Assaying Bewegungsapparat, Lernen und Gedächtnis Defizite in Drosophila Modelle von Neurodegeneration

Das übergeordnete Ziel des Verfahrens besteht darin, Lernen und Gedächtnis bei erwachsenen Esso Melan Gaster zu untersuchen, um zunächst festzustellen, ob die Fliegen unter motorischen Defiziten leiden. Sie werden im negativen Geotaxis-Test geprüft. Anschließend wird das positive Phototaxis-Verhalten überprüft, indem die Fliegen in ein T-Labyrinth gebracht werden und die Latenzzeit zur Bewegung in Richtung der bevorzugten, beleuchteten Kammer aufgezeichnet wird.

Fliegen mit positiver Phototaxis werden anschließend darauf konditioniert, die beleuchtete Kammer mit dem bitteren Geschmack von Chinin zu assoziieren. Schließlich wird getestet, wie gut die Fliegen den aversiven Reiz mit der beleuchteten Kammer verbinden, was eine Messgröße für Lernen und Gedächtnis darstellt. Ola, herzlich willkommen im X-Labor.

Heute werden wir Ihnen zwei häufig verwendete Verhaltensassays zur Untersuchung der Neurodegeneration bei Drosophila vorstellen. Zunächst zeigen wir Ihnen den aversiven Phototaxis-Suppressions-Assay, demonstriert von Wil Fredo Sala, einem Bachelorstudenten in unserem Labor, und mir selbst. Anschließend folgt der negative Geotaxis-Assay, demonstriert von Kaiwan, einer Doktorandin in unserem Labor. Halten Sie die Fliegen auf einem standardmäßigen Maismehl-Agar-Melasse-Hefe-Medium bei 25 °C im 12-Stunden-Licht-Dunkel-Wechsel.

Am Tag der Okklusion sortieren Sie jungfräuliche Fliegen in Gruppen von jeweils 20. Jungfräuliche Fliegen erkennt man an ihrer hellen Färbung und einem dunkelgrünen Fleck an der Unterseite ihres Abdomens. Die Fliegen sollten alle drei Tage in ein frisches Gefäß überführt werden, und Geschwisterfliegen sollten verwendet werden, um Unterschiede aufgrund genetischer Hintergründe zu minimieren.

Bei einer Geotaxis-Studie sollten 10 bis 20 Gruppen pro Genotyp oder Behandlung getestet werden. Zunächst weibliche und männliche Fliegen in Gruppen von jeweils 10 sortieren. Diese Fliegen sollten getrennt voneinander getestet werden.

Da das Verhalten stark vom Geschlecht beeinflusst wird, warten Sie mindestens eine Stunde nach der Anästhesie, bevor Sie fortfahren, um sicherzustellen, dass die motorische Aktivität nicht beeinträchtigt ist. Sobald die Fliegen perfekt präpariert sind, richten Sie die Öffnungen zweier leerer Polystyrolgefäße aus, indem Sie sie vertikal an dem unteren Gefäß verbinden.

Messen Sie acht Zentimeter von der Unterseite aus und zeichnen Sie einen Kreis entlang des Umfangs. Nachdem die Apparatur nun zusammengesetzt ist, überführen Sie eine Gruppe von 10 Fliegen in das untere Gefäß. Setzen Sie die Gefäße unmittelbar wieder zusammen und gewöhnen Sie die Fliegen vor dem Testen eine Minute lang ein.

Nachdem sich die Fliegen beruhigt haben, klopfen Sie sie vorsichtig auf den Boden des Gefäßes und messen Sie die Anzahl der Fliegen, die innerhalb von 10 Sekunden die Acht-Zentimeter-Marke überschreiten. Die Anzahl der Fliegen pro Gruppe, die diese Marke überschritten haben, wird als Prozentsatz der Gesamtanzahl der Fliegen erfasst. Wiederholen Sie diesen Vorgang 10-mal pro Gruppe, wobei zwischen den Durchgängen eine Ruhepause von einer Minute für die Fliegen eingelegt wird.

Sechs Stunden vor dem PS-Assay weibliche Fliegen in Polystyrolgefäße sortieren, die Filterpapier mit Wasser befeuchtet enthalten. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Fliegen nüchtern sind und für den abschreckenden Geschmack empfänglicher werden. In diesem Assay dient eine Chininlösung als aversiver Reiz.

Stellen Sie eine Arbeitslösung von einem Mikromolar aus einer 0,1-molaren Stammlösung her. Das T-Labyrinth besteht aus einer mittleren Säule mit einer Falltür und zwei Seitenkammern, einer dunklen Kammer und einer beleuchteten Kammer. Schneiden Sie an der 2-Millimeter-Marke mit einer manuellen Säge das geschlossene Ende von zwei 15-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen ab, setzen Sie an jedem Ende passende Verbindungsadapter auf und verschließen Sie die Verbindungen mit Paraform.

Wickeln Sie ein Rohr mit Aluminiumfolie ein, um die dunkle Kammer herzustellen. Bauen Sie die TMA, indem Sie die beleuchtete und die dunkle Kammer auf jeder Seite der Mittelsäule anschrauben. Mit der geschlossenen Falltür in der Mitte vervollständigen Sie den Aufbau, indem Sie eine Lichtquelle direkt mit dem Adapter der Lichtkammer verbinden. Überführen Sie vor Durchführung des Assays jede Fliege aus einer Gruppe von 10 in ein leeres 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und verschließen Sie es leicht, um ein Entweichen zu verhindern.

Danach schrauben Sie die Dunkelkammer von den TMAs ab. Überführen Sie eine einzelne Fliege in das Röhrchen und setzen Sie es unmittelbar wieder in das Labyrinth ein. Schalten Sie das Licht im Raum aus und schalten Sie eine rote Lampe ein.

Lassen Sie die Fliege 30 Sekunden lang in der dunklen Kammer akklimatisieren und schalten Sie dann langsam die Lichtquelle ein, die die erhellte Kammer beleuchtet. Öffnen Sie, sobald die Beleuchtung eingeschaltet ist, die Falltür, die die beiden Kammern voneinander trennt. Wenn die Fliege innerhalb von 10 Sekunden in die erhellte Kammer läuft, gilt sie als positiv phototaktisch und ist bereit für die Trainingseinheit.

Das Ausbleiben einer Reaktion auf diese Weise weist auf ein Problem im Sehsystem hin und erfordert den Ausschluss aus dem Assay. Sobald eine positive Phototaxis bestätigt wurde, klopfen Sie die Fliege zurück in die dunkle Kammer, schließen Sie die Falltür und schalten Sie das Licht während einer 32. Ruhephase aus. Bereiten Sie den aversiven Reiz vor, indem Sie das Filterpapier in die beleuchtete Kammer legen und einen Milliliter Chininlösung auf das Filterpapier pipettieren.

Sicherstellen, dass das gesamte Filterpapier vollständig mit aversiven Reizen benetzt ist. Zum Beginn der Konditionierung langsam die Falltür öffnen und das Licht einschalten. Die Fliege in die mit Chinin duftende, beleuchtete Kammer laufen lassen.

Tippen Sie nach einer Minute die Fliege zurück in die dunkle Kammer. Wiederholen Sie diesen Vorgang neunmal, sodass insgesamt 10 Konditionierungsdurchgänge durchgeführt werden. Typischerweise meiden Wildtyp-Fliegen nach drei bis fünf Trainingsdurchgängen unmittelbar nach dem Training die beleuchtete Kammer.

Führen Sie fünf Testdurchläufe durch. Wenn die trainierte Fliege innerhalb von 10 Sekunden nicht in das Licht der Kammer hineinläuft, wird dies als bestanden aufgezeichnet. Die Bestehensrate über fünf aufeinanderfolgende Durchläufe wird erfasst und festgelegt.

PC null. Nach dem Training und den anfänglichen PC-null-Aufzeichnungen wird jede Fliege in ihre ursprüngliche nummerierte Nahrungsröhre zurückgebracht und sechs Stunden lang beiseitegestellt. Sechs Stunden nach dem Training führen Sie fünf zusätzliche Testdurchläufe wie zuvor gezeigt durch; diese Erfolgsrate stellt den PC sechs dar und ist ein Maß für das Kurzzeitgedächtnis.

Im negativen Geotaxis-Assay wird die Anzahl der Fliegen, die die Acht-Zentimeter-Marke überqueren, in eine Prozentangabe umgerechnet und als Kletterpassierungsrate dargestellt. Über 10 Versuche, wie hier rechts zu sehen, weisen 10 Tage alte männliche oder weibliche Fliegen mit Überexpression von humanem Tau signifikante motorische Defizite im Vergleich zu altersentsprechenden Fliegen mit GFP-Überexpression auf der linken Seite auf.

Die Leistung im aversiven Phototaxis-Suppressions-Test wird durch die durchschnittliche Durchgangsrate oder den Prozentsatz erfolgreicher Vermeidungsversuche dargestellt. Bei den insgesamt durchgeführten Versuchen zeigen die Fliegen mit hier rechts dargestellter Überexpression von Tau eine verminderte Fähigkeit, das Licht mit einem bitteren Geschmack zu assoziieren, verglichen mit der Kontrollgruppe auf der linken Seite, und zwar sowohl unmittelbar nach der Trainingsphase als auch sechs Stunden später bei der erneuten Testung. Im Anschluss an dieses Verfahren können Proben für eine immunhistochemische Analyse entnommen werden, um zusätzliche Fragen bezüglich morphologischer Unterschiede zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Lernen und Gedächtnis bei Fliegen untersucht, amigos.

Und denken Sie daran, es geht immer um Sie.