Name: Closed System Cell Culture Protocol Mit HyperStack Schiffe mit gasdurchlässigen Material Technology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-29T17:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Erfahren Sie das geschlossene System-Protokoll für die Zellkultur mit Corning HYPERStack-Gefäßen und gasdurchlässiger Materialtechnologie. Diese Methode maximiert die Oberfläche für das Zellwachstum und verbessert die Effizienz der Zellernte erheblich.

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Die Autoren bedanken sich bei Lonza Walkersville für ihre Hilfe bei geschlossenen System Wissen, Beutel-Design, Darlehen in Höhe von bag Versiegelungen und Schweißer sowie die Schaffung der Tasche, um HyperStack Schaltpläne danken.

1. HyperStack Schiff - gasdurchlässige Material Technology Hintergrund <ol><li> Die HyperStack Schiff ist eine mehrschichtige Gefäß für geschlossenes System Kultivierung von Zellen, die auf den Gasaustausch setzt durch eine 76.2micron gasdurchlässige Polymerfilm für den Zellstoffwechsel. </li><li> Die HyperStack Schiff unterscheidet sich von traditionellen Zellkulturgefäße, dass es keinen "Headspace" über den Zellen im Inneren des Schiffes. Anstatt mit diesem "Headspace" für den Gasaustausch innerhalb des Gefäßes, die gasdurchlässige Produkte Lufträume (bezeichnet als "Luftröhre" Leerzeichen) unter jeder Kultur Kammer, die zur Atmosphäre offen ist. </li><li> Das tracheale Raum ermöglicht die wachsenden Zellen in jeder Zellkultur-Fach des Schiffes entspricht Gasaustausch haben. </li><li> Das Gas durchlässige Folie ermöglicht Gasaustausch stattfinden und gleichzeitig eine sterile Umgebung. Alle Flüssigkeit Manipulationen für jede der mehreren Schichten entstehen durch einen einzigen Eintrag Port. </li></ol> 2. HyperStack Schiff Component Summary <ol><li> Die Stackette ist die individuelle Zellkultur-Fach, das sich aus der oberen Platte und Gas durchlässige Folie hergestellt wird. Die Zellen werden in diesem Kompartiment kultiviert. </li><li> Das Liquid Manifold verbindet jeder der 12 stackette Schichten zusammen innerhalb eines HyperStack Modul. Die Module sind mit Schläuchen verbunden Schiffe in Vielfachen von 12 Schichten bilden. Die vielfältigen erlaubt dem Benutzer, ein Fluid Manipulation auf das gesamte Schiff zu machen. </li><li> Der Luftverteiler verbindet auch die stackette Schichten zusammen, aber es verwendet, um Luft aus dem Behälter zu verdrängen, wenn die Flüssigkeit Ergänzungen auftreten. Es enthält eine Markierung für den Einsatz während der Befüllung. </li><li> Die Tracheal Raum ist die Freifläche zwischen den einzelnen stackette Schicht, so dass der Gasaustausch durch jede Schicht "Gas-durchlässige Folie auftreten. </li><li> Die Liquid-Handling-Schlauch wird die Flüssigkeit Verteiler verbunden und dient dazu, alle geschlossenen System Fluid-Manipulationen zu machen. Diese Komponente kann angepasst werden. </li><li> Die Vent-Schlauch wird an die Luft Verteiler verbunden, enthält einen Luftfilter, und wird verwendet, um überschüssige Luft freisetzt und gleichzeitig Aufrechterhaltung der Sterilität. </li><li> Die Jagd Schlauch hat einen Filter und klemmen und mit dem Liquid-Handling-Schlauch verbunden und werden verwendet, um die Flüssigkeit aus dem Liquid-Handling-Schlauch nach dem Befüllen des Behälters zu evakuieren. </li><li> Die Corning-Stack Manipulator oder CSM ist ein Handhabungsgerät bei der Platzierung der Schiffe in die richtigen Positionen während des Einsatzes zu unterstützen. </li><li> Die Füllung Wedge ist ein Edelstahl-Unterstützung verwendet werden, wenn manuellen Befüllen der HyperStack Schiffe. </li></ol> 3. Gas Diffusion Ergebnisse durch gasdurchlässige Film in der HyperStack eingesetzten Schiffe <ol><li> In der traditionellen Zellwachstum Systeme mit innenbelüfteten Kopfraum wird der Sauerstoff in den Medien um durchschnittlich 50% über 3 Tage in Kultur erschöpft. (Abbildung 1) </li><li> In der gleichen Zelle Wachstum-System wird der Sauerstoff-Gradienten in einem nur 3mm Höhe von Medien fast 50% mehr an die Medien, Kopfraum Kreuzung, als es an der Zellschicht. (Abbildung 2) </li><li> Die Diffusion von Sauerstoff durch die 76.2micron gasdurchlässige Polystyrol Film ist gleich der Diffusion durch 2.6mm von Medien. Das Gas durchlässige Folie in der HyperStack Schiffe eingesetzt ermöglicht den Gasaustausch an der Zellschicht auftreten. </li><li> Die% des Sauerstoffs in der Luftröhre Raum des HyperStack Schiffe konstant bleibt, wie Zellen bis zur Konfluenz wachsen. (Abbildung 3) </li></ol> 4. Medien Bag Vorbereitung <ol><li> Die HyperStack-12-Schicht Schiff nimmt 1.3L der Medien und der HyperStack-36-Schicht Schiff nimmt 3.9L von Medien. </li><li> Vor Beimpfung Ihrer eingesackt Medien, wenn Serum verwendet werden soll, schweißen Rohr das Serum Tasche, um die Medien Tasche und gründlich mischen. </li><li> Clamp off etwa 300 ml von Medien in der Tasche mit großen Sackklemmen. Dies wird sicherstellen, dass alle inokulierten Zellen während der Befüllung und keiner in den Medien Tasche verbleibenden verwendet werden. Legen Sie die Medien Tasche auf Tasche stehen. </li></ol> 