Name: Loading Drosophila Nerve Terminals mit Calcium-Indikatoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Lernen Sie eine Technik zum Laden von Calcium-Indikatoren in Drosophila-Nervenendigungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung schneller Calcium-Dynamiken während der Neurotransmission.

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<ol><li> Wählen Sie eine saubere Präparation Gericht, das nicht an Fixiermittel ausgesetzt wurde. </li><li> Dissect ein wandernder 3 rd instar Drosophila Larve in Schneiders Drosophila Medium mit Ca 2 + und L-Glutamin, (nicht schneiden alle Nerven oder Schäden Muskelfasern Nr. 7, 6, 13 oder 12). </li><li> Wählen Sie ein Glas füllen-Pipette mit einer 12 Mikrometer Spitze (Innendurchmesser). </li><li> Mit einer Spritze und Schlauch (Unterdruck an die Pipette gelten) sicherzustellen, dass die Pipettenspitze nicht behindert wird. </li><li> Wählen Sie eine feine Kunststoff-Füllung-Filament, das untergliedert werden können die Länge der Glaspipette eingebracht. </li><li> Draw ~ 1 cm von 5 mM Dextran-konjugierten Ca 2 +-Indikator in der Kunststoff-Filament. </li><li> Schneiden Sie alle Segment Nerven. </li><li> Unterstützung der Pipette auf eine Rampe, damit die Pipettenspitze auf die ventrale Mittellinie des seziert Larve Ansatz. </li><li> Zeichnen Sie das abgeschnittene Ende eines Nerven zu segmentieren No.4, ohne Quetschung der Nerven, in das Ende der Pipette (mit einer kleinen Menge von Schneider Medium). </li><li> Entfernen Sie die Schläuche und die Kunststoff-Faden in die Pipette bis zum Ende des Fadens wird innerhalb von 50 Mikron das abgeschnittene Ende des Nervs (berühren Sie nicht die Nerven). </li><li> Eject ausreichende Ca 2 +-Indikator auf die Nervenenden, um die Lautstärke des Schneiders Medium um etwa 33% (Endkonzentration sollte &lt;2mm) zu erhöhen. Wichtig - Dies muss innerhalb von 5 Minuten des Schneidens den Nerv abgeschlossen sein. </li><li> Ort der Vorbereitung im Dunkeln bei Raumtemperatur während die Nerven Lasten. </li><li> Nach 40 Minuten entfernen Sie die Ca 2 +-Indikator mit dem Filament. </li><li> Verlassen Sie die Pipette in Ort und füllen Sie es vollständig mit frischen Schneider-Medium, da dies zur stimulierende Impulse, um den Nerv zu beantragen. </li><li> Lassen Sie die Ca 2 +-Indikator in den Nerv für mindestens 60 Minuten ausgleichen, aber nicht mehr als 4 Stunden vor Beginn der Ca 2 +-Imaging. </li><li> Spülen Sie die Zubereitung mit frischen Schneider Medium alle 30 Minuten, während es ausgleichenden ist. </li><li> 20 Minuten vor dem Imaging ersetzen Schneider-Medium mit Hämolymphe-Like No.6 Lösung (HL6; Macleod et al 2002;. 2003). </li><li> L-Glutaminsäure oder Glutamat kann zu HL6 Lösung bei 7mm hinzugefügt werden, um postsynaptische Glutamatrezeptoren desensibilisieren, um Nerven-evozierten Muskelkontraktion verhindern (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005). </li></ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+activity+in+the+Drosophila+larval+CNS+detected+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators.</a> J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).</li>
<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+active+zone+density+during+long-term+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

<table><tbody><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Insekt Medium</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td>muss L-Glutamin und Kalzium enthalten</td></tr><tr><td>Mononatriumsalz-Hydrat der L-Glutaminsäure</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr></tbody></table>

loading drosophila nerve terminals mit calcium-indikatoren

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium spielt viele Rollen im Nervensystem aber keiner eindrucksvoller als als Auslöser für die Freisetzung von Neurotransmittern, und niemand tiefer als wie der Bote essentiell für die synaptische Plastizität, dass Lernen und Gedächtnis unterstützt. Zur weiteren Aufklärung der molekularen Grundlagen der Ca 2 +-abhängige synaptische Mechanismen, ist ein Modell-System benötigt, das sowohl genetisch formbar und physiologisch zugänglich. Drosophila melanogaster bietet ein solches Modell. In diesem System sind genetisch kodierte fluoreszierende Indikatoren zur Verfügung Ca 2 + Änderungen in Nervenendigungen zu erkennen. Allerdings haben diese Indikatoren Empfindlichkeit gegenüber Ca 2 + beschränkt und zeigen oft ein nicht-lineares Ansprechverhalten. Synthetische fluoreszierenden Indikatoren sind besser für die Messung der schnellen Ca 2 + ändert sich mit Nerven-Aktivität assoziiert geeignet. Hier zeigen wir eine Technik zum Be-Dextran-konjugierten synthetischen Ca 2 +-Indikatoren in den Live-Nervenendigungen in Drosophila-Larven. Besonderes Augenmerk wird auf jene Aspekte des Protokolls am wichtigsten für die Technik für den Erfolg, wie, wie elektrostatische Entladungen entlang der isolierten Nerven zu vermeiden, die Erhaltung der Gesundheit der Zubereitung bei längeren Ladezeiten gelegt, und die Gewährleistung Axon Überleben durch Ca 2 + zur Förderung der Abdichtung von abgetrennten Axonendigungen. Geringe Affinität Dextran-konjugierten Ca 2 +-Indikatoren, wie Fluo-4 und rhod, zur Verfügung, die ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu zeigen, während minimal stören präsynaptischen Ca 2 + Dynamik. Dextran-Konjugation hilft zu verhindern, Ca 2 +-Indikatoren werden in Organellen wie Mitochondrien sequestriert. Die Belastung Technik kann auch für Larven, Embryonen und Erwachsenen angewendet werden.

Calcium ist ein allgegenwärtiges Botenstoff im Nervensystem, wichtig für die Auslösung die Freisetzung von Neurotransmittern und Veränderungen der synaptischen Stärke. Hier zeigen wir eine Technik zum Be-Ca 2 +-Indikatoren in Drosophila Nervenendigungen. Wir zeigen auch die Herstellung der erforderlichen Geräte und betonen Punkte von entscheidender Bedeutung für die Technik für den Erfolg.

Loading Drosophila Nerve Terminals mit Calcium-Indikatoren

Calcium spielt viele Rollen im Nervensystem, doch keine ist beeindruckender als die Funktion als Auslöser für die Freisetzung von Neurotransmittern und keine tiefgreifender als ...

Hallo, mein Name ist Greg McLeod. Mein Labor untersucht die Kalziumregulation in Nervenendigungen und deren Auswirkung auf die Neurotransmission. Dies tun wir in Drosophila melanogaster.Die Fruchtfliege ist aufgrund ihrer genetischen Modifizierbarkeit und ihres einfachen, gut zugänglichen Nervensystems ein attraktives Modell für Neurowissenschaftler. In diesem Nervensystem stehen genetisch einkodierte fluoreszierende Indikatoren zur Verfügung, um Kalziumänderungen in Nervenendigungen nachzuweisen. Diese Indikatoren weisen jedoch eine begrenzte Empfindlichkeit gegenüber Kalzium auf und zeigen oft eine nichtlineare Antwort.Synthetische Indikatoren eignen sich besser zur Messung der schnellen Kalziumänderungen, die mit der Nervenaktivität verbunden sind. Wir werden eine Technik zur Beladung von lebenden Nervenendigungen in oph lava mit dextrin-konjugierten synthetischen Kalziumindikatoren demonstrieren. Die Dextrinkonjugation hilft dabei, zu verhindern, dass Kalziumindikatoren in Organellen wie Mitochondrien eingeschlossen werden.Die Beladetechnik kann gleichermaßen auf Larven, Embryonen und erwachsene Exemplare angewendet werden. Wir werden eine Larve in einem kleinen Zigarrenbad auf

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschriebenen strukturellen Merkmale der Glia-neuromuskuläre Synapsen in einem Roman Inside-out Gewebe Vorbereitung der Live-Larven unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen mit der konfokalen Mikroskopie. Wir gekennzeichnet leben Neuronenendigungen mit fluoreszierenden primären Antikörper gegen HRP und auch visualisiert die perisynaptic Raum mit fluoreszierenden Dextrane.

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Wir beschreiben eine etablierte Technik zur Messung und Analyse Gerüche hervorgerufene Kalzium-Reaktionen im Antennallobus...

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

Dieses Video beschreibt die In-vivo-Calcium-Bildgebung in Drosophila-Neuronen mit GCaMP. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie Veränderungen der GCaMP-Fluoreszenz von Pilzkörperneuronen während eines olfaktorischen Konditionierungsexperiments aufgezeichnet werden können.

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: Eine Methode zur funktionellen Bildgebung neuronaler Aktivität

Dieses Video demonstriert eine Methode zum Nachweis sensorischer Neuronenreaktionen in Drosophila mittels Ligandenbindung und Fluoreszenzbildgebung. Liganden binden an Neuronenrezeptoren und verursachen so den Kalziumeinstrom. Das Kalzium bindet an Indikatorkomplexe, was zu einer Fluoreszenzemission führt, die die neuronale Reaktion auf den Liganden bestätigt.

Detektion physiologischer Reaktionen von sensorischen Neuronen in Drosophila

In diesem Video werden die Nervenfasern der Drosophila-Larven in FM-Farbstoff getaucht, der an die Lipide der Zellmembran bindet. Saugmikroelektrode und elektrische Impulse stimulieren den Endozytoseprozess, indem der FM-Farbstoff in neu gebildete endozytäre Vesikel eingebaut wird. Diese Methode, die präsynaptische Stadien der Neurotransmission sichtbar macht, ist nützlich, um die synaptische Funktion und die Freisetzung von Neurotransmittern zu untersuchen.

Mikroelektrodenvermitteltes Be- und Entladen von FM-Farbstoffen in Nervenzellen von Drosophila-Larven

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Untersuchung des synaptischen Vesikelrecyclings an neuromuskulären Verbindungen in Channelrhodopsin-exprimierenden Drosophila-Larven unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs. Blaues Licht aktiviert die Kanalrhodopsine, was zu Kalziumeinstrom und synaptischer Vesikelexozytose führt. Der Farbstoff integriert sich in die neuronalen Membranen und wird während der Endozytose internalisiert, was zu einer verstärkten Fluoreszenz führt. Eine weitere...

Analyse des synaptischen Vesikelrecyclings und der Aufnahme von Fluoreszenzfarbstoffen in Drosophila-Larven

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vivo Kalziumbildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren in Fliegen. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Fliegen für die Mikroskopie, zur Durchführung der olfaktorischen Konditionierung und zur Visualisierung des geruchsinduzierten Kalziumeinstroms.

im lebenden Organismus Calcium-Imaging mit synaptisch lokalisierten Calciumsensoren in Drosophila melanogaster

Quelle: Ishimoto, H. et. al., Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Visualisierung der Gehirnreaktionen auf endokrine Signalwege bei Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Dieses Video zeigt die Kalziumbildgebung zur UntersuchungDrosophila Gehirnreaktionen auf Neuropeptide. Neuronen, die einen fluoreszierenden Kalziumindikator exprimieren, zeigen die intrazelluläre Kalziumdynamik und funktionelle Reaktionen auf Signalmoleküle.

Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Untersuchung der Reaktionen des Drosophila-Gehirns auf Neuropeptide

Die Vorderbeine und der Rüssel von Drosophila enthalten ein reiches Repertoire an geschmacklichen sensorischen Neuronen. Hier stellen wir eine Methode vor, die Calcium-Imaging verwendet, um physiologische Reaktionen von sensorischen Neuronen im Vorderbein und Rüssel lebender Fliegen nach exogener Applikation eines gustatorischen Pheromons zu messen.

Mess physiologischen Reaktionen von<em&gt; Drosophila</emNeurone&gt; Sensory zu Lipid Pheromone Verwendung von Live-Calcium Imaging

Hier beschreiben wir eine Methode zum Laden eines kalziumempfindlichen Farbstoffs durch den Froschnervstumpf in die Nervenendigungen. Wir stellen auch ein Protokoll für die Aufzeichnung und Analyse von schnellen Calcium-Transienten in den peripheren Nervenenden vor.

Laden eines Kalziumfarbstoffs in Froschnervenendungen durch den Nervenstumpf: Calciumübergangsregistrierung im Frosch Neuromuscular Junction

Dieses Protokoll bewertet die funktionelle synaptische Aktivität zwischen definierten neuronalen Partnern in vivo im zentralen Nervensystem der Drosophila melanogaster-Larven mit genetisch codierten Werkzeugen. CsChrimson-vermittelte optogenetische Stimulation präsynaptischer cIVda-Sensorneuronen induziert eine calciumabhängige Photokonversion von CaMPARI in postsynaptischen Basin-4-Interneuronen.

Funktionelle Charakterisierung einzelner prä- und postsynaptischer Partner im zentralen Nervensystem der Drosophila-Larve mittels CaMPARI

Lernen Sie eine Technik zum Laden von Calcium-Indikatoren in Drosophila-Nervenendigungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung schneller Calcium-Dynamiken während der Neurotransmission.

Loading Drosophila Nerve Terminals mit Calcium-Indikatoren

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