Loading Drosophila Nerve Terminals mit Calcium-Indikatoren

Hallo, mein Name ist Greg McLeod. Mein Labor untersucht die Kalziumregulation in Nervenendigungen und deren Auswirkung auf die Neurotransmission. Dies tun wir in Drosophila melanogaster.

Die Fruchtfliege ist aufgrund ihrer genetischen Modifizierbarkeit und ihres einfachen, gut zugänglichen Nervensystems ein attraktives Modell für Neurowissenschaftler. In diesem Nervensystem stehen genetisch einkodierte fluoreszierende Indikatoren zur Verfügung, um Kalziumänderungen in Nervenendigungen nachzuweisen. Diese Indikatoren weisen jedoch eine begrenzte Empfindlichkeit gegenüber Kalzium auf und zeigen oft eine nichtlineare Antwort.

Synthetische Indikatoren eignen sich besser zur Messung der schnellen Kalziumänderungen, die mit der Nervenaktivität verbunden sind. Wir werden eine Technik zur Beladung von lebenden Nervenendigungen in oph lava mit dextrin-konjugierten synthetischen Kalziumindikatoren demonstrieren. Die Dextrinkonjugation hilft dabei, zu verhindern, dass Kalziumindikatoren in Organellen wie Mitochondrien eingeschlossen werden.

Die Beladetechnik kann gleichermaßen auf Larven, Embryonen und erwachsene Exemplare angewendet werden. Wir werden eine Larve in einem kleinen Zigarrenbad auf einem Objektträger präparieren. Der blaue Zahnwachs wird einen Glasladeplatz tragen.

Nehmen Sie eine wandernde dritte Larve aus Sternlava von der Seite eines unbesetzten Gefäßes. Legen Sie die Larve in mehrere Tropfen gekühlte Schneider-Lösung und fixieren Sie sie durch Kopf und Schwanz, wobei die dorsale Mittellinie nach oben zeigt. Verwenden Sie ein scharfes Paar Mikroscheren, um einen Einschnitt zu machen.

Ein kleiner Einschnitt zwischen den Tra hier, groß genug, um die untere Scherenklinge eindringen zu lassen. Schneiden Sie entlang der dorsalen Mittellinie zwischen den Traia bis zum Kopf durch die Kutikula. Drehen Sie die Larve um 180 Grad und verlängern Sie den Einschnitt bis zum Schwanzende.

Es ist wichtig, darauf zu achten, dass die untere Klinge nicht zu tief in die Eingeweide eindringt, sondern in die Larve, da dies die Muskeln und Nerven beschädigen würde, die untersucht werden sollen. Der größte Teil der Eingeweide wird sich durch den Einschnitt nach oben schieben; schneiden Sie hier nahe am Schwanz einen Strang ab und durchtrennen Sie den darunterliegenden Trachealstrang bis zum Kopf. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite.

Entfernen Sie den Großteil der Eingeweide, indem Sie diese abschneiden und aus dem Bad herausnehmen. Legen Sie eine kurze Pause ein, legen Sie die Schere beiseite und nehmen Sie ein zweites Paar Pinzetten zur Hand. Greifen Sie mit dieser die abgeschnittene Kante der Cuticula und heften Sie sie straff auf eine Seite.

Wiederholen Sie den Vorgang auf der anderen Seite. Fahren Sie vier Segmente in Richtung Kopf fort, um das Verfahren zu wiederholen. Schneiden Sie. Alle verbleibenden Eingeweide in diesem Stadium. Stellen Sie sicher, dass in keinem der Segmente die Muskeln 7, 6, 13 oder 12 beschädigt wurden.

Falls welche beschädigt wurden, dissezieren Sie eine weitere Larve, da dieser Schaden zwangsläufig zu genischen Kontraktionen führt, die jegliche anschließende Bildgebung erschweren würden. Die Gehirnhälften, das ventrale Ganglion und die Segmentnerven sind nun in den folgenden Schritten sichtbar. Wir ziehen das Druckschnittende in das Segmentnervende in ein Glas-FOP-Bett und verwenden einen Kunststoff-Füllfaden, um einen Kalziumindikator auf das freigelegte Nervenende aufzutragen.

Doch zuerst demonstrieren wir, wie man das Füllfilament und den Fülleffekt herstellt, um das Füllfilament zu erzeugen. Eine zweistufige Ziehtechnik wird auf einen gelben Defekt angewendet, der langsam bis zur Hälfte seiner Länge erhitzt wird, bis der Kunststoff weich und durchsichtig wird. Beenden Sie das Erhitzen an diesem Punkt und ziehen Sie sofort die Spitze nach oben, um sie zu einem feinen Faden auszuziehen.

Das hat einen Durchmesser von etwa einem halben Millimeter. Schneiden Sie das Filament auf eine Länge von 50 Millimetern zu. Legen Sie nun das Filament unter ein Stereomikroskop und fixieren Sie den Schnitt.

Beenden Sie mit einer Miniaturansicht und ziehen Sie das andere Ende, um einen feinen Faden von einem Zentimeter Länge herauszuziehen. Dieser muss mit einer neuen Rasierklinge auf Filterpapier abgeschnitten werden, um zu vermeiden, dass die Klinge stumpf wird und die Vorbereitung der Füllung beeinträchtigt wird. Beginnen Sie mit einem dünnwandigen Kapillarröhrchen ohne Innenfaden.

Ziehen Sie sie mit einem Petri-Schlepper zu einer feinen, spitz zulaufenden Spitze. Nehmen Sie diese vorbereitete Spitze unter ein Dissektionsmikroskop und ritzen Sie den konischen Bereich mit einem Stück Schleifpapier ein. Drücken Sie die Spitze distal zur Einschnittstelle von der eingeritzten Seite weg, sodass die Spitze sauber abbricht.

Der Innendurchmesser des Bruchs sollte größer sein als der Außendurchmesser. Verwenden Sie am Ende des Füllfadens eine Mikrozange, um den Bruch mit Hilfe einer Flamme in das Glas einzuziehen, bis ein Innendurchmesser von etwa 12 Mikrometern erreicht ist. Verwenden Sie einen Bunsenbrenner, um das stumpfe Ende der Spitze zu polieren.

Negativer Druck kann auf das stumpfe Ende des Effekts mithilfe eines passgenauen Celitrohrs, das mit starrem Polylin-Schlauch und einer Spritze verbunden ist, ausgeübt werden. Dasselbe Rohr und dieselbe Spritze werden verwendet, um den Kalziumindikator in den Faden aufzuziehen und wieder auszustoßen. Der Kalziumindikator sollte in destilliertem Wasser auf eine Konzentration von fünf Milli gelöst werden.

Teilen Sie diese Lösung in Aliquots zu je fünf Mikrolitern auf. Erhitzen Sie diese bei vier Grad Fisch. Gefrieren Sie diese Quats nicht ein, um sie bis zum Gebrauch ungefroren zu halten.

Ziehen Sie nun ein bis zwei Zentimeter des Kalziumindikators in das Filament auf und machen Sie sich bereit für den kritischsten Schritt dieser Beladungstechnik. Nehmen Sie Ihre Schere und Pinzette und durchtrennen Sie die am weitesten vorn liegenden Segmentnerven einzeln und dicht an den ventralen Ganglien. Die am weitesten vorn liegende Segmentnervenmasse vom ventralen Ventral.

Schneiden Sie jeglichen Schmutz ab. Legen Sie das Füllfilament auf die Zahnpastenrampe, wobei die Spitze in der Mitte der Larve liegt. Befestigen Sie das Schulrohr und die Spritze.

Ziehen Sie etwas Schneider-Lösung in eine perfekte Pipettenspitze auf. Ziehen Sie nun das Nervenende in die Spitze hinein. Die Passform muss angepasst, aber nicht zu fest sein.

Es muss den weiteren Zugang der Schneiders zum Schutz sperren. Entfernen Sie im Allgemeinen das scholastische Rohr und den Kolben und befestigen Sie sie am F-Filament. Berühren Sie die Seite des Filaments an den Schneiders im Bad, um statische Elektrizität abzuleiten, und setzen Sie den Filament-Kaugummi-Effekt sofort innerhalb von 50 Mikrometern am Schnitt des Nervs ein, ohne diesen tatsächlich zu berühren.

Langsam den Kalziumindikator auffüllen, um das Volumen des Schneider um etwa ein Drittel zu erhöhen. Dadurch ergibt sich eine endgültige Konzentration des Kalziumindikators von knapp unter zwei Milli. Die Probe danach etwa 40 Minuten lang an einem dunklen, feuchten Ort bei Raumtemperatur lagern. Ich möchte hier zwei wichtige Punkte hervorheben.

Zunächst muss eine physiologische Lösung in der Pipettenspitze vorhanden sein, um den Kalziumindikator zu verdünnen, da der Kalziumindikator allein in Wasser gelöst wurde. Die physiologische Lösung muss Kalzium in einer Konzentration von mehreren Millimolar enthalten, da das Axonende ein kalziumabhängiger Prozess ist und das Axonende für die Erhaltung der Gesundheit der Nervenendigungen unerlässlich ist.