5. Impfen Medien <ol><li> Füllen Sie eine Spritze mit Schlauch mit Zellsuspension befestigt. Rohr schweißen 3 / 16 "Schlauch aus einer Spritze mit Zellsuspension zu den Medien Tasche. </li><li> Inject der Zellsuspension in die Media-Tasche und gut mischen. </li></ol> 6. Füllen Procedure <ol><li> Rohr schweißen die beimpfte Medien Tasche, um die HyperStack Schiffes 3 / 8 "Liquid-Handling-Schlauch. (Mit sterilen Verbindet oder Multipurpose verbindet (MPL), können Sie auch legen die Medien Tasche, um das Schiff). </li><li> Schließen Sie die Klemmen auf der Liquid-Handling-und jagen Rohre auf der HyperStack. </li><li> Legen Sie die HyperStack 36 Layer-Schiff in das CSM in der Last Position; Haken der Entlüftungsfilter Schlauch in die Halteklammer auf der CSM. Ziehen Sie den Deckel ab und bewegen Sie den CSM, um die Füllung Position. Indem das Schiff in die richtige Position zu füllen, die Luft-Filter ist nun in die höchste Position, um die Benetzung während füllen Betrieb zu verhindern. Die 10 °-Winkel ermöglicht equilibrATION der Flüssigkeit, um die Schichten während der Befüllung. Die HyperStack-12-Schicht Schiff auf seiner Seite auf dem Füllkeil gelegt wird in die richtige Position für die Abfüllung. </li><li> Klare Luft von der Füllhöhe durch die Positionierung der Tasche auf dem gleichen Niveau wie die HyperStack Gefäß (nicht höher). Keeping the chase Schlauchklemme geschlossen; öffnen Sie das Liquid-Handling-Schlauchklemme und Medien Tasche Klemme an Flüssigkeit ermöglichen, das Schiff betreten. </li><li> Mit der Tasche stehen, erhöhen die Medien Tasche, um die Zellsuspension fließen in das Schiff zu helfen. </li><li> Füllen Sie den Behälter, bis die alle geimpft Medien betritt das Schiff, das 300 ml Medien sollten noch in den oberen Teil der Medien Tasche bleiben. Entfernen Sie die Klammer aus den Medien Tasche, um weiterhin Befüllen des Behälters. Als flüssige Ansätze der oberen Luft-Verteiler, verlangsamen die Füllrate durch eine Senkung der Medien Tasche, um Überfüllung zu vermeiden. Langsam bringen den Flüssigkeitsstand auf die Markierung und klemmen Sie die Liquid-Handling-Schlauch. </li></ol> 7. Isolation Vorgehensweise, um Flüssigkeit in der Ebenen-Sperre <ol><li> Bringen Sie die HyperStack Schiff in der CSM für die Isolierung so zu positionieren, beide Arten von Verteilern in die höchste Position und senken Sie die Medien Tasche unterhalb der Höhe des Schiffes. Die HyperStack-12-Schicht Schiffes können in die Isolation Position, indem sie eine Hand an der Seite des Schiffes und mit dem anderen auf die Füllkeil Lift angehoben werden. </li><li> Mit der Jagd-Filter in einer aufrechten Position gehalten wird, öffnen die Jagd Schlauchklemme. Dies wird leer oder jagen die Medien in der Liquid-Handling-Rohr wieder in den Medien Tasche. Sobald der Schlauch leer ist, schließen Sie die Klemme an die Medien bag Schlauch. </li><li> Keeping the chase Schlauchfilter in einer aufrechten Position, öffnen Sie die Klemme an der Liquid-Handling-Rohr auf der HyperStack, damit alle verbleibenden Flüssigkeit zu betreten und in das Gefäß ins Gleichgewicht. Warten Sie 1-2 Minuten für diese auftreten. </li><li> Drehen Sie den HyperStack Schiff in der CSM, so dass die Verteiler auf der linken Seite. Senken Sie den Behälter, um die Last Position auf dem CSM. Rocking the HYPEStack-12-Schicht Schiff leicht nach links wird die Beseitigung der die Füllung Keil. Schließen Sie die Klemmen auf beiden die Verfolgung auf und Liquid-Handling-Schlauch. </li><li> Die Medien Beutel kann nun aus dem Gefäß entfernt werden oder es kann für den Einsatz befestigt später in der Ernte Verfahren bleiben. So speichern Sie das beigefügte Medien Tasche, rollen Sie die leere Tasche und alle übrigen Medien in der Tasche, und unter der Haltebänder in der Ablage der HyperStack Schiff. </li><li> Bewegen Sie den HyperStack Schiff in den Inkubator. Bei der Durchführung des Schiffes ist darauf zu halten, vom Betreten des Belüftungsfilter Flüssigkeit sein. Dies wird durch Kippen der vielfältigen Ende des HyperStack leicht nach oben erreicht. </li></ol> 8. Ernte-Protokoll <ol><li> Zu Beginn der Ernte Verfahren, schweißen Rohr der Zelle Dissoziationslösung und Quench Beutel zusammen, um die Ernte Tasche zu bilden. Sicherstellen, dass alle Schlauchklemmen geschlossen sind. (Verwenden Karikatur zu zeigen) </li><li> Entfernen HyperStack Schiff aus dem Inkubator, lassen Sie die Medien Tasche unter der Haltebänder und hänge auf der Tasche stehen. Legen Sie das Schiff in der CSM in der Last Position und ziehen Sie den Deckel auf das Gefäß zu sichern. Haken Sie die Entlüftung Schlauch in die Halteklammer und bewegen Sie den CSM, um die Füllung Position. </li><li> Sicherstellen, dass die Medien Tasche auf der Tasche stand hängt niedriger als die HyperStack; öffnen Sie die Klemme an die Medien bag Schlauch und das Schiff ist Liquid-Handling-Schlauch, damit Medien in der beiliegenden Tasche fließen. </li><li> Sobald das Schiff geht ¾ leer, ändern Sie die CSM-Einstellungen, um die endgültige Position leer. Wenn die HyperStack Schiff und Liquid-Handling-Schläuche leer sind, heben Sie den Schlauch an den Medien vorbei die Klemme an der verbrauchten Medien bag Schlauch jagen, dann schließen Sie die Klemme an der Liquid-Handling-Schläuche und die Klemme an der verbrauchten Medien bag Schlauch. </li><li> Ersetzen Sie die verbrauchte Medien Tasche mit der Ernte Tasche Montage von Rohr Schweißen und erhöhen die Höhe der Zelle Dissoziation Tasche Montage über die Höhe des HyperStack mit der Tasche stehen. </li><li> Setzen Sie den CSM in der Äquilibrierung Position. Öffnen Sie die Zelle Dissoziationslösung Schlauchklemme und die Lösung in die HyperStack. Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, schließen Sie die Klemmen auf der Liquid-Handling-Schläuche und die Zelle Dissoziationslösung Schlauch. </li><li> Bringen CSM, um die Last Position. Durch das Halten der horizontalen Positionierung Hebel öffnen, schaukeln das Schiff hin und her mit dem Rad, Verteilen der Lösung in den Zellschichten. Das Schiff kann gelegentlich zu den Ausgleich Position beim Wippen auf eine gleichmäßige Verteilung der Lösung zu halten zurückgegeben werden. Es kann nicht visuell erkennbar, dass die Schichten völlig überzogen sind, aber die Dissoziation Lösung wird gleichmäßig über die Oberfläche der Zellen verteilt werden. Sobald die Lösung angemessen verteilt wurden, lassen Sie den Hebel auf der CSM die HyperStack in der Last seiner Position einrasten. Verlassen Sie die HyperStack in dieser Positionwährend der notwendigen Dissoziation Zeit für Ihre Zellen. </li><li> Sobald die Zellen abgelöst haben, mit Trübung als Leitfaden, bewegen Sie den CSM zur Equilibrierung Position. Es sollte darauf geachtet werden, dass über verdauen die Zellen sein. Öffnen Sie die stillen Tasche Klemme und die HyperStack Liquid-Handling-Schlauchklemme, damit die stillen Medien in das Gefäß geben. Schließen Sie die Klemme an der HyperStack Liquid-Handling-Schlauch, wenn die Übertragung abgeschlossen ist. </li><li> Senden Sie das CSM, um die Last Position und halten Sie die horizontale Positionierung Hebel, um das Schiff seitlich Felsen. </li><li> Mit der Tasche stehen, senken Sie die Position der Ernte Tasche Montage unter dem Niveau des HyperStack. Passen Sie die CSM auf die leere Stelle, öffnen Sie das Gefäß Liquid-Handling-Schlauchklemme und übertragen Sie die Zelle Lösung wieder in die stillen Tasche. Senden Sie das CSM, um die Last Position und trennen Sie die Ernte Tasche Montage aus dem Behälter mit einem Schlauch Versiegelung. Die Zell-Lösung zur Verarbeitung bereit ist. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse <ul><li> Erntezeit muss optimiert bei der Umwandlung von einer Standard-Polystyrol-Oberfläche, um das Gas durchlässig Polystyrol-Oberfläche sein. Zellen neigen dazu, schneller Freisetzung auf der HyperStack Produkt. </li><li> Um Zellen unter dem Mikroskop die Lüftungs-und Liquid-Handling-Schlauch muss abgeklemmt werden. Legen Sie die HyperStack Schiff auf den Kopf, mit dem Verteiler nach unten, auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Prävention Schritte unternommen werden können, um zu vermeiden Benetzung der Filter während des Gebrauchs, die dazu führen sie nicht mehr funktioniert werden. Mit nicht mehr als Füllung der HyperStack Schiff und halten die Luft jagen und Schläuche erhöht, wenn die Klemmen offen sind, sollten keine Benetzung auftreten. </li><li> Der Druck der geschlossenen Klammern an den Schlauch verursacht es geschlossen bleiben, nachdem die Klammern geöffnet werden. Kneifen Sie den Schlauch in die entgegengesetzte Richtung zu öffnen. </li><li> Medien Fließzeit Ein-und Aussteigen HyperStack Schiff via Schwerkraft ist auf dem Medium Höhenunterschied zwischen der obersten Ebene der Medien in der HyperStack Schiff und die oberste Ebene der Medien in den Medien Behälter. Der größere Abstand ist, desto schneller fließen. Der maximale Durchfluss wird durch die Bewertung der Filter 1.5L/min begrenzt. </li><li> Ausreichender Füllvolumen in der HyperStack Schiff wird verhindern, dass Luft Blasenbildung in das Zellwachstum Kammern. Luftblasen können entstehen durch Stichproben oder Inkubation in einem unhumidified Umwelt durch Wasserverlust durch Verdunstung. Die Probenahme Menge und Häufigkeit sowie Inkubationsbedingungen wird entscheiden, ob zusätzliche Flüssigkeit durch den Endbenutzer hinzugefügt werden sollte. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Oxygen Depletion von Medien in einem Standard-Zellkulturschale. Die Abbildung zeigt die Abnahme in mg / L Sauerstoff auf der Ebene der Zellen über 3 Tage. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Oxygen Gradienten in den Medien in einer Standard-Zellkulturschale. Die Abbildung zeigt die mg / l Sauerstoff am größten ist die Medien-Headspace-Kreuzung als an der Zellschicht. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Sauerstoffanteil in der Luftröhre Raum des HyperStack während des Zellwachstums. Die Abbildung zeigt, dass mehr als 96 Stunden ist der Anteil von Sauerstoff zwischen den Schichten, die jeweils gasdurchlässigen Folie unten liefert, konstant bleibt. Dies demonstriert die Fähigkeit der Zellen mit Sauerstoff während des Wachstums den Zugang zur Konfluenz.

7745209: Die HyperStack Schiff gasdurchlässige Technologie wird unter US-Patent # abgedeckt. Die Autoren sind Mitarbeiter von Corning Life Sciences, Inc, dass das Instrument in diesem Artikel verwendet produziert.

HyperStack Schiff erfolgreich gewachsen entwickelt, Primär-und Stammzellen. Fluid-Ergänzungen in den Behälter müssen über aseptische Beutel Verbindungen wurden durch Schwerkraft und auch durch Pumpen aus einem sterilen Medien Behälter geleitet. Das Schiff bietet eine mehr als das 2,5 fache Erhöhung der Wachstumsbereich im Vergleich zu einem Plattenstapelzellen Produkt der gleichen volumetrischen Fußabdruck. Die HyperStack-12 ist mit 6.000 cm 2 Wachstumsbereich, der HyperStack-36, 18.000 cm 2 Wachstumsbereich, und das HyperStack-120 hat 60.000 cm 2 der Wachstumsbereich. Durch Vergrößerung der Oberfläche, werden die Benutzer in der Lage, mehr Zellen aus der gleichen Zellpopulation oder viel zu schaffen und Variabilität. Sie sind auch in der Lage, Raum und / oder Arbeit mit weniger Schiffe auf der gleichen Zelle Output zu erzielen, oder erhöhen Messsignaländerung ohne Zusatz von Menschen, Reinraum-Suiten oder Inkubatoren zu speichern. Das System ist mit niedrigen Partikel-Montageverfahren und ohne die Verwendung von Klebstoffen hergestellt. Es ist ein geschlossenes System, mit Schlauch und Filtern, dreifach verpackt und steril geliefert vormontiert ist.

