damit die verbleibende Flüssigkeit in das Gefäß eindringen und sich im Behälter ausgleichen kann. Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis dies geschieht.

Drehen Sie dann das Gefäß im CSM so, dass sich die Krümmer auf der linken Seite befinden. Senken Sie das Schiff in die Ladeposition auf dem CSM ab. Schließen Sie die Klemmen sowohl an der Verfolgungs- als auch an den Liquid-Handling-Schläuchen.

Der Medienbeutel kann nun aus dem Gefäß entfernt werden oder für die spätere Verwendung während des Erntevorgangs befestigt bleiben. Um die beigefügte Medientasche aufzubewahren, rollen Sie die Medientasche auf und legen Sie sie unter die Haltebänder in der Aufbewahrungsschale des Gefäßes. Schieben Sie das Gefäß schließlich in den Inkubator Achten Sie beim Tragen des Gefäßes darauf, dass keine Flüssigkeit in den Entlüftungsfilter gelangt

Dies wird erreicht, indem das Krümmerende leicht nach oben gekippt wird. Um mit dem Erntevorgang zu beginnen, schweißen Sie die Zellen-Assoziationslösung zusammen und schrecken Sie die Beutel zusammen Um die Erntebeutelbaugruppe zu bilden, stellen Sie sicher, dass alle Schlauchschellen geschlossen sind. Nehmen Sie das Gefäß aus dem Inkubator und stellen Sie es in die Ladeposition in das CSM.

Lösen Sie die Medientasche unter den Haltebändern und hängen Sie sie an die Tasche. Stellen Sie sich als nächstes hin und ziehen Sie den Deckel fest, um das Gefäß zu sichern. Haken Sie den Entlüftungsschlauch in die Halteklemme ein und bringen Sie den CSM in die Füllposition.

Stellen Sie sicher, dass die Medientasche auf dem Beutelständer tiefer als das Gefäß hängt. Öffnen Sie die Klemme an den Schläuchen des Medienbeutels und den Liquid-Handling-Schlauch des Behälters, damit das Medium in den beigefügten Beutel fließen kann. Sobald das Gefäß zu etwa drei Vierteln leer ist, ändern Sie die CSM-Einstellungen auf die endgültige leere Position.

Wenn das Gefäß und der Liquid-Handling-Schlauch leer sind, heben Sie den Schlauch an, um das Medium an der Klemme am Schlauch für verbrauchte Medien vorbeizujagen. Schließen Sie dann sowohl die Klemme am Liquid-Handling-Schlauch als auch die Klemme am Schlauch für den verbrauchten Medienbeutel. Ersetzen Sie den Beutel für verbrauchte Medien durch das Rohrschweißen durch die Erntebeutelbaugruppe.

Heben Sie die Höhe der zellendissoziierenden Beutelbaugruppe mit dem Beutelständer über die Höhe des Gefäßes an. Platzieren Sie den CSM in der Füllposition. Öffnen Sie die Schlauchklemme für die Zelldissoziationslösung und die Klemme für die Erntebeutelbaugruppe und überführen Sie die Lösung in das Gefäß.

Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, schließen Sie die Klemmen an den Liquid-Handling-Schläuchen und den Schläuchen für die Zelldissoziationslösung. Bringen Sie anschließend das CSM in die Lastposition, während Sie den horizontalen Positionierungshebel offen halten. Bewegen Sie das Gefäß vorsichtig mit dem Rad von einer Seite zur anderen und verteilen Sie die Lösung auf den Zellschichten.

Gelegentlich kann das Gefäß während des Schaukelns in die Füllposition zurückgebracht werden, um eine gleichmäßige Verteilung der Lösung zu gewährleisten. Sobald die Lösung ausreichend verteilt ist, lassen Sie den Hebel am CSM los, um die Füllposition zu verriegeln. Lassen Sie das Gefäß während der erforderlichen Dissoziationszeit der Zellen in dieser Position.

Verwenden Sie die Trübung als Anhaltspunkt, um die Zellablösung zu bestimmen. Bewegen Sie das CSM nach dem Abnehmen in die Lastposition. Öffnen Sie die Quench-Beutel-Klemme und die Liquid-Handling-Schlauchklemme, damit das Quench-Medium in den Behälter gelangen kann.

Schließen Sie die Klemme am Liquid-Handling-Schlauch. Sobald die Übergabe abgeschlossen ist, bringen Sie das CSM wieder in die Ladeposition und halten Sie den horizontalen Positionierungshebel fest, um das Schiff von einer Seite zur anderen zu schaukeln. Senken Sie die Position der Erntesackbaugruppe mit dem Sackständer unter das Niveau des Behälters ab.

Stellen Sie den CSM auf die leere Position ein. Öffnen Sie das Liquid-Handling-Rohr und die Klemme des Behälters und übertragen Sie die Zelllösung zurück in den Quenchbeutel. Bringen Sie das CSM wieder in die Ladeposition und trennen Sie die Erntesackbaugruppe mit einem Schlauchversiegeler vom Behälter.

Jetzt ist die Zelllösung bereit für die Verarbeitung in herkömmlichen Zellwachstumssystemen. Mit Headspace wird der Sauerstoff im Medium über drei Tage um durchschnittlich 50 % verbraucht. In Kultur zeigt diese Zahl die Abnahme von Milligramm pro Liter Sauerstoff auf dem Niveau der Zellen im Laufe der Zeit im gleichen Wachstumssystem, der Sauerstoffgradient durch eine Medienhöhe von drei Millimetern ist an der Medien-Headspace-Verbindung fast 50 % größer als an der Zellschicht.

Dargestellt ist der prozentuale Anteil an Sauerstoff im Trachealraum des Hypers-Stacks während des Zellwachstums. Die Abbildung zeigt, dass über 96 Stunden der Anteil an Sauerstoff zwischen den Schichten, der jeden gasdurchlässigen Folienboden versorgt, konstant bleibt. Dies zeigt die Fähigkeit der Zellen, während des Wachstums auf Sauerstoff zuzugreifen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Corning Hypers-Stapelgefäß im geschlossenen System befüllen und ernten.