Der zweite Punkt ist, dass zwischen dem Durchtrennen der Nerven und dem Auftragen des Farbstoffs auf das Schnittende des Nervs nicht mehr als fünf Minuten vergehen sollten. Nach fünf Minuten schließen die proximalen Enden der Axone die mit Dextrin konjugierten Kalziumindikatoren mit Molekulargewichten von 10.000 aus. Das Einhalten dieser Zeitspanne erfordert etwas Übung.

Verzögern Sie das Axonende nicht, indem Sie die Kalziumkonzentration senken, da dies nur die zukünftige physiologische Funktion der Nervenschädigung beeinträchtigen würde. Nach der 40-minütigen Inkubation berühren Sie die Vorbereitung in Schneiders vorsichtig mit der Seite des Füllfilaments am Bad und führen es erneut ein, um die meiste Kalziumindikatorlösung aus der Spitze und dem Starter zu entfernen. Ziehen Sie anschließend erneut frische Schneiders-Lösung aus dem Bad mit dem Filament auf und füllen Sie das Bett vollständig mit Schneiders.

Es dürfen keine Blasen im Bett vorhanden sein, da die Schneider-Lösung als einer der Leiter fungiert, um die Badlösung zu isolieren, während der Pet-Glas-angeregte Nerv erneut für mindestens 60 Minuten, jedoch nicht länger als vier Stunden, an einem dunklen Ort aufbewahrt wird. Ersetzen Sie die RINs alle 30 Minuten während der Inkubation durch frische Schneider-Lösung. Der Calciumindikator wird entlang des Axons transportiert und konzentriert sich 20 Minuten vor der Untersuchung der Präparation im Nervenendig. Spülen Sie es mit HL6-Lösung ab.

Enthalten Sie die gewünschte Kalziumkonzentration, wenn der Kalziumspiegel über etwa 0,4 Millimolar liegt, durch Zugabe von Glutamat oder L-Glutaminsäure auf 6 bis 7 Millimolar, um die nervenbedingte Muskelkontraktion zu stoppen. Schneiders Lösung ist für die Kalzium-Bildgebung nicht geeignet, da sie bereits hohe Konzentrationen an Glutamat und Kalzium enthält. Diese Konzentrationen müssen Sie anpassen.

Tate ist ebenfalls vorhanden, sodass Schneiders autofluoreszierende Beladung sowie die Bildgebung in HL6 durchgeführt werden können, solange Calcium während der Beladung in einer Konzentration von mindestens 2 Millionen vorhanden ist. Wenn Sie die Präparation am Auflichtmikroskop für die Bildgebung einrichten, achten Sie erneut darauf, jegliche statische Elektrizität abzuleiten. Berühren Sie dann sowohl die Lösung im Bad als auch das Objektiv mit einer Pinzette.

Wenn es sich bei der Objektiv um ein Immersionsobjektiv handelt, senken Sie dieses in das Bad ab und erden Sie kurzzeitig die Basis zur Stimulation, oder geben Sie eine Elektrode ins Bad und führen die andere zur Füllung des Bettes ein. Gleichstromimpulse mit weniger als drei Volt und einer Dauer von 300 Mikrosekunden erzeugen zuverlässig ein Aktionspotential im Nerv. Hier sehen wir zwei Nervenendigungen im Spalt zwischen den Muskeln sechs und sieben, die durch die zytoplasmatische Expression von GFP sichtbar gemacht wurden. Zudem wurden sie anterograd mit dem Kalziumindikator Rod Dextrin gefüllt, der andere Anregungs- und Emissionsspektren als GFP aufweist.

Dieses Sichtfeld enthält noch immer die Nervenendigungen, aber Rod Rin hat eine geringe Affinität zu Kalzium und ist nahezu unsichtbar, während der Nerv in Ruhe ist. Es reagiert jedoch stark auf das Kalzium, das während einzelner Aktionspotentiale oder kurzer zweisekundiger Reizserien in die Endigungen eindringt. Wie hier in der Fluoreszenzanalyse der eng beieinander liegenden 80-Hz-Reize gezeigt, sind die Antworten in den Typ-1-S-Endigungen gewöhnlich stärker als in den Typ-1-B-Endigungen.

Kalziumindikatoren mit geringer Affinität wie Rod Dextrin und Flu. Ein vierfacher Dextrin zeigte in diesen Endigungen über einen Bereich von 10 bis 80 Hertz nahezu eine lineare Antwort auf Nervenstimulationsfrequenzen. Das hier gezeigte Beispiel stammt von einer Nervenendigung am Muskel Nummer vier, beladen mit Rod Dextrin.