Name: Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling durch Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) Coupled (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Profilierung polarer Glycerolipide in Arabidopsis thaliana durch Dünnschichtchromatographie gekoppelt mit Gas-Flüssigkeits-Chromatographie. Diese robuste Methode ermöglicht quantitative Analysen für Pflanzenlipidomik.

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Diese Arbeit wird durch einen Zuschuss von US-amerikanischen National Science Foundation an Christoph Benning unterstützt.

1. Lipidextraktion <ol><li> Begin Lipidextraktion durch die Ernte 30 mg 4-Wochen alten Arabidopsis Blättern von Pflanzen auf Agar verfestigtem Medium oder Boden und überführen sie in 1,5 ml Polypropylen Reaktionsrohre. Frische Blätter können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C. </li><li> Geben Sie 300 ul Extraktionsmittel Methanol zusammen, Chloroform und Ameisensäure (20.10.01, v / v / v) zu jeder Probe. Kräftig schütteln (mit einem Farbschüttler oder ähnliches) für 5 Minuten. </li><li> Fügen Sie 150 ul 0,2 M Phosphorsäure (H 3 PO 4), 1 M Kaliumchlorid (KCl) und kurz vortexen. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 xg bei Raumtemperatur für 1 Minute. Lipide in der unteren Chloroformphase aufgelöst wird auf DC-Platten entdeckt werden. </li></ol> 2. Dünnschicht-Chromatographie (TLC) 15 <ol><li> Zur Vorbereitung DC-Platten, vorgeschla-20cmx20cm Kieselgels DC-Platte mit dem Laden Streifen für 30 sec in 0,15 M Ammoniumsulfat ((NH 4) 2 SO 4)-Lösung, nach dem Untertauchen für 30 Sekunden, trocknen Sie die Platte für mindestens 2 Tage in einem abgedeckten Behälter. Während der Aktivierung der Sublimation von Ammonium hinterlässt Schwefelsäure, die Phosphatidylglycerin, die für ihre Trennung von anderen Glycerolipide protoniert. </li><li> Am Tag des Experiments, TLC aktivieren Platten durch Backen im Ofen bei 120 ° C für 2,5 Stunden. </li><li> Nach dem Abkühlen der aktivierten Platten auf Raumtemperatur, mit einem Bleistift eine gerade Linie (1,5 cm vom Rand der Platte) über die Platte ziehen am Ursprung des Chromatogramms. </li><li> In einem Abzug langsam liefern 3 X 20 ul der Lipid-Extrakt in der unteren Chloroformphase mit einer 20 ul Pipette mit 200 ul gelbem Kunststoff Tipps unter einem langsamen Strom von N 2. Zu diesem Zweck ist ein Tygon Schlauch an den Regler des N 2 Tank verbunden. Halten Sie die Stelle kleiner als 1 cm im Durchmesser. Jede Platte kann bis zu 10 Proben (wenn nachfolgende GLC-Analyse geplant ist). </li><li> Da die Lipid-spots ganz trocken in der Abzugshaube, bereiten den Entwicklungsländern Lösungsmittel Aceton, Toluol, Wasser (91 mL: 30 mL: 7,5 mL) zusammen. Wenn die Umgebungstemperatur relative Luftfeuchtigkeit ist hoch, könnte Trennung betroffen sein. In diesem Fall Wasser sollte reduziert (91 mL: 30 mL: 7,0 mL) geben werden, um die gewünschte Trennung zu erreichen. </li><li> Gießen Sie 80 mL der Entwicklung in eine verschließbare TLC Entwicklung Kammer (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0, cm / cm / cm) Lösungsmittel und legen Sie die Platte in den Tank mit der Probe Ende nach unten zeigt. Seal den Tank mit der Klemme. Das Lösungsmittel wird wieder aufsteigen der Platte und Lipiden getrennt werden. Die Entwicklungszeit beträgt etwa 50 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wenn das Lösungsmittel vor hat 1 cm vom oberen Rand der Platte erreicht, entfernen Sie vorsichtig die Platte aus dem Tank und vollständig trocknen in den Abzug, der für etwa 10 Minuten. </li><li> Lipide durch TLC getrennt werden kann entweder reversibel kurz mit Jod für eine quantitative Analyse oder irreversibel gefärbt mit Schwefelsäure oder α-Naphthol gefärbt. <ol><li> Schwefelsäure Verkohlung: Sprühen Sie den Teller mit 50% iger Schwefelsäure in Wasser in einem Glas-Sprühflasche in der Abzugshaube und backen bei 120 ° C für 15 Minuten (Abbildung 2A). </li><li> α-Naphthol Färbung für Glykolipide: Sprühen Sie den Teller mit 2,4% (w / v) α-Naphthol in 10% (v / v) Schwefelsäure, 80% (v / v) Ethanol und backen bei 120 ° C für 3-5 Minuten, bis Glycolipid Bands gefärbt rosa oder violett (Abbildung 2B). Übertherapie wird aller Lipide aufgrund des Vorhandenseins von Schwefelsäure im Reagenz Verkohlung führen. </li><li> Iodfärbung: in einer Abzugshaube wird die Platte in einen geschlossenen Behälter mit TLC Iodkristalle (in einem Fach auf der Unterseite führen zur Sättigung der Atmosphäre mit Joddampf bis Lipide sichtbar sind). Setzen Sie die Platte an Jod zu lange Jod kann kovalent modifizieren mehrfach ungesättigten Fettsäuren (Abbildung 2C). Alternativ zu vermeiden Oxidation von Lipiden, nur Standard-Spuren mit Proben Spuren durchsetzt gebeizt sollte mit einem Glaswolle gesteckt Pasteurpipette mit Jod Kristalle, durch die N 2 über einzelne Standard-Bahnen geblasen wird. </li></ol></li></ol> 3. Fatty Acyl Methylester (FAME) Reaktion 16 <ol><li> Entfernen Kieselsäure Umgebung identifiziert Lipid-Spots aus der DC-Platte mit einer Rasierklinge. Kratzen Sie die Lipid-Gehalt an Kieselsäure und übertragen Sie die Silica-Pulver mit einem Trichter in ein Glasrohr mit einem Teflon (PTFE)-gesäumten Schraubverschluss. </li><li> 1 ml 1 N Salzsäure (HCl) in wasserfreiem Methanol zu jeder Probe durch Glaspipette. </li><li> Geben Sie 100 ul 50 ug mL -1 Pentadecansäure (15:0) mit 200 ul Pipette zu jeder Probe als interner Standard mit einem 200-ul-Pipette mit 200 ul gelbe Spitze aus Kunststoff. Halten Sie ein Rohr mit nur pentadecenoic Säure in methanolischer HCl als Kontrolle. Close Glasröhren dicht mit Teflon ausgekleideten Kappen. </li><li> Inkubieren glass Röhrchen in einem 80 ° C Wasserbad für 25 Minuten. Tubes müssen abgedichtet werden, so dass das Lösungsmittel nicht verdampft. </li><li> