Name: Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Zellformänderungen in lebenden Drosophila-Embryonen mit konfokaler Zeitraffer-Mikroskopie und GFP-markierten Proteinen visualisieren. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen der Zellularisierung.

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Wir danken Eric Wieschaus, der das Fundament, auf dem dieses Protokoll wurde entwickelt, zur Verfügung gestellt. Unsere Arbeit wird durch eine Verna &amp; Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology Start-up Award, Baylor College of Medicine unterstützt.

1. Montieren Embryo Sammlung Cups <ol><li> Schneiden Sie die unten aus einer 100 ml Tri-Mais Becherglas mit einer Rasierklinge, so dass die Kante so glatt wie möglich. Die Tassen sind einfacher zu handhaben, wenn Sie schneiden auch die drei Ecken von der Spitze, obwohl dies nicht zwingend erforderlich. </li><li> Schneiden Sie ein Quadrat aus Drahtgitter (6 cm x 6 cm). Auf einer vorgewärmten heißen Platte, innerhalb einer Abzugshaube, Schicht des Platzes aus Drahtgitter auf einem Stück von schweren Aluminium-Folie. Schieben Sie den Schnitt unteren Rand der Tasse fest auf den heißen Masche. Warten Sie ein paar Sekunden, und heben Sie die Tasse mit dem Mesh jetzt angebracht. Wenn die Folie auch Stöcke, nur diese abziehen. </li><li> Kühlen Sie die Tasse über Nacht. Entfernen Sie das überschüssige Gewebe mit einer Schere und Sand aus alle scharfen Kanten mit feinkörnigem Sandpapier. </li></ol> 2. Machen Apfelsaft Agar-Platten <ol><li> In einem 6L-Kolben, kombiniert 100 g BD Bacto Agar und 3L destilliertem Wasser. Autoclave der Agar für 30 Minuten auf der langsamen Auspuff-Einstellung. </li><li> In einem 2L Kolben mit einem Rührstab, kombinieren 100 g Saccharose, 1L Apfelsaft, und 6 g p-Hydroxybenzoesäure. Erhitzen Sie die Lösung zum Sieden unter Rühren auf einer heißen Platte. Nicht kochen für mehr als 2 Minuten. Lassen Sie den Apfelsaft Mischung abkühlen, und fügen Sie dann mit Rührstab auf dem Agar. Mix komplett. </li><li> Lassen Sie die kombinierte Lösung in einem 60 ° C Wasserbad vor dem Einfüllen in 60x15 mm Petrischalen cool. Alternativ kann eine Schlauchpumpe verwendet, um den Agar zu verzichten. Lassen Sie die Platten auf Raumtemperatur für mindestens 4 Stunden kühlen. Stack in Rubbermaid Behälter mit einer Schicht aus nassem Papier Handtücher und lagern bei 4 ° C. </li></ol> Notes: <ul><li> Im Herbst oder Winter, kann es notwendig sein, weitere 100 ml Wasser zu dem Agar hinzufügen. </li><li> Die Marke von Petrischalen ist uns wichtig! Nur die BD Falcon Gerichten passen die Tri-Mais Becher. Spezielle Bestellinformationen finden Sie in den Materialien Tabelle im folgenden Abschnitt. </li></ul> 3. Add GFP Flies auf die Embryo-Entnahme-Cups <ol><li> Expand GFP Aktien nach Ihren Bedürfnissen Sammlung durch die Einrichtung von Flaschen fliegt etwa zwei Wochen vor der Bildgebung. Eine Flasche fliegt in der Regel mehr als ausreichend, wenn ein Embryo-Entnahme-Tasse mit einem Minimum von 50 Frauen und 30 Männern zu füllen. Für eine optimale Verlegung sollte Fliegen sein neu eclosed (dh weniger als 5 Tage nach dem Schlüpfen). </li><li> Machen Sie eine Hefe, indem eine kleine Tasse mit etwa gleichen Teilen Red Star aktiven Trockenhefe und destilliertem Wasser einfügen, und rühren, bis die Hefe gelöst ist. Die Paste sollte in etwa die Konsistenz von nassem Erdnussbutter. Mehr Hefe oder Wasser hinzugefügt werden, um die Konsistenz zu verändern. Hefe Paste kann für mehrere Tage verwendet werden und gespeichert werden sollen, abgedeckt, bei 4 ° C. </li><li> Sobald die Hefe paste bereit ist, zu entfernen Apfelsaft Platten von 4 ° C Lagerung. Streak der Apfelsaft-Platten mit der Hefe einfügen und es ihnen ermöglichen, auf 22-25 ° C erwärmen, die einen Anreiz für die Eiablage wird. </li><li> Falten Sie ein Rundschreiben Filterpapier in der Mitte, dann in der Hälfte wieder. Trim auf 8-9 cm Durchmesser, und machen Akkordeon Falten im Viertelkreis. Klappen Sie den Kreis, kehren sie, und fügen Sie ihn in einem Auffangbehälter, bis er das Netz berührt. Stellen Sie sicher, dass das Papier sicher ist in der Tasse, so dass sie nicht fallen und zerschlagen die Fliegen. Das Filterpapier ist optional, aber ein günstiges Umfeld für die Paarung zu schaffen, und hält Feuchtigkeit in die Tasse. </li><li> Beschriften Sie eine Tasse mit Lager Namen und Datum. Übertragen Sie die Fliegen aus der Flasche zu den Auffangbehälter durch leichtes Schütteln der umgedrehten Flasche über den Kelch, und sofort Deckel des Bechers mit einer vorbereiteten Apfelsaft Platte. Befestigen Sie die Platte in die Tasse mit einem Gummiband. Set Tassen Netzseitentaschen bis in einen Bereich mit direktem Licht. Stellen Sie sicher, dass kein Schatten auf die Tasse fallen, da fliegt nicht gut lag im Dunkeln. </li><li> Ändern Sie den Apfelsaft Platte nach Bedarf. Zwei-Stunden-Sammlungen, bei Raumtemperatur gut für bildgebende Zellularisierung. </li></ol> 4. Bereiten Sie eine Montage Kammer <ol><li> So bereiten Sie eine Aufnahmekammer für die Embryonen, schneiden Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband 2-3 cm lang und legen Sie es auf einer Folie, die Ausrichtung der Längsachse des Bandes und Rutsche. Cut eine zweite 2-3 cm langes Stück doppelseitiges Klebeband und Schicht es auf der anderen Stück Klebeband, so dass Sie sicher, dass die Kanten ausgerichtet sind. </li><li> Mit einer Rasierklinge, machen zwei Schnitte von etwa 3 mm Abstand in der Mitte des Bandes und senkrecht zur Längsachse des Schlittens. Entfernen Sie das Klebeband zwischen den Schnitten, um einen Kanal zu machen. Pipet ein Tropfen Halocarbon 27 Öl in den Kanal. Dieser Kanal ist, wo die Embryonen montiert werden. </li></ol> Notes: <ul><li> Nur die ½-Zoll-Scotch doppelseitige Klebeband ist die richtige Dicke, um die Embryonen unterzubringen. </li><li> Halocarbon 27 Öl ist Sauerstoff durchlässig, und so ermöglicht Austausch von Sauerstoff und verhindert gleichzeitig Embryo Austrocknung. Aufgrund dessen Brechungsindex ist Halocarbon 27 Öl auch ideal für die Inszenierungund Imaging-Embryonen. </li></ul> 5. Dechorionate Embryos <ol><li> Zu sammeln und zu dechorionate Embryonen genug pour 50% Bleichmittel auf die Apfelsaft-Agar-Platte voll versenken die gesamte Oberfläche. Mit einem Binokular, wie die Zeiss Entdeckung V8 mit Durchlicht, achten Sie auf die Embryonen aus ihrem Chorion freizugeben. Sobald das Chorion und lockert Versionen von ein paar Embryonen (30-60 Sekunden), pour Bleichmittel und Embryonen in eine Zelle Sieb. </li><li> Wash Embryonen in das Sieb sofort und kräftig mit destilliertem Wasser aus einer Spritzflasche. Dab Sieb auf Küchenpapier. Wenn die rosa ist auf dem Handtuch nach dem Abtupfen gesehen, weiterhin das Waschen der Embryonen mit Wasser. </li><li> Mit einem feuchten Pinsel auf 10-50 Embryonen, um eine saubere Apfelsaft Platte (ohne Hefe-Paste) zu übertragen. Wick entfernt Wasser mit den zerrissenen Rand ein Papiertuch, und sofort decken die Embryonen mit einer kleinen Menge von Halocarbon 27 Öl. </li></ol> Notes: <ul><li> Verwenden Sie keine Clorox Bleiche. Verwenden Sie stattdessen eine Marke wie Austin A-1 Handelsregister Bleach, die &lt;6% Natriumhypochlorit ist. </li><li> Over-Bleaching oder unzureichende Spülung wird in matschig Embryonen mit unregelmäßigen Zellularisierung führen. </li></ul> 6. Bühne und Mount Embryos <ol><li> Mit dem Binokular mit Durchlicht, folgen Sie den morphologischen Richtlinien Bownes 20 bis Embryonen auf der Platte Bühne. Mit einer Pinzette, Transfer ca. 5 Mitosecyclus 11 oder 12 Embryonen, entsprechend Bownes Stufe 4, um den Kanal der Montage Kammer. Vereinbaren Embryonen in einer Linie mit dorsalen und ventralen Seiten sichtbar und lateralen Seite nach unten. Embryonen sind leicht in diese Orientierung in Öl allein angeordnet. Nicht Menge Embryonen zusammen, wie sie ihre Nachbarn von Sauerstoff wird entzogen, wenn das Deckglas unten aufgetragen wird. (Lassen Sie etwa die Hälfte eines Embryos Länge zwischen ihnen). </li><li> Lay einer Kante eines 25x25 mm Deckglas auf dem doppelseitigen Klebeband an einer Seite des Kanals. Drop the Deckglas, um den Kanal zu decken. Wenn Luft unter gefangen ist, eine kleine Menge von Halocarbon 27 Öl am Rande des Deckglases. Kapillarwirkung wird das Öl in den Kanal Pull-und Push out der Luft. </li></ol> Notes: <ul><li> Eine weitere hervorragende Ressource für die Inszenierung Embryonen ist die folgende: Campos-Ortega, JA und Hartenstein, V. (1985). Die Embryonalentwicklung von Drosophila melanogaster. Springer-Verlag, Berlin. Während dieses Buch nicht mehr veröffentlicht wird, werden gebrauchte Exemplare regelmäßig auf Amazon.com. </li><li> Verwenden Sie immer die Halocarbon 27 Öl sparsam. Damit wird die Montage zu erleichtern. Es wird auch ein versehentliches Nässen des Öls auf den Mikroskop-Objektiv in den folgenden Imaging-Schritten. </li></ul> 7. Bild Embryos <ol><li> Wie Sie hier vorgehen wird natürlich von der Zelle Form zu ändern, dass Sie Bildgebung sind, und die Frage, die Sie ansprechen diktiert werden. Für jede Form zu ändern, platzieren Sie Ihre Montage Kammer entweder auf eine aufrechte oder inverse Mikroskop finden Sie Ihre Embryonen im Durchlicht, und wechseln Sie dann zu konfokale Bildgebung auf eine Region von Interesse sind. Halten Sie sich an Best Practices für die konfokale Mikroskopie, wie die im Nikon MicroscopyU (diskutiert <a href="http://www.microscopyu.com/articles/confocal">http://www.microscopyu.com/articles/confocal</a> ). Seien Sie besonders strengen in die Offenlegung Ihrer lebenden Embryonen, so wenig Laserleistung wie möglich Bleichen und Phototoxizität zu verhindern. </li><li> Für Zellularisierung mit uns Bild auf einem Zeiss 710 Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop, ein C-Apochromat 40x/1.2 W Corr Ziel. Dieses Mikroskop wird in einem klimatisierten Raum untergebracht, mit Temperaturen von 18-20 ° C. Während Temperaturregelung ist nicht unbedingt notwendig, ist es besser für das Mikroskop und macht die Bildgebung mehr konsistent. Wir führen regelmäßig Bild in einer Ebene, in der Nähe der Mitte des Embryos, zur Plasmamembran Einstülpungen im Querschnitt (Abb. 2) folgen. Für einfach folgenden Invagination Dynamik, sind zu 30-60 Sekunden reichen für Zeitraffer-Imaging und Embryonen Bildgebung für&gt; 90 Minuten ohne erkennbare Anzeichen von Sauerstoffmangel zu widerstehen. </li><li> Nach dem Erwerb der Bilder können sie unter Verwendung einer beliebigen Anzahl von Bildanalyse-Pakete, einschließlich Freeware von den National Institutes of Health, genannt ImageJ (werden <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a> ). Die Daten können dann zum Beispiel Filme (Movie 1), Sequenzen (Abbildung 2) oder kymographs 21 vorgestellt werden. </li></ol> Hinweis: <ul><li> Das Eintauchen in Wasser C-Apochromat 40x/1.2 W Corr Ziel ist es, für die Bildgebung in der Nähe des Embryo mittleren Abschnitt durch seine hohe Blende, die Aberrationen Grenzwerte für Deep Tissue Imaging in wässrigen Proben gut geeignet und bietet eine hohe Auflösung und hohe Fluoreszenz-Signal. Darüber hinaus dieses Zielhat eine sehr lange Distanz (220 um). Allerdings werden auch andere Wasser oder Glycerin Immersionsobjektive gute Leistung, vor allem, wenn die Zelle Formveränderung von Interesse in der Nähe des Embryo Oberfläche abgebildet werden kann. </li></ul> 8. Alternative Methode: Mount Embryonen mit "Embryo-Kleber" <ol><li> Um das Bild einer Zelle Form zu ändern außer Zellularisierung, kann es notwendig sein, um Embryonen in einer bestimmten Orientierung, die nicht leicht in Öl gepflegt allein montieren. Dazu verwenden Sie eine alternative Methode zur Montage der zuvor beschriebenen. Beginnen Sie, indem "Embryo-Kleber" durch die Kombination von 20 cm von doppelseitigem Klebeband mit 250 ul Heptan in einem Scintillationsfläschchen. Legen Sie die Scintillationsfläschchen auf einem Kolbenpendel oder rotierenden Plattform, und mischen Sie über Nacht. </li><li> Tauchen Sie ein gelbes Pipettenspitze in den Embryo Kleber, und dann verfolgen die Spitze entlang einer Rutsche, eine Spur von Leim. Während die Heptan verdunstet, richten Sie Ihre inszenierten Embryonen in der vorgeschriebenen Richtung auf einen Block von Agar. (Denken Sie daran, dass der Embryo Oberfläche abgebildet werden sollte nach der Agar. Zum Beispiel, um Bildzelle Formänderung beim Bildung der ventralen Furche, mount Embryonen mit ihrem ventralen Seite nach der Agar.) </li><li> Drehen Sie die Folie mit Klebstoff und drücken Sie vorsichtig den Spuren von Klebstoff gegen die Embryonen auf die Agar-Block. Jetzt kehren die Folie wieder. Die Embryonen werden in die entsprechende Ausrichtung aufgeklebt werden. Fügen Sie zwei Schichten von doppelseitigem Klebeband auf beiden Seiten des Embryos, decken Sie sie mit Halocarbon 27 Öl und Deckglas auflegen. Fahren Sie mit der Bildgebung wie oben beschrieben. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse: Wenn die Embryonen gesund sind und die Abbildung optimal ist, dann Zellularisierung sollte 50-60 Minuten, und der Plasmamembran Einstülpungen sollte das Eindringen von fast 40 Mikron. Allerdings, wenn die Embryonen over-gebleicht, Sauerstoff entzogen oder durch Phototoxizität beschädigt sind, dann Einstülpung entweder verlangsamen oder stoppen, vor allem in der abgebildeten Fläche. Solche Verschlechterung der Embryo Gesundheit führt oft veränderte Entwicklung, und ein Ausfall als Larven schlüpfen. Somit ist für einen rigorosen Test Test Embryo Gesundheit nach der Bebilderung, halten Sie Ihre Folien in einer feuchten Kammer und sehen für das Ausbrüten des nächsten Tages. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Workflow von Embryo-Entnahme zur Bildgebung. Der Workflow des Protokolls lässt sich in vier Hauptphasen unterteilt werden. In der ersten Phase werden alle einzelnen Lieferungen und Komponenten hergestellt, und dann die Embryo-Entnahme-cup, Apfelsaft-Agar-Platte und GFP Fliegen sind zusammen, um den Embryo-Verlegung zu schaffen setzen. In der zweiten Phase werden die Eier und Embryonen, die auf der Apfelsaft-Agar-Platten gelegt werden gesammelt. In der dritten Phase, die Embryonen von der Platte entfernt werden, inszeniert und an die Montage Kammer. In der vierten Phase werden die montierten Embryonen auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Repräsentative Daten aus Zeitraffer-Bildgebung von Zellularisierung. Embryonen werden mit dorsaler (D) und ventralen (V) Seiten gut sichtbar angebracht und sind in der Nähe ihrer Mitte abgebildet an die Plasmamembran Einstülpungen im Querschnitt zu folgen. Der Embryo hier gezeigten drückt eine GFP-Myosin-2-Sonde 6, die an den Spitzen der Plasmamembran Einstülpungen konzentriert. So verfolgen das Eindringen von dieser Front im Laufe der Zeit gibt die Rate, mit der Plasmamembran stülpt. Die 0.00 Minuten-Zeitpunkt entspricht Zellularisierung Beginn. Kurz nach der 56:00 Minuten-Zeitpunkt, beginnt der Gastrulation auf der Bauchseite des Embryos. Bar ist 40 Mikron. Movie 1. Vertreter Film von Zeitraffer-Bildgebung von Zellularisierung. Dieser Film entspricht 2 Abbildung. So nehmen Sie den gesamten Prozess der Zellularisierung begann Bildgebung in der vorherigen Mitosecyclus 13, Erfassung pseudocleavage Furche Regression, und dauerte bis Gastrulationsbewegungen auf der Bauchseite des Embryos zu sehen waren. Die Bilder wurden in Intervallen von einer Minute gesammelt. Die Intensitäten wurden nach der Akquisition erhöht, um es einfacher, die Gastrulationsbewegungen sehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2503/Movie%201.mov">Klicken Sie hier für Film</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Developmental Event-und Timing * </td><td> Zellform Änderungen im Zusammenhang mit </td><td> Ein Link zu Krankheit oder die menschliche Gesundheit </td><td> Aktuelle Referenzen mit Live-Bildgebung </td></tr><tr><td> Pseudo-Teilungsfurche Bildung (4; 90 Minuten pf) </td><td> Cytokinesis </td><td> Polyploidie und Krebs Reihe 1 </td><td> Mavrakis et al., 2009 8 Cao et al., 2010 9 </td></tr><tr><td> Zellularisierung (5; 130 Minuten pf) </td><td> Cytokinesis </td><td> Polyploidie und Krebs Reihe 1 </td><td> Cao et al., 2008 10 Sokac &amp; Wieschaus, 2008 11 </td></tr><tr><td> Bildung der ventralen Furche; Mesoderm Invagination (6; 180 Minuten pf) </td><td> Apikalen Konstriktion, Epithelial-mesenchymale Transition </td><td> Krebs Metastasen 2 </td><td> Fox &amp; Peifer, 2007 12 Martin et al., 2009 13 </td></tr><tr><td> Germband Erweiterung (7; 195 Minuten pf) </td><td> Konvergente Extension </td><td> Neuralrohrdefekte 3 </td><td> Bertet et al., 2004 14 Blankenship et al., 2006 15 </td></tr><tr><td> Tracheogenesis (11; 320 Minuten pf) </td><td> Epitheliale tube formation und Verzweigung </td><td> Angiogenese 4 </td><td> Caussinus et al., 2008 16 Gervais &amp; Casanova, 2010 17 </td></tr><tr><td> Dorsal Schließung (14; 620 Minuten pf) </td><td> Apikalen Konstriktion </td><td> Die Wundheilung 5 </td><td> Gorfinkiel et al., 2009 18 Solon et al., 2009 19 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Beispiele Zellform Veränderungen in lebenden Embryonen zu fliegen abgebildet * Die Bownes Bühne Zahl und Zeit nach der Befruchtung (pf), wenn jedes Ereignis beginnt, werden nach Campos-Ortega, 1985 aufgeführt. <table border="1"><tbody><tr><td> Fly Lager </td><td> Labels </td><td> Original-Referenz </td></tr><tr><td> Spider-GFP (95-1) </td><td> Plasma-Membran </td><td> Morin et al., 2001 22 </td></tr><tr><td> Resille-GFP (117-2) </td><td> Plasma-Membran </td><td> Morin et al., 2001 22 </td></tr><tr><td> GAP43-Venus </td><td> Plasma-Membran </td><td> Mavrakis et al., 2009 8 </td></tr><tr><td> Spaghetti Squash-GFP (SQH-GFP) </td><td> Myosin-2 </td><td> Royou et al., 2002 6 </td></tr><tr><td> E-Cadherin-GFP (ECAD-GFP) </td><td> Zell-Zell-Verbindungen </td><td> Oda et al., 2001 23 </td></tr><tr><td> GFP-Moesin </td><td> F-Aktin </td><td> Kiehart et al., 2000 24 </td></tr><tr><td> Utrophin-Venus (Utro-Venus) </td><td> F-Aktin </td><td> Sokac et al., Unveröffentlichte Ergebnisse </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Nützliche Aktien für die Bildgebung Zellform Änderung fliegen Embryonen

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<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li>
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<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
</ol>

Das Protokoll beschriebenen wird die Live-, konfokale Bildgebung von einer Reihe von Zellform Veränderungen in den Entwicklungsländern zu fliegen Embryo zu ermöglichen. GFP Aktien für die Bildgebung kann durch einen individuellen Labor (Tabelle 2) hergestellt werden, aber viele dieser Bestände sind auch öffentlich verfügbar von Zentren wie Bloomington Drosophila Stock Center an der Indiana University ( <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indiana.edu</a> ) und Fliegenfalle Stock Cente...

<table><tbody><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 25x25</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 2-524C</td><td></td></tr><tr><td>Sprühflaschen (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-897-11</td><td></td></tr><tr><td>Falcon-Röhrchen, 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Glaskolben für kleine Pipetten, 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>Zählfläschchen mit Verschlusskappen</td><td>VWR international</td><td>66021-533</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Corn-Becher, 100 ml</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>60970</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Petrischale 60x15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08757 100B</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Zellfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Gelbe Pipettenspitzen</td><td>Rainin</td><td>L200</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlgewebe, Typ 304, 12x24</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150-F-01</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Pasteurpipetten, 5&amp;#190; Zoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>P4-Filterpapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-803-6F</td><td></td></tr><tr><td>Gummibänder</td><td>Office Max</td><td>A620645</td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband (Scotch), &amp;frac12; Zoll</td><td>Office Max</td><td>A8137DM-2</td><td></td></tr><tr><td>Robert Simmons Expression Pinsel E85 rund Nr. 2</td><td>Jerry&amp;rsquo;s Artarama</td><td>56460</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Nr. 5 Pinzette, hochpräzise, Inox</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon-Öl 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 8773</td><td></td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto-Agar</td><td>VWR international</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxybenzoesäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Red Star Trockenhefe, aktiv</td><td>LeSaffre</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Papiertücher, C-förmig gefaltet</td><td>Kleenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schweres Aluminiumfolie</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorbleiche</td><td>Austin&amp;rsquo;s A-1 Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 % Apfelsaft</td><td>Ocean Spray oder Tree Top</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging zellgröße veränderung der lebens- drosophila embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Die Entwicklung von Drosophila melanogaster Embryo durchläuft eine Reihe von Zellform Veränderungen, die sehr gut für konfokale Bildgebung leben. Zellform Veränderungen in-the-fly sind analog zu denen in höheren Organismen, und sie fahren Gewebemorphogenese. Also, in vielen Fällen hat ihre Studie direkte Implikationen für das Verständnis menschlicher Erkrankungen (Tabelle 1) 1-5. Auf der sub-zellulärer Ebene sind diese Zellform Veränderungen das Produkt der Aktivitäten reicht von der Genexpression bis Signaltransduktion, Zellpolarität, Zytoskelett-Umbau-und Membran-Handel. Somit stellt die Drosophila-Embryo nicht nur den Kontext zu Zellform Veränderungen zu bewerten, da sie Gewebemorphogenese beziehen, sondern bietet auch eine völlig physiologischen Umgebung, die sub-zellulären Aktivitäten, die Form-Zellen zu studieren. Die hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um Bild einer bestimmten Zelle Formveränderung genannt Zellularisierung. Zellularisierung ist ein Prozess der dramatischen Plasmamembran Wachstum, und es letztendlich wandelt die Syncytial Embryo in die zelluläre Blastoderm. Das heißt, bei der Interphase der Mitose-Zyklus 14, der Plasmamembran gleichzeitig stülpt sich um jede ~ 6000 kortikal verankert Kerne auf ein Blatt von primären Epithelzellen zu generieren. Zähler zur vorherigen Vorschläge, ist Zellularisierung nicht von Myosin-2 Kontraktilität 6 angetrieben, sondern wird weitgehend durch Exozytose von Membran aus internen Shops 7 angeheizt. So ist Zellularisierung ein hervorragendes System zur Untersuchung von Membran-Handel während der Zellform Veränderungen, die Plasmamembran Invagination oder Erweiterung erfordern, wie Zytokinese oder Quer-Tubuli (T-Tubulus) Morphogenese in der Muskulatur. Beachten Sie, dass dieses Protokoll einfach auf die Abbildung von anderen Zellform Veränderungen in-the-fly Embryo angelegt und erfordert nur geringe Anpassungen wie die Änderung der Phase der Embryo-Entnahme oder Verwendung von &quot;Embryo Kleber&quot;, um den Embryo in einer bestimmten Orientierung (Tabelle montieren 1) 8-19. In allen Fällen wird der Workflow im Grunde die gleichen (Abbildung 1). Standard-Verfahren für das Klonen und Drosophila Transgenese werden verwendet, um stabile fliegen Aktien, die ein Protein von Interesse exprimieren, fusioniert mit Green Fluorescent Protein (GFP) oder dessen Varianten vorzubereiten und diese Fliegen bieten eine erneuerbare Quelle von Embryonen. Alternativ sind auch fluoreszierende Proteine ​​/ Sonden direkt in fly Embryonen über einfache Mikro-Injektion Techniken 9-10 eingeführt. Dann, je nach Entwicklungs-Event-und Zell-Form zu ändern, die abgebildet werden, sind Embryonen gesammelt und inszeniert von Morphologie auf einem Binokular und schließlich positioniert und montiert für Zeitraffer-Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop.

Frühe Entwicklung der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, wird durch eine Reihe von Zell-Form verändert, dass auch für die Bildgebung Ansätze geeignet sind, geprägt. Dieser Artikel beschreibt grundlegende Werkzeuge und Methoden für die Live-konfokale Abbildung von Drosophila Embryonen erforderlich ist, und wird auf eine Zelle Formveränderung genannt Zellularisierung konzentrieren.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

Der sich entwickelnde Embryo von Drosophila melanogaster durchläuft eine Reihe von Veränderungen der Zellform, die sich hervorragend für die konfokale Live-Imaging-Mikroskopie eignen. Die Zellform ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Formveränderungen von Zellen in lebenden Drosophila-Embryonen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst transgene Fliegenstämme erzeugt und vermehrt werden, die GFP-markierte Proteinsonden exprimieren. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, diese Fliegen in Sammelbecher für Embryonen zu überführen.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Embryonen zu sammeln. Der vierte Schritt ist das Beschichten und Montieren des Embryos. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zelluläre Formveränderungen wie zelluläre Veränderungen mittels zeitraffender konfokaler Bildgebung der montierten Embryonen zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Bildgebung von fixiertem Gewebe, liegt darin, dass die dynamischen Aspekte von Zellformveränderungen im Kontext lebender Embryonen erfasst werden können. Obwohl die hier beschriebene Methode speziell auf die Speiseröhrenbildung zugeschnitten ist, kann sie angepasst und auf andere Zellformveränderungen übertragen werden, die die frühe Flugentwicklung begleiten, wie beispielsweise die Bildung der ventralen Furche, die Ausdehnung des Keimstreifens, die Tracheagenese und den dorsalen Verschluss. Personen, die neu in dieser Technik sind, empfinden es oft als Herausforderung, die Embryonen unter dem Stereomikroskop zu manipulieren und zu präparieren.Meine Doktorvorgesetzte Anna Marie Soki und ich werden dieses Verfahren demonstrieren. Bei diesem Verfahren beginnt man mit der Herstellung einer Schale zur Sammlung von Embryonen, indem man mit einem Rasiermesser den Boden eines 100-Milliliter-Tricorn-Bechers abschneidet und die Kante so glatt wie möglich gestaltet. Schneiden Sie die drei Ecken an der Oberseite ab, um die Handhabung der Schale zu erleichtern.Schneiden Sie anschließend ein sechs Zentimeter mal sechs Zentimeter großes Quadrat aus Drahtgitter zu, und arbeiten Sie dabei in einem Abzug. Legen Sie ein Stück robuste Aluminiumfolie auf eine vorgewärmte Heizplatte und platzieren Sie das Drahtgitterquadrat auf der Aluminiumfolie. Drücken Sie den abgeschnittenen unteren Rand des Bechers fest auf das heiße Gitter.Warten Sie einige Sekunden und heben Sie die Tasse mit dem nun befestigten Netz an. Falls die Folie ebenfalls haften bleibt, ziehen Sie sie ab. Bewahren Sie die Tasse über Nacht am nächsten Tag auf.Entfernen Sie überschüssiges Gitter mit einer Schere und schleifen Sie scharfe Kanten mit feinem Schleifpapier ab. Als nächster Schritt wird eine Hefepaste hergestellt, die die Embryonenproduktion durch das Weibchen fördert. Füllen Sie eine kleine Tasse mit annähernd gleichen Teilen roter aktiver Trockenhefe und destilliertem Wasser und rühren Sie, bis die Hefe vollständig aufgelöst ist.Die Paste sollte eine Konsistenz ähnlich der von feuchter Erdnussbutter aufweisen. Wenn die Hefepaste fertig ist, nehmen Sie die Apfelsaft-Agar-Platten aus der Lagerung bei vier Grad Celsius heraus. Eine Beschreibung, wie die Apfelsaft-Agar-Platten hergestellt werden, finden Sie in dem begleitenden Manuskriptstrich.Die Apfelsaftplatten mit der Hefe-Paste bestreichen und mindestens eine Stunde warten, bis die Platten auf Raumtemperatur angewärmt sind. Einen runden Filterpapierkreis halbieren und anschließend nochmals halbieren.Schneiden Sie das Papier auf einen Durchmesser von acht bis neun Zentimetern zu. Falten Sie die Viertelkreisform im Akkordeonstil. Entfalten Sie den Kreis, drehen Sie ihn um und legen Sie ihn in einen Sammelbecher, bis er das Netz berührt.Stellen Sie sicher, dass das Papier sicher im Becher befestigt ist, damit es nicht herunterfällt und die Fliegen zerquetscht. Nun ist es Zeit, die Fliegen zu übertragen. Nehmen Sie eine Stammdurchführung mit Fliegen, die zwei Wochen Zeit zur Vermehrung hatte. Diese Durchführung sollte mehr als genügend Fliegen enthalten, um einen Embryosammelbecher mit mindestens 50 Weibchen und 30 Männchen zu füllen.Verwenden Sie zur optimalen Eiablage Fliegen, die weniger als fünf Tage nach dem Schlüpfen alt sind. Beschriften Sie die Sammelschale mit dem Stammdesignator und dem Datum. Drehen Sie die Flasche mit den Fliegen um und schütteln Sie sie vorsichtig über die Sammelschale, um die Fliegen in die Schale zu überführen; decken Sie die Schale anschließend sofort mit einer vorbereiteten Apfelsaftplatte ab.Befestigen Sie die Platte mit einem Gummiband am Becher. Stellen Sie den Becher mit der Plattenoberseite nach oben bei Raumtemperatur an einen Ort mit direktem Licht. Achten Sie darauf, dass kein Schatten auf den Becher fällt, da die Fliegen in der Dunkelheit nicht gut legen. Nach zwei Stunden sammeln Sie die Embryonen, indem Sie die Apfelsaftplatte durch eine neue Platte ersetzen, und lagern Sie die Sammlungen bei Raumtemperatur.Eignet sich gut für die Bildgebung von Zellen. Als Nächstes bereiten Sie eine Montagekammer für die Embryonen vor. Dazu schneiden Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband zwei bis drei Zentimeter lang ab und platzieren es auf einem Objektträger, wobei Sie die Längsachsen des Klebebands und des Objektträgers ausrichten.Schneiden Sie ein zweites, zwei bis drei Zentimeter langes Stück doppelseitiges Klebeband und legen Sie es auf das andere Klebebandstück, wobei Sie sicherstellen, dass deren Kanten bündig abschließen. Machen Sie mit einer Rasierklinge zwei Schnitte, die ungefähr drei Millimeter voneinander entfernt im Zentrum des Bandes und senkrecht zur langen Achse des Objektträgers liegen. Entfernen Sie das Band zwischen den Schnitten, um einen Kanal zu bilden, und geben Sie einen Tropfen Halo-Carbon-27-Öl in den Kanal.Dieser Kanal ist der Bereich, in dem die Embryonen präpariert werden. Benetzen Sie die Embryonen, indem Sie die Apfelsaftplatte mit 50 % Bleiche für 30 bis 60 Sekunden bedecken. Sammeln Sie die Embryonen in einer Zelle, einem Sieb, und waschen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser aus einer Spritzflasche.Den Sieb vorsichtig auf Papiertüchern abtupfen. Mit einem feuchten Pinsel 10 bis 50 beschichtete Embryonen auf eine saubere Apfelsaftplatte übertragen, die kein Hefepaste enthält. Wasser mit der abgerissenen Kante eines Papiertuchs abziehen und die Embryonen unverzüglich mit einer kleinen Menge Halocarbon-27-Öl bedecken.Verschieben Sie die Apfelsaftplatte unter Verwendung von durchgehendem Licht auf ein Stereomikroskop. Stellen Sie die Embryonen gemäß den morphologischen Richtlinien von Bounds ein. Übertragen Sie mit einer Pinzette fünf Embryonen des mitotischen Zyklus 11 oder 12, die dem Bounds-Entwicklungsstadium vier entsprechen, in den Kanal der Montagekammer.Ordnen Sie die Embryonen in einer Linie so an, dass die dorsale und ventrale Seite sichtbar sind und die laterale Seite nach unten weist. Die Embryonen lassen sich allein in Öl leicht in dieser Orientierung anordnen. Um eine Überlagerung der Embryonen zu vermeiden, sollte zwischen ihnen mindestens ein halbe Embryonenlänge Abstand bleiben.Legen Sie eine Kante eines 25 mal 25 Millimeter großen Deckgläschens auf das doppelseitige Klebeband an einer Seite des Kanals, wobei eine Kante des Deckgläschens mit einer Kante des Bandes ausgerichtet wird. Senken Sie das Deckgläschen ab, um den Kanal abzudecken. Falls Luft unter dem Deckgläschen eingeschlossen wird, tragen Sie eine kleine Menge Öl an der Kante des Deckgläschens auf.Die Kapillarwirkung bewirkt, dass das Öl in den Kanal gezogen wird und die Luft verdrängt. Stellen Sie die Montagekammer auf das konfokale Mikroskop und lokalisieren Sie die Embryonen mit Durchlicht. Wechseln Sie dann zur konfokalen Bildgebung, um einen interessierenden Bereich für die zelluläre Aufnahme in einer einzelnen Ebene nahe der Mitte des Embryos zu fokussieren.Um die Dynamik der Invagination zu verfolgen, verwenden Sie Zeitintervalle von 30 bis 62 Sekunden für die Zeitrafferaufnahmen. Nach der Bildaufnahme analysieren Sie diese mit einem Bildanalyseprogramm wie dem kostenlosen Softwarepaket ImageJ von NIH. Die Daten können anschließend als Filme, Sequenzen oder CH-Diagramme dargestellt werden. Um Formveränderungen von Zellen, die nicht zellulärer Natur sind, abzubilden, kann es erforderlich sein, Embryonen in einer bestimmten Orientierung zu montieren, die allein in Öl nur schwer aufrechterhalten werden kann.Verwenden Sie dazu eine abweichende Montagemethode gegenüber der zuvor beschriebenen. Stellen Sie zunächst einen Embryokleber her, indem Sie 20 Zentimeter doppelseitiges Klebeband mit 250 Mikrolitern Heptan in einem Verschlussfläschchen vermischen. Stellen Sie dieses Verschlussfläschchen auf einen Mutter oder rotierende Plattform und mischen Sie die Mischung über Nacht.Am nächsten Tag tauchen Sie eine gelbe Pipettenspitze in den Embryokleber und ziehen dann die Pipettenspitze entlang eines Objektträgers, wobei ein Klebefaden zurückbleibt, während das Heptan aus dem Embryokleber verdunstet. Richten Sie die gestaffelten Embryonen auf einem Agarblock aus, sodass die zu bildgebenden Oberfläche des Embryos zum Agar hinzeigt. Zum Beispiel, um Formveränderungen der Zelle abzubilden.Während der Furchungsbildung montieren Sie die Embryonen so, dass ihre ventrale Seite der Agarplatte zugewandt ist. Drehen Sie den Objektträger mit dem Embryonenleim um und drücken Sie vorsichtig die Leimspur auf die Embryonen auf dem Agarblock. Drehen Sie den Objektträger nun erneut um.Die meisten Embryonen sollten in der richtigen Orientierung auf dem Objektträger haften. Anschließend bringen Sie zwei Schichten doppelseitiges Klebeband auf beiden Seiten der Embryonen an. Bedecken Sie sie mit Halo-Carbon-27-Öl und legen Sie einen Deckglaser auf.Die Embryonen sind nun bereit für die Bildaufnahme. Diese Aufnahmen zeigen die Zeitrafferaufnahme von zellulären Embryonen, die mit dorsal und ventral ausgerichtet sind, deutlich sichtbar und im Bereich ihrer Mitte abgebildet. Um die Plasmamembran in Querschnittsaufnahmen zu verfolgen, exprimiert der hier gezeigte Embryo eine GFP-Myosin-Zwei-Sonde, die sich an den Spitzen der Plasmamembran-Einwärtsfaltungen anreichert. Die Verfolgung des Eindringens dieser Front über die Zeit liefert die Geschwindigkeit, mit der die Plasmamembran eindringt. Der Zeitpunkt 0 Minuten entspricht dem Beginn der Zellulärphase, kurz nachdem etwa 56 Minuten nach Beginn der Gastrulation auf der ventralen Seite des Embryos stattfindet.Dieser Zeitrafferfilm von zellulären Vorgängen begann im vorherigen mitotischen Zyklus, 13, und zeichnete eine Pseudoklavage, die R&uuml;ckbildung der Furche auf und wurde fortgesetzt, bis Gastrulationsbewegungen an der ventralen Seite des Embryos sichtbar waren. Sobald die Technik beherrscht ist, k&ouml;nnen das Montieren und Abbilden in 60 bis 90 Minuten durchgef&uuml;hrt werden, sofern sie ordnungsgem&auml;&szlig; durchgef&uuml;hrt werden. Nat&uuml;rlich erfordert die Sammlung der Embryos zus&auml;tzliche Zeit und muss mit dem Montieren und Abbilden abgestimmt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, alles Mögliche zu tun, um eine gute Embryogesundheit zu gewährleisten. Zum Beispiel sollten die Embryonen nicht übermäßig gebleicht und ihre Belastung durch den Laser während der Bildgebung nach diesem Verfahren begrenzt werden. Fortschrittlichere Bildgebungstechniken wie das Photo-Bleaching und das Photo-Switching können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Welche zytoskelettalen und membranbezogenen Dynamiken begleiten eine bestimmte Zellformveränderung?

imaging-cell-shape-change-in-living-drosophila-embryos

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Forschung

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