Name: Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung von PKC-Translokation in lebenden Zellen mittels fluoreszenzmarkiertem Protein Kinase C. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbildgebung der PKC-Dynamik in Sf9-Zellen und Aplysia sensorischen Neuronen.

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Diese Arbeit wurde vom kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) Grant zu Wayne S. Sossin unterstützt. Carole A. Farah ist der Empfänger ein Postdoc-Stipendium aus dem Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) und Conrad Harrington Gemeinschaft. Die Autoren bedanken sich bei Joanna Bougie, Margaret Hastings und Margaret Labban für die Hilfe bei der Video-Dreh und Madeline Richmond Pool für die Hilfe bei der grafischen Übersicht danken.

1. Erstellung und Pflege von Sf9-Monolayer Kulturen <ol><li> Sf9-Zellkultur und Wartung in einer Gewebekultur Abzug durchgeführt. </li><li> Sf9-Zellen werden aus Spodoptera frugiperda Eierstock-Zellen (Sf21 Zellen) abgeleitet und kann als eingefrorene Zellen in Grace Medien von Invitrogen erworben werden. </li><li> Platz 8 ml Insektenmedium Grace, ergänzt (1X), zu dem 30% fötales Rinderserum (FBS) hat in einer 75 cm 2 Zellkulturflasche mit einer verkantet Hals aufgenommen worden. </li><li> Auftauen gefrorenen Rohr Sf9 Zellen schnell im 37 ° C Wasserbad, indem Sie den Schlauch hin und her (ca. 1-2 Minuten). </li><li> Transfer Sf9-Zellen, die 75 cm 2 Zellkulturflasche und Rock Platte vorsichtig von Hand, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. </li><li> Inkubieren 1-2 Stunden bei 27 ° C, bis die Zellen angeschlossen sind. </li><li> Entfernen Sie altes Medium und ersetzen mit 10 ml Insektenmedium freshGrace ist mit 30% FBS. </li><li> Inkubation bei 27 ° C, bis die Zellen konfluent sind. </li><li> Zur Aufrechterhaltung Monolayerkulturen, entfernen Sie alte Medium aus dem konfluenten Flasche Sf9-Zellen und 5 ml Medium Insekten Grace mit 10% FBS. </li><li> Leicht auf der Seite der Flasche Leitungswasser mehrmals Sf9-Zellen zu lösen. </li><li> Mit einem 10 mL Pipette und eine Pipette, die Medien Pipette nach oben und unten einmal sanft, Spritzen Kolbenwand beim Pipettieren unten. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles 15 mL Polysterene Röhre. </li><li> Geben Sie 2 ml Sf9 Zellsuspension bis 8 ml Insektenmedium Grace mit 10% FBS (1:5 Verdünnung auf log-Phase Wachstum aufrecht zu erhalten) in neue 75 cm 2 Zellkulturflasche und Rock Platte vorsichtig mit der Hand. </li><li> Inkubation bei 27 ° C, bis die Zellen konfluent sind. </li></ol> 2. Expression von fluoreszenzmarkierten PKCs in Sf9 Zellen <ol><li> Für Live-Imaging-Experiment, Kultur Sf9-Zellen auf 35 mm MatTek Glasboden Kultur disheswith eine Glasfläche von 14 mm und einem Deckglas Dicke von 0,16 bis 0,19 mm. </li><li> PKCs mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind in Sf9-Zellen mit Cellfectin II Transfektionsreagenz folgende Empfehlung des Herstellers mit den Änderungen detaillierte unten angegeben. </li><li> Tag 1: Vor dem Ausplattieren der Zellen, behandeln jeden MatTek Gericht mit Insekten Medium Grace mit 10% FBS für mindestens 30 Minuten. </li><li> Graf Sf9-Zellen aus Schritt 11 (oben) unter Verwendung eines Hämozytometers. </li><li> Platte 0,05 x 10 6 Zellen pro MatTek Deckglas in einem Gesamtvolumen von 150 ul. Lassen Sie die Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur befestigen. </li><li> Geben Sie 2 ml Grace mit 10% FBS zu jedem Gericht 1 mL der zu einer Zeit, langsam zu vermeiden Ablösen der Zellen ergänzt. </li><li> Inkubation bei 27 ° C