<table><tbody><tr><td>1,5-L-Medienbeutel</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>1350 ml Medium + 150 ml Serum (falls erforderlich)</td></tr><tr><td>4,0-L-Medienbeutel</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>3600 ml Medium + 400 ml Serum (falls erforderlich)</td></tr><tr><td>HYPERStack-Behälter-12</td><td>Corning</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>HYPERStack-Behälter-36</td><td>Corning</td><td>10036</td><td></td></tr><tr><td>Füllkeil</td><td>Corning</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>Stack-Manipulator</td><td>Corning</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>HyQtainer-Subassembly-Probenahmeeinrichtung</td><td>Hyclone</td><td>SH3B0324.01</td><td></td></tr><tr><td>600 ml baggiertes Medium-Quenchmittel (10 % FBS IMDM)</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>600 ml Zelldissoziationslösung</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr></tbody></table>

closed system cell culture protocol mit hyperstack schiffe mit gasdurchlässigen material technology

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Großvolumige adhärente Zellkultur wird derzeit standardisiert Plattenstapelzellen Zellwachstum Produkte, wenn Mikroträger Perlen sind nicht die optimale Wahl. HyperStack Schiffe ermöglichen geschlossenes System Scale-up aus dem aktuellen Plattenstapelzellen Produkte und liefert&gt; das 2,5 fache mehr Zellen in der gleichen volumetrischen Fußabdruck. Die HyperStack Schiffe Funktion über gasdurchlässige Material, das den Gasaustausch stattfinden kann, daher entfällt die Notwendigkeit für die interne Kopfraum innerhalb eines Gefäßes. Die Beseitigung der Kopfraum ermöglicht das Fach, wo das Zellwachstum tritt minimiert werden, um Platz zu reduzieren, so dass mehrere Schichten des Zellwachstums Fläche innerhalb der gleichen volumetrischen Fußabdruck. Für viele Anwendungen wie z. B. Zelltherapie oder zur Herstellung von Impfstoffen, ist ein geschlossenes System für das Zellwachstum und die Ernte benötigt. Die HyperStack Schiffes ermöglicht Zelle und Reagenz Hinzufügen und Entfernen über Schläuche aus Medien Säcken oder anderen Methoden. Dieses Protokoll wird erklärt, die Technologie hinter dem Gas-durchlässigen Material in der HyperStack Schiffe, Gasdiffusion Ergebnisse verwendet, um die metabolischen Bedürfnisse von Zellen, geschlossenes System Zellwachstum Protokolle und verschiedene Ernteverfahren gerecht zu werden.

Eine Einführung in die Technologie, das Protokoll und die Handhabung der Corning HyperStack Schiffe und Zubehör für High-Yield-adhärente Zellkultur verwendet. Das Protokoll wird zeigen, wie man das geschlossene System Schiffe zur Erhöhung der Zellernte über aktuelle Plattenstapelzellen Produkte zu verwenden.

Closed System Cell Culture Protocol Mit HyperStack Schiffe mit gasdurchlässigen Material Technology

Die adhärente Zellkultur in großem Volumen wird derzeit standardmäßig mit gestapelten Zellkulturplatten durchgeführt, sofern Mikrocarrier-Beads keine optimale Wahl darstellen.

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die korrekte Anwendung der Corning Hypers-Stack-Gefäße im geschlossenen System zu demonstrieren. Dies wird zunächst erreicht, indem die Gefäße über die Schwerkraftzufuhr mit Zellkulturmedium beimpft und befüllt werden. Anschließend wird die Zellsuspension in jeder der Schichten isoliert und die Zellen inkubiert.Nach der Inkubation wird das verbrauchte Medium entfernt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen aus den Hypers-Stack-Gefäßen zu gewinnen. Abschließend werden Gassdiffusionsergebnisse erhalten, um die Fähigkeit der Zellen nachzuweisen, während des Wachstums bis zur Konfluenz Sauerstoff zu nutzen, wenn das geschlossene Hypers-Stack-System verwendet wird.Der Hauptvorteil des Hypers-Stack-Gefäßes mit gasdurchlässigem Material liegt darin, dass es eine vergrößerte Oberfläche für das Zellwachstum bietet. Indem der Kopfraum im Gefäß eliminiert wird, wird mein Kollege p pardo nun ein Protokoll für ein geschlossenes System zur Verwendung des Hypers-Stack-Gefäßes demonstrieren. Das Hypers-Stack-Gefäß besteht aus einem Stat, der die einzelne Zellkulturkammer darstellt und aus der oberen Platte sowie einem gasdurchlässigen Film aufgebaut ist.Die Zellen werden in diesem Kompartiment kultiviert. Der Flüssigkeitsverteiler verbindet jede der Etten-Schichten innerhalb eines Moduls miteinander. Module werden mit Schläuchen verbunden, um Gefäße in Vielfachen von 12 Schichten zu bilden.Mittels des Verteilers kann der Benutzer eine einzige Fluidmanipulation an dem gesamten Gefäß vornehmen. Der Luftverteiler verbindet ebenfalls die Stat-Schichten miteinander, dient jedoch dazu, Luft aus dem Gefäß zu verdrängen, wenn Flüssigkeiten hinzugefügt werden, und verfügt über eine Füllleitung, die beim Befüllen zwischen den einzelnen Schichten verwendet wird. Die Stat-Schicht ist ein luftgefüllter Hohlraum, der als trachealer Raum bezeichnet wird und den Gasaustausch über die gasdurchlässige Folie jeder Schicht ermöglicht.Die Flüssigkeitsmanipulationsleitung ist mit dem Flüssigkeitsverteiler verbunden und stellt eine anpassbare Komponente dar, die für alle Fluidmanipulationen im geschlossenen System verwendet wird, um überschüssige Luft abzulassen, während die Sterilität aufrechterhalten wird. Es wird eine Entlüftungsleitung verwendet. Die Entlüftungsleitung ist mit dem Luftverteiler verbunden und enthält einen Luftfilter.Verbunden mit der Flüssigkeitsmanipulationsleitung ist die Spülleitung und der Filter, die verwendet werden, um die Flüssigkeit aus der Flüssigkeitsmanipulationsleitung zu entfernen, nachdem der Behälter befüllt wurde. Ebenfalls in diesem Protokoll verwendet wird der Corning Stack-Manipulator oder CSM, ein Handhabungsgerät, das beim Platzieren der Behälter in die korrekten Positionen während der Anwendung hilft. In dieser Demonstration wird die Zellkultur im geschlossenen System für einen gasdurchlässigen 36-Schichten-Behälter gezeigt.Bei Verwendung eines CSM finden sich jedoch Details zur Durchführung dieses Verfahrens an einem 12-Schicht-Behälter mit einem Füllkeil im beigefügten schriftlichen Protokoll. Bereiten Sie zunächst 3,9 Liter abgepacktes Medium vor, bevor Sie die Mediaröhre inoculieren. Verbinden Sie die Serum- mit der Mediatasche und mischen Sie gründlich, um die gewünschte Serumkonzentration zu erreichen.Klemmen Sie mithilfe großer Beutelklemmen etwa 300 Milliliter Medium im Beutel ab. Dadurch wird sichergestellt, dass alle inkulierten Zellen während des Befüllens verwendet werden und keine im Mediumbeutel verbleiben. Stellen Sie den Beutel auf einen Beutelständer, um das Medium zu inkulieren.Füllen Sie eine mit Schlauch verbundene Spritze mit der Zellsuspension. Befestigen Sie die Spritze mit der Zellsuspension an der Medium-Tüte durch Schlauchschweißen. Drei über 16 Zoll Schlauch von der Spritze zur Tüte.Injizieren Sie die Zellsuspension in den Medienbeutel und mischen Sie sie gründlich. Der beimpfte Medienbeutel kann mittels Schlauchschweißen oder mit Mehrzweckverbindern an den 3/8-Zoll-Flüssigkeitsschlauch des Gefäßes angeschlossen werden. Heute werden wir das Schlauchschweißen verwenden.Schließen Sie die Klammern an den Flüssigkeitsmanipulations- und Nachführrohren des Gefäßes. Stellen Sie das 36-Schicht-Gefäß in eine CSM in die Ladeposition. Haken Sie das Entlüftungsfilterrohr in die Halteklammer an der CSM ein.Schließen Sie den Deckel fest und bewegen Sie das CSM in die Füllposition, um den Luftfilter in die höchste Position zu bringen und so eine Benetzung während des Füllvorgangs zu verhindern. Der 10-Grad-Winkel ermöglicht zudem die Gleichgewichtseinstellung der Flüssigkeit zwischen den Schichten während des Füllens, wobei Luft aus der Füllleitung entweicht. Positionieren Sie die Mediumsbeutel auf derselben Höhe wie das Gefäß, während die Klemme des Spülschlauchs geschlossen bleibt.Öffnen Sie die Schlauchklemme für die Flüssigkeitsabgabe und die Beutelklemme des Mediums, um den Flüssigkeitsfluss in das Gefäß zu ermöglichen. Heben Sie mithilfe des Beutelständers den Mediumsbeutel an, um den Einfluss der Zellsuspension in das Gefäß zu unterstützen. Füllen Sie das Gefäß, bis das gesamte inoculierte Medium in das Gefäß eingeflossen ist.Im oberen Bereich des Mediumsacks sollten sich noch 300 Milliliter Medium befinden. Entfernen Sie die Klemme vom Mediumsack, um die Befüllung des Gefäßes fortzusetzen, wenn die Flüssigkeit dem oberen Luftverteiler nahekommt. Verringern Sie die Befüllgeschwindigkeit, indem Sie den Mediumsack absenken, um eine Überfüllung zu verhindern.Bringen Sie den Flüssigkeitspegel langsam bis zur Füllmarkierung und klemmen Sie die Flüssigkeitsmanipulationsleitung ab. Bringen Sie das Gefäß im CSM in die Isolationsposition, wobei beide Manifold-Sätze in die höchste Position gebracht werden. Senken Sie die Mediumsbeutel unter die Höhe des Gefäßes ab. Halten Sie den Spülfilter in aufrechter Position und öffnen Sie die Klemme des Spülrohrs. Dadurch wird das Medium aus dem Flüssigkeitsmanipulationsrohr zurück in die Medium-Tüte geleitet. Sobald das Schlauchsystem leer ist, schließen Sie die Klemme am Schlauch der Medium-Tüte.Halten Sie den Jagdrohrenfilter in aufrechter Position. Öffnen Sie die Klemme am Flüssigkeitsmanagementschlauch des Behälters, um der verbleibenden Flüssigkeit das Einlaufen und Ausgleichen im Behälter zu ermöglichen. Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis dies eingetreten ist.Drehen Sie als Nächstes das Gefäß im CSM, sodass sich die Verteiler auf der linken Seite befinden. Senken Sie das Gefäß in die Ladeposition am CSM ab. Schließen Sie die Klemmen sowohl an der Jagd- als auch an der Flüssigkeitsführungsschlauchleitung.Die Medientasche kann nun vom Gefäß entfernt werden oder für einen späteren Zeitpunkt im Ernteverfahren daran belassen werden. Zum Aufbewahren der befestigten Medientasche rollen Sie diese zusammen und legen sie unter die Haltebänder im Ablagefach des Gefäßes. Schließlich bewegen Sie das Gefäß in den Inkubator. Achten Sie beim Tragen des Gefäßes darauf, dass keine Flüssigkeit in den Luftentlüftungsfilter gelangt.Dies wird erreicht, indem das Manifold-Ende leicht nach oben gekippt wird. Um mit dem Ernteverfahren zu beginnen, verschweißen Sie das Zellverbandlösungsröhrchen und die Abbruchbeutel miteinander, um die Erntesackanordnung zu bilden. Stellen Sie sicher, dass alle Schlauchklemmen geschlossen sind. Entnehmen Sie das Gefäß aus dem Inkubator und stellen Sie es in der CSM in die Ladeposition. Lösen Sie die Medientasche von unterhalb der Haltebänder und hängen Sie sie an der Tasche auf. Stellen Sie sich daneben, ziehen Sie den Deckel fest, um das Gefäß zu sichern. Haken Sie das Entlüftungsrohr in die Halteklammer ein und bewegen Sie das CSM in die Füllposition.Stellen Sie sicher, dass der Mediumsbeutel auf dem Beutelständer tiefer hängt als das Gefäß. Öffnen Sie die Klemme an der Schlauchleitung des Mediumsbeutels und an der Flüssigkeitsdosierschlauchleitung des Gefäßes, um das Medium in den angeschlossenen Beutel fließen zu lassen. Sobald das Gefäß etwa zu drei Vierteln geleert ist, ändern Sie die CSM-Einstellungen auf die endgültige Leerposition.Wenn das Gefäß und die Flüssigkeitsführungsschläuche leer sind, heben Sie den Schlauch an, um das Medium an der Klemme des Schlauchs für den verbrauchten Mediumbeutel vorbeizuleiten. Schließen Sie dann sowohl die Klemme am Flüssigkeitsführungsschlauch als auch die Klemme am Schlauch des verbrauchten Mediumbeutels. Ersetzen Sie den verbrauchten Mediumbeutel durch die Erntetaschenanordnung mittels Schlauchschweißen.Heben Sie die Höhe der Zell-Dissociationsbeutelvorrichtung mithilfe des Beutelständers über die Höhe des Gefäßes an. Bringen Sie das CSM in die Füllposition. Öffnen Sie die Schlauchklemme der Zell-Dissociationslösung und die Klemme der Erntebag-Vorrichtung, und leiten Sie die Lösung in das Gefäß um.Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, schließen Sie die Klemmen an der Flüssigkeitsmanipulationsleitung und an der Leitung für die Zelldissoziationslösung. Bringen Sie anschließend das CSM in die Ladeposition, während Sie den horizontalen Positionierhebel geöffnet halten. Bewegen Sie das Gefäß vorsichtig mit Hilfe des Rads von Seite zu Seite, um die Lösung gleichmäßig über die Zellschichten zu verteilen.Das Gefäß kann gelegentlich während des Schaukelns in die Füllposition zurückgebracht werden, um eine gleichmäßige Verteilung der Lösung sicherzustellen. Sobald die Lösung ausreichend verteilt ist, lösen Sie den Hebel am CSM, um die Füllposition zu verriegeln. Belassen Sie das Gefäß während der erforderlichen Dissoziationszeit der Zellen in dieser Position.Verwenden Sie die Trübung als Orientierungshilfe zur Beurteilung der Zellablösung. Sobald die Zellen abgelöst sind, bewegen Sie das CSM in die Ladeposition. Öffnen Sie die Klemme des Abkühlbeutels und die Klemme der Flüssigkeitsmanipulationsleitung, um das Abkühlmedium in das Gefäß strömen zu lassen.Schließen Sie die Klemme an dem Flüssigkeitsmanipulations-Schlauch. Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, bringen Sie das CSM in die Ladeposition zurück und halten Sie den horizontalen Positionierhebel fest, um den Behälter von Seite zu Seite zu schwenken. Senken Sie mithilfe des Beutelständers die Position der Erntebag-Anordnung unter das Niveau des Behälters. Stellen Sie das CSM auf die leere Position ein. Öffnen Sie die Klammer des Flüssigkeithandhabungsschlauchs des Behälters und überführen Sie die Zelllösung zurück in den Quench-Beutel. Bringen Sie das CSM in die Ladeposition zurück und trennen Sie die Erntebag-Vorrichtung vom Behälter mithilfe eines Schlauchversiegelers.Jetzt ist die Zellsuspension bereit für die Verarbeitung in herkömmlichen Zellkultursystemen. Bei Verwendung von Headspace wird der Sauerstoff im Medium im Durchschnitt um 50 % über einen Zeitraum von drei Tagen verbraucht. In der Kultur zeigt diese Abbildung die Abnahme der Sauerstoffkonzentration in Milligramm pro Liter auf der Ebene der Zellen über die Zeit im selben Kultursystem; der Sauerstoffgradient über eine Mediumshöhe von drei Millimetern ist an der Grenzfläche zwischen Medium und Headspace nahezu 50 % größer als an der Zellschicht.Der Sauerstoffanteil im trachealen Raum des Hypers-Stapels während des Zellwachstums ist dargestellt. Die Abbildung zeigt, dass über einen Zeitraum von 96 Stunden der Sauerstoffanteil zwischen den Schichten, der jede gasdurchlässige Folienunterseite versorgt, konstant bleibt. Dies verdeutlicht die Fähigkeit der Zellen, während des Wachstums bis zur Konfluenz auf Sauerstoff zuzugreifen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Corning Hypers stack-Gefäß im geschlossenen System befüllt und Ernte gewinnt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Wir haben eine automatisierte Zellkultur und Verhör Plattform für Mikro-Skala-Zell-Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform bietet eine einfache, vielseitige und präzise Kontrolle in den Anbau und die Förderung kleiner Populationen von Zellen und Gewinnen Lysate für molekulare Analysen. Die Plattform wird auch auf Studien, die kostbaren Zellen und / oder Reagenzien geeignet.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für die vorübergehende Permeabilisierung der adhärenten Zellen unter Verwendung eines inerten Gasstrahl. Diese Technik erleichtert die Übertragung von genetischem Material und Biomolekülen in adhärente Säugetierzellen durch die Verwendung von mechanischen Kräften, um die Plasmamembran zu stören.

Permeabilisierung der anhaftenden Zellen mit einem Inertgas Jet

Hier ist ein Protokoll zur Züchtung von pluripotenten Stammzellen (PSC) und neuralen Stammzellen (NSC) in einem geschlossenen Zellkultursystem, das maximale Sterilität und Reproduzierbarkeit ermöglicht und die traditionelle Biosicherheitswerkbank und den Inkubator ersetzt. Dieses Gerät entspricht den Richtlinien der Clinical Good Manufacturing Practice (cGMP) und der Clinical Good Lab Practice (cGLP).

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung einzelner Zellen mit einer mikrofluidischen Plattform, die ein neues Mikrotiter-Designkonzept verwendet, um eine hocheffiziente Einzelzellisolierung und eine langfristige klonale Kultur zu ermöglichen.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Wir präsentieren ein mikrofluidisches Krebs-on-Chip-Modell, die "Evolution Accelerator"-Technologie, die eine kontrollierbare Plattform für langfristige Echtzeit-quantitative Studien zur Krebsdynamik innerhalb klar definierter Umweltbedingungen an der Einzelzelle bietet. niveau. Es wird erwartet, dass diese Technologie als In-vitro-Modell für die Grundlagenforschung oder die präklinische Arzneimittelentwicklung funktioniert.

Generierung heterogener Arzneimittelgradienten über Krebspopulationen auf einem mikrofluidischen Evolutionsbeschleuniger zur Echtzeitbeobachtung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, mit dem adhärente Zellen aus mehrschichtigen Kolben in einer geschlossenen, halbautomatischen Weise unter Verwendung eines Gegenstromzentrifugationssystems gewonnen werden können. Dieses Protokoll kann sowohl für die Ernte von adhärenten als auch von Suspensionszellen von anderen Zellexpansionsplattformen mit wenigen Änderungen an den bestehenden Schritten angewendet werden.

Humane mesenchymale Stammzellprozessierung für klinische Anwendungen in einem geschlossenen, halbautomatischen Workflow

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Herstellung von adhärenten Zellen in großem Maßstab durch ein vollständig geschlossenes System auf der Basis von auflösbaren Mikroträgern in GMP-Qualität zu erreichen. Die Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen, HEK293T Zellen und Vero-Zellen wurde validiert und erfüllte sowohl die Quantitätsanforderungen als auch die Qualitätskriterien für die Zell- und Gentherapieindustrie.

Großtechnische Zellproduktion auf Basis von auflösbaren porösen Mikroträgern in GMP-Qualität

Erfahren Sie das geschlossene System-Protokoll für die Zellkultur mit Corning HYPERStack-Gefäßen und gasdurchlässiger Materialtechnologie. Diese Methode maximiert die Oberfläche für das Zellwachstum und verbessert die Effizienz der Zellernte erheblich.

Closed System Cell Culture Protocol Mit HyperStack Schiffe mit gasdurchlässigen Material Technology

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