über Nacht. </li><li> Von diesem Punkt an, verwenden Sie der Empfehlung des Herstellers für die Transfektion von Sf9-Zellen mit Plasmid-DNA. </li><li> Tag 2: Transfektion von Sf9-Zellen mit fluoreszenzmarkierten PKCs mit Cellfectin II Transfektionsreagenz. Wir haben oft in diesem System PKCs mit verbesserter Green Fluorescent Protein (eGFP) und monomeren Red Fluorescent Protein (mRFP) (Details für Plasmid-Konstruktion wurden bisher 2,5) beschrieben getaggt co-exprimiert. Expression eines fluoreszierenden Proteins in einem Zeit-Ausbeuten zwischen 70-80% exprimierende Zellen 72 Stunden nach der Transfektion. Co-Expression von zwei fluoreszierenden Proteinen verringert Transfektionseffizienz zu etwa 30% co-exprimierenden Zellen. Als Co-exprimierenden eGFP-markierten PKC und mRFP-markierten PKC, verwenden Sie 2x mehr Plasmid-DNA für die mRFP-markierte Protein für eine optimale Protein-Expression. </li><li> Führen Sie Live-imaging 48-72 Stunden nach der Transfektion (für eine optimale Protein-Expression, warten Sie 72 Stunden). </li></ol> 3. Expression von fluoreszenzmarkierten PKCs in Aplysia sensorischen Neuronen <ol><li> Vorbereitung der Aplysia neuronalen Zellkulturen hat in einer Video-Artikel wurde von Zhao und seine Kollegen 4 beschrieben. </li><li> PKCs mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind in Aplysia sensorischen Neuronen mit Mikroinjektion Verfahren detaillierte unten angegeben. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 1% Fast Green (FCF) in destilliertem Wasser, Filter mit einer Spritze und einer 28 mm Spritzenfilter (0,20 um). Aliquotieren und bei -20 ° C. </li><li> Mikroinjektion der sensorischen Neuronen können am Tag 1 oder Tag 2 nach der Isolierung der Nervenzellen durchgeführt werden, aber wir finden, die darauf warten 2 Tage ermöglicht eine bessere Zelle Einhaltung der Deckglas. </li><li> Am Tag 2 nach der Isolierung der sensorischen Neuronen, Tauwetter ein Aliquot Fast Green und Filter wieder mit einer Spritze und einer 28 mm Spritzenfilter (0,20 um). </li><li> Bereiten Sie eine Lösung von Plasmid-DNA in destilliertem Wasser mit 0,5% Fast Green. Die Konzentrationen von Plasmid-DNA so hoch wie 0,4 ug / ul kann verwendet werden, aber es wird nicht empfohlen, über diesen Werten gehen. </li><li> Filtern Sie die Plasmid-DNA / Fast Green-Lösung mit einer 1 ml Spritze und einem 4-mm-Spritzenvorsatzfilter (0,20 um). </li><li> Centrifuge die Plasmid-DNA / Fast Green Lösung bei 16110 xg für 15 Minuten mit einem Mikrofonrocentrifuge. </li><li> Bereiten scharfen Elektroden für die Mikroinjektion von Neuronen mit einer Mikroelektrode Puller (Sutter Flaming / Brown Micropipette Puller, Modell P-97). Verwenden einer Box Faden ziehen Glasmikroelektroden mit 1 mm Außendurchmesser, 0,75 mm Innendurchmesser und 100 mm Länge mit dünnwandigen Glaskapillaren mit einem Faden im Inneren (World Precision Instruments TW100F-4). Für weitere Informationen über Ziehen Mikroinjektion Elektroden entnehmen Sie bitte Sutter Elektrode Kochbuch. </li><li> Füllen Sie jede Elektrode mit 2 ul von Plasmid-DNA / Fast Green-Lösung mit Microloader Pipettenspitze (Eppendorf CA32950-050). </li><li> Übertragen Sie die MatTek Glasboden Kulturschale mit Aplysia neuronalen Kulturen, die Mikroinjektion Station. </li><li> Die Mikroinjektion Station besteht aus folgenden Komponenten: eine hausgemachte großen Glas Bühne, um die Kulturschalen auf einer Schwingungsisolierung Tabelle (Kinetic Systems Schwingungsisolierung Workstation), ein Stereo-scope mit externen Halogen-Beleuchtung, einem Mikromanipulator (Sutter Huxley Wandtyp Micromanipulator halten welches sowohl Grob-und ultra-feine Positionierung in den drei-Achse), einer Mikroelektrode Halter verbunden, um eine pneumatische Pumpe (World Precision Instruments PV820 Pneumatische Pico-Pump). Der Druck Eingang der pneumatischen Pumpe ist eine komprimierte Stickstoff Tank verbunden. </li><li> Legen Sie eine Mikroelektrode in die Mikroelektroden-Halter. </li><li> Profil unter einem Stereomikroskop, legen Sie die Spitze der Mikropipette in den Zellkern. </li><li> Deliver kurze Druckimpulse von Stickstoff (10 bis 100 ms Dauer, 20 lb / in 2), bis der Kern wird gleichmäßig durchdringt und grün. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 4 Stunden bei Raumtemperatur und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. Für eine optimale PKC-Translokation, live-imaging Experiment 20 bis 24 Stunden nach der Injektion. </li></ol> 4. Visualisierung von PKC-Translokation in Living Cells Sf9 und in Aplysia sensorischen Neuronen <ol><li> Für die Bildgebung, verwenden wir ein Zeiss LSM510 invertierten konfokalen Mikroskop mit einem Axiovert 200. </li><li> Imaging-Protokoll ist das gleiche für Sf9-Zellen und für die Aplysia sensorischen Neuronen mit Ausnahme der folgenden: Sf9 Zellen werden mit einem x63 Ölimmersionsobjektiv abgebildet, während Aplysia sensorischen Neuronen mit einem x40 Ölimmersionsobjektiv abgebildet werden. Sf9-Zellen werden in einem temperierten Raum bei 26-27 o C gehalten abgebildet, während Aplysia sensorischen Neuronen bei Raumtemperatur etwa 18-20 o C gehalten werden abgebildet </li><li> Wir verwenden einen 30 mW Argon-Laser (Anregung bei 488 nm) mit 50% Laserleistung zum Bild PKC mit eGFP-Protein und ein HeNe-Laser (Anregung bei 543nm), um Bild PKC mit mRFP Protein markiert markiert. Die Argon-und HeNe-Laser-Linien abgeschwächt bis 4% und 50% Sendeleistung bzw. vor der Aufnahme und der Lochkamera ist eine angepasst. </li><li> Es ist wichtig, die Kulturschale auf dem Imaging-Bühne stabilisiert zu haben und Bewegung oder Vibration zu vermeiden. </li><li> Nehmen Sie 1 ml Kulturmedium aus der Schale vorsichtig mit einer 10 ml Pipette Verlassen 1 mL Gesamtvolumen in die Schüssel. </li><li> Nehmen Sie Bilder im mittleren Bereich der Zellen, wo der Kern zu sehen sind. </li><li> Richten Sie eine Zeitreihe von 10-20 konfokalen Bildern der Aufnahme eines Bildes alle 30 Sekunden. </li><li> Starten Sie den Zeitreihen. </li><li> Nach 2 Bilder aufgenommen werden (nach Ablauf der 30 Sekunden Zeit, Punkt), 1 mL des Medikaments (2X-Konzentration) sanft Drop-by-drop auf den Zellen mit einer Pipette P1000. Das Medikament wird kontinuierlich für etwa 30 Sekunden aufgenommen. </li><li> Einige Medikamente verursachen eine schnelle Translokation, die sichtbar sein können unmittelbar nach medikamentöse Behandlung (bei 60 Sekunden Zeitpunkt), während andere induzieren eine langsame Translokation, die nur optimal 5-10 Minuten nach der Behandlung (Movie 1 und Movie 2) ist. </li><li> Wenn das Medikament muss abgewaschen werden, verwenden Sie 2 x 10 ml Pipetten, um die Wäsche zu tun, Pipettieren Waschpuffer vorsichtig nach unten, mit einer Pipette auf der einen Seite des Tellers und Pipettieren bis die Medien auf der anderen Seite. </li><li> Wenn die Wäsche wirksam war und ob die Wirkung des Medikaments reversibel ist, kehrt PKC zurück zum Cytosol innerhalb von 30-60 Sekunden. </li><li> Speichern Sie den Film als LSM-Datei. </li><li> Verwenden NIH Image J Software, um die LSM-Dateien zu öffnen und zu quantifizieren, die Bilder vor und nach medikamentöser Behandlung. Die Quantifizierung wurde an anderer Stelle 1 beschrieben. </li></ol>

<ol><li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &amp, Klein, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2%2B-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li>
<li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li>
</ol>

Wir haben eine Technik zur Bild Translokation von fluoreszenzmarkierten PKCs beschrieben in Echtzeit in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen. Sf9-Zellen bieten ein einfaches System, um Bild PKC-Translokation seit Kultivierung und Transfektion von ihnen ist ziemlich geradlinig. Im Gegensatz dazu nimmt die Mikroinjektion von Aplysia sensorischen Neuronen einiger Zeit zu meistern, bis zu einigen Monaten. Schwierigkeiten im Zusammenhang mit dieser Technik gehören Elektrode verstopfen. Filterung ...

<table><tbody><tr><td>Sf9-Gefrierzellen</td><td>&lt;em&gt;Spodoptera frugiperda&lt;/em&gt; Eierstockzellen</td><td>Invitrogen</td><td>B825-01</td><td></td></tr><tr><td>Gnade&amp;rsquo;s Insektenmedium, zugesetzt (1X), flüssig</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>11605-094</td><td>Zur Kultivierung von Sf9-Zellen verwenden</td></tr><tr><td>Corning 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; schräg ausgerichteter Zellkulturkolben</td><td>Werkzeug</td><td>Corning</td><td>430720</td><td>Zur Kultivierung von Sf9-Zellen verwenden</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Reagenz</td><td>CanSera</td><td>CS-C08-500</td><td>Grace ergänzen&amp;rsquo;s-Medium mit FBS vor der Verwendung</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>Zur Filtration der Fast Green-Lösung verwenden</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>Zur Filtration der Plasmid-DNA/Fast-Green-Lösung verwenden</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Werkzeug</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>Zur Filtration der Fast-Grün-Lösung verwenden</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Werkzeug</td><td>Corning</td><td>431212</td><td>Zur Filterung der Plasmid-DNA / Fast-Green-Lösung verwenden</td></tr><tr><td>Glasbodenschale</td><td>Werkzeug</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1,5-14-C</td><td>Zur Kultivierung von Sf9-Zellen vor der Transfektion und Bildgebung verwenden</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagenz</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Zur Expression fluoreszenzmarkierter PKCs in Sf9-Zellen verwendet</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>zur Visualisierung der Mikroinjektion einer Plasmid-DNA-Lösung in &lt;em&gt;Aplysia&lt;/em&gt; Sinnesneuronen</td></tr><tr><td>Dünne Glas-Kapillaren</td><td>Werkzeug</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td>Verwenden, um Mikropräparate herzustellen&amp;#8211;Mikroinjektions-Elektroden</td></tr><tr><td>Mikrolader-Pipettenspitze</td><td>Werkzeug</td><td>Eppendorf</td><td>CA32950-050</td><td>Autoklavieren Sie vor der Verwendung, um die Mikropipette zu befüllen.&amp;#8211;Mikroinjektions-Elektroden</td></tr><tr><td>PV820 Pneumatischer PicoPump </td><td>Werkzeug</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td>Teil der Mikroinjektionsstation</td></tr><tr><td>Mikroskopie&amp;#8211;Elektrodenhalter</td><td>Werkzeug</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH6S</td><td>Zum Halten der Mikr verwenden&amp;#8211;Elektrode </td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Werkzeug</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td>Zum Positionieren des Mikros&amp;#8211;Elektrode in der Dreierachse</td></tr></tbody></table>

live-darstellung von pkc-translokation in sf9-zellen und in aplysia sensorischen neuronen

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein-Kinase-Cs (PKCS) sind Serin-Threonin-Kinasen, die eine zentrale Rolle spielen bei der Regulation einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Zellwachstum und Lernen und Gedächtnis. Es gibt vier bekannte Familien von PKC-Isoformen bei Wirbeltieren: klassische PKCs (α, ßi, βII und γ), Roman Typ I PKCs (ε und η), neuartige II PKCs (δ und θ) und atypische PKC (ζ und ι ). Die klassische PKCs werden durch Ca 2 + aktiviert und diacylclycerol (DAG), während der Roman PKCs durch DAG aktiviert werden, sondern sind Ca 2 +-unabhängig. Die atypische PKC sind weder durch Ca 2 + noch DAG aktiviert. In Aplysia californica, unser Modellsystem zur Gedächtnisbildung Studie, gibt es drei Nervensystem spezifischen PKC-Isoformen einer aus jeder großen Klasse, nämlich der konventionellen PKC Apl I, die neue Typ-I-PKC Apl II und der atypischen PKC Apl III. PKCS Lipid-Kinasen aktiviert und damit die Aktivierung der klassischen und neuen PKC als Reaktion auf extrazelluläre Signale wurde häufig mit PKC-Translokation aus dem Zytoplasma an die Plasmamembran korreliert. Daher hat die Visualisierung PKC-Translokation in Echtzeit in lebenden Zellen werden ein unschätzbares Werkzeug für die Aufklärung der Signalwege, die PKC-Aktivierung führen. Zum Beispiel hat diese Technik für uns erlaubt festzustellen, dass verschiedene Isoformen der PKC unter verschiedenen Bedingungen translozieren, um verschiedene Arten von synaptischer Plastizität vermitteln und dass Serotonin (5HT) Aktivierung von PKC Apl II erfordert die Herstellung der beiden DAG und Phosphatidsäure (PA) für Translokation 1-2. Wichtig ist, dass die Fähigkeit, die gleichen Neuron visualisieren wiederholt hat uns erlaubt, zum Beispiel zu einer Desensibilisierung der PKC Reaktion in exquisite detail 3 zu messen. In diesem Video haben wir jeden Schritt der Herstellung Sf9-Zellkulturen zu demonstrieren, haben Kulturen der Aplysia sensorischen Neuronen in einem anderen Video Artikel 4 beschrieben worden sind, zum Ausdruck fluoreszenzmarkierten PKCs in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen und Live-Darstellung von PKC-Translokation in Reaktion auf verschiedene Aktivatoren mittels Laser-Scanning-Mikroskopie.

In diesem Video zeigen wir, Visualisierung von PKC-Translokation in lebenden Zellen mit fluoreszenzmarkierten PKCs.

Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

Protein-Kinase C (PKC) sind Serin-Threonin-Kinasen, die eine zentrale Rolle bei der Regulierung einer Vielzahl zellulärer Prozesse wie dem Zellwachstum und ...

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die Translokation fluoreszenzmarkierter PKC in lebenden Zellen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst SF-neun-Zellkulturen oder Kulturen sensorischer Neuronen aus einem Plegia californica vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, fluoreszenzmarkierte pkcs in den Zellen zu exprimieren.Der letzte Schritt besteht darin, die PKC-Translokation in Reaktion auf verschiedene Aktivatoren mittels Laser-Scanning-Mikroskopie abzubilden. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine differenzielle Regulation der verschiedenen PKC-Isoformen durch sekundäre Botenstoffe wie Diacylglycerin zeigen, und zwar durch die zeitlich aufgelöste Abbildung der PKC-Translokation in lebenden Zellen. Hallo, mein Name ist Carol Ferra.Ich bin wissenschaftlicher Mitarbeiter im Labor von Dr. Wayne Sawn am Montrealer Institut für Neurowissenschaften. Heute werde ich die Live-Bildgebung der PKC-Translokation in sensorischen Neuronen von Aplysia demonstrieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der synaptischen Plastizität zu beantworten, beispielsweise wie die verschiedenen PKC-Isoformen während der Gedächtnisbildung aktiviert werden.Um die SF-neun-Zell-Monolayer-Kulturen vorzubereiten, geben Sie im Gewebekulturwerk acht Milliliter Grace-Insektenmedium mit 30 % fetalem Kälberserum in einen 75 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben. Tauchen Sie anschließend die gefrorene Röhre mit SF-neun-Zellen rasch in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad ein, und bewegen Sie die Röhre etwa ein bis zwei Minuten lang hin und her. Überführen Sie danach die SF-neun-Zellen in den Zellkulturkolben, und schwenken Sie den Kolben vorsichtig von Hand, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Zellen eine bis zwei Stunden bei 27 Grad Celsius, bis sie angeheftet sind.Entfernen Sie dann das alte Medium aus dem Kolben und ersetzen Sie es durch weitere 10 Milliliter frisches Grace’s Insektenmedium mit 30 % FBS. Inkubieren Sie die Zellen bei 27 Grad Celsius, bis sie konfluent sind. Um Monolayer-Kulturen aufrechtzuerhalten, entfernen Sie das alte Medium aus dem konfluenten Kolben der SF9-Zellen und geben 5 Milliliter Grace’s Insektenmedium mit 10 % FBS hinzu. Klopfen Sie leicht mehrmals an die Seite des Kolbens, um die SF9-Zellen zu lösen. Anschließend pipettieren Sie das Medium mit einer 10-Milliliter-Pipette vorsichtig mehrmals auf und ab.Spritzen Sie einmal an die Kolbenwand, während Sie abpipettieren, und überführen Sie die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Polystyrolröhrchen. Geben Sie zwei Milliliter SF-nine-Zellsuspension zu acht Milliliter Grace-Insektenmedium mit 10 % FBS in den neuen 75 Quadratzentimeter großen Zellkulturgefäß mit einem Verdünnungsverhältnis von 1 zu 5. Um das exponentielle Wachstum aufrechtzuerhalten, schwenken Sie den Kolben vorsichtig von Hand.Als Nächstes inkubieren Sie die Zellen erneut bei 27 Grad Celsius, bis sie konfluent sind. Nach der Inkubation sind die SF9-Zellen bereit zur Expression fluoreszenzmarkierter PKCs, wie in dem schriftlichen Verfahren beschrieben, das der Expression fluoreszenzmarkierter PKCs vorausgeht. Neuronale Zellkulturen werden in MatTek-Kulturschalen mit Glasboden wie zuvor beschrieben hergestellt. Zwei Tage nach der Isolierung der Sinnesneuronen filtrieren Sie eine zuvor hergestellte Lösung von Fast Green mithilfe einer Spritze und eines 20-Millimeter-Spritzenfilters mit einer Porengröße von 0,2 Mikrometern.Stellen Sie eine Lösung aus Plasmid-DNA, die für E-G-F-P-P KC API zwei kodiert, in destilliertem Wasser her, das 0,5 % Schnellblau enthält, mit einer Konzentration von höchstens 0,4 Mikrogramm pro Mikroliter. Filtern Sie die Plasmid-DNA-Schnellblau-Lösung mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einem vier Millimeter großen Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,2 Mikrometern. Zentrifugieren Sie anschließend die Plasmid-DNA-Schnellblau-Lösung 15 Minuten lang bei 16.110 G mit einem Mikrozentrifugen.Bereiten Sie anschließend scharfe Elektroden zur Mikroinjektion von Neuronen mithilfe eines Mikroelektrodenzugers vor. Ziehen Sie Glas-Mikroelektroden aus dünnwandigen Glas-Kapillaren mit innenliegenden Filamenten. Füllen Sie jede Elektrode mit zwei Mikrolitern Plasmid-DNA-Fast-Green-Lösung. Mithilfe einer Mikroladepipettenspitze wird die Mikroinjektion an der Mikroinjektionsstation durchgeführt. Die Mikroinjektionsstation besteht aus einer selbstgebauten großen Glasplatte zur Aufnahme der Kulturschalen auf einem vibrationsgedämpften Tisch, einem Stereomikroskop mit externer Halogenbeleuchtung, einem Mikromanipulator und einem Mikroelektrodenhalter, der mit einer pneumatischen Pumpe verbunden ist.Der Druckeingang der pneumatischen Pumpe ist mit einem Druckstickstofftank verbunden. Überführen Sie die Matech-Glasboden-Kulturschale mit den Plegia-Neuronenkulturen zur Mikroinjektionsstation und setzen Sie eine Mikroelektrode in den Mikroelektrodenhalter ein. Betrachten Sie die Neuronen unter einem Stereomikroskop und führen Sie die Spitze der Mikropipette in den Zellkern ein.Geben Sie kurze Druckimpulse von Stickstoff mit einer Dauer von 10 bis 100 Millisekunden und einem Druck von 20 Pfund pro Quadratzoll ab, bis der Kern gleichmäßig grün erscheint. Inkubieren Sie die Zellen vier Stunden bei Raumtemperatur und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie ein umgekehrtes konfokales Zeiss-LSM-510-Mikroskop mit einem Axio Avert. 200 zur Abbildung sowohl von SF9-Zellen als auch von Plegia-Sinnesneuronen.Die Abbildung von plegischen Sinnesneuronen wird in diesem Video gezeigt. Einzelheiten zur Abbildung von SF-neun-Zellen finden sich im schriftlichen Protokoll. Verwenden Sie einen 30 Milliwatt starken Argonlaser mit 50 % Laserleistung, um PKC, das mit dem EGFP-Protein markiert ist, abzubilden.Als Nächstes dämpfen Sie die Argonne-Laserlinie auf eine Transmission von 4 % ab. Danach stellen Sie die Blende auf eins ein, stabilisieren die Kulturschale auf dem Bildgebungsstand und vermeiden Bewegung oder Vibration. Entfernen Sie vorsichtig ein Milliliter Kulturmedium aus der Schale mithilfe einer 10-Milliliter-Pipette und lassen Sie ein Gesamtvolumen von einem Milliliter zurück.In der Petrischale. Suchen Sie den mittleren Bereich der Zellen, in dem der Zellkern sichtbar ist. Erstellen Sie eine Zeitreihe aus 10 bis 20 konfokalen Bildern in Zeitabständen von 30 Sekunden.Starten Sie den Film, und nachdem das zweite Bild aufgenommen wurde, induzieren Sie die Translokation, indem Sie vorsichtig ein Milliliter Wirkstoff mit der zweifachen Konzentration hinzufügen. Geben Sie den Wirkstoff tropfenweise kontinuierlich auf die Zellen auf, und zwar etwa 30 Sekunden lang. Hier wird Serotonin verwendet, um eine schnelle Translokation zu induzieren, die unmittelbar nach der Behandlung mit dem Wirkstoff sichtbar sein kann.Einige Wirkstoffe induzieren eine langsame Translokation, die erst fünf bis zehn Minuten nach der Behandlung optimal ist. Spülen Sie den Wirkstoff mit zwei 10-Milliliter-Pipetten ab, indem Sie den Waschpuffer vorsichtig mit einer Pipette auf einer Seite der Schale abgeben und das Medium auf der gegenüberliegenden Seite aufpipettieren. Wenn die Wäsche wirksam ist und die Wirkung des Wirkstoffs reversibel ist, kehrt PKC innerhalb von 30 bis 60 Sekunden zurück ins Zytoplasma. Speichern Sie den Film als LSM-Datei, wie gezeigt.Hier sind die repräsentativen Ergebnisse der Live-Bildgebung der PKC-Translokation in Plegia-Sinnesneuronen. E-G-F-P-P KC APL zwei wurde in einem Sinnesneuron exprimiert, und eine Serie von 10 konfokalen Bildern wurde in Zeitabständen von 30 Sekunden aufgezeichnet. In diesem Beispiel wurde Serotonin 30 Sekunden nach Beginn der Aufzeichnung der Probe hinzugefügt.In diesem Beispiel wird die Live-Bildgebung der PKC-Translokation in SF9-Zellen gezeigt. E-G-F-P-P KC APL eins und M-R-F-P-P KC APL zwei wurden gemeinsam in SF9-Zellen exprimiert, und eine Serie von 10 konfokalen Aufnahmen wurde in Zeitabständen von 30 Sekunden aufgezeichnet. Ein zwei DIOCTYL SN Glycerin.Ein zellpenetrables Analogon von DYL-Glycerin wurde 30 Sekunden nach Beginn der Aufzeichnung der Petrischale hinzugefügt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man fluoreszenzmarkierte PKCs in sensorischen Neuronen der Aplysia exprimiert und wie die Translokation von PKC in lebenden Zellen abgebildet wird.

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In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen und intrazellulären Transport zu studieren. Hier beschreibe ich ein Protokoll zur in-Vivo -Erfassung und Analyse der axonalen und intraflagellar Transport in C. Elegans.

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Ein Verfahren wird vorgestellt, um Proteinkinase-A-Aktivitäten in kopffesten, sich verhaltenden Mäusen zu visualisieren. Ein verbesserter A-Kinase-Aktivitätsreporter, tAKAR, wird in kortikalen Neuronen ausgedrückt und für die Bildgebung durch ein Schädelfenster zugänglich gemacht. Die zweiphotonenfluoreszenzspezifische Bildmikroskopie wird verwendet, um PKA-Aktivitäten in vivo während der erzwungenen Fortbewegung zu visualisieren.

Visualisierung der Proteinkinase Eine Aktivität bei kopffixierten Behaving Mäusen mit In Vivo Zweiphotonen fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Abbildung der neuronalen Populationsaktivität mit Einzelzellauflösung in nicht-transgenen wirbellosen Spezies unter Verwendung von absorptionsspannungsempfindlichen Farbstoffen und einem Photodiodenarray dar. Dieser Ansatz ermöglicht einen schnellen Workflow, bei dem Bildgebung und Analyse im Laufe eines einzigen Tages verfolgt werden können.

Photodiodenbasierte optische Bildgebung zur Aufzeichnung der Netzwerkdynamik mit Einzelneuronauflösung bei nicht-transgenen Wirbellosen

Dieses Protokoll beschreibt Anwendungen der Probenimmobilisierung mit Fibrin-Gerinnseln, die Begrenzung des Driftens und das Hinzufügen und Auswaschen von Reagenzien während der Live-Bildgebung. Die Proben werden auf einen Tropfen Fibrinogen übertragen, der das Kulturmedium auf der Oberfläche eines Deckslips enthält, nach dem die Polymerisation durch Zugabe von Thrombin induziert wird.

Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Dieser Artikel stellt ein detailliertes schrittweises Protokoll zur Verwendung eines integrierten multifunktionalen und benutzerprogrammierbaren Systems vor, das eine automatische Mehrkanalbildgebung und mechanobiologische Analyse ermöglicht, um die Mechanosensitivität des Yes-assoziierten Proteins (YAP) aufzuklären.

Rein optische Mechanobiologie Befragung von Yes-assoziiertem Protein in menschlichen Krebs- und normalen Zellen mit einem multifunktionalen System

Hier zeigen wir, wie die Transfektion von primären hippokampalen Nagetierneuronen mit konfokaler Bildgebung in lebenden Zellen kombiniert werden kann, um pathologische Protein-induzierte Effekte auf den axonalen Transport zu analysieren und mechanistische Signalwege zu identifizieren, die diese Effekte vermitteln.

Verwendung von Lebendzell-Imaging zur Messung der Auswirkungen pathologischer Proteine auf den axonalen Transport in primären Hippocampus-Neuronen

Lernen Sie die Visualisierung von PKC-Translokation in lebenden Zellen mittels fluoreszenzmarkiertem Protein Kinase C. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbildgebung der PKC-Dynamik in Sf9-Zellen und Aplysia sensorischen Neuronen.

Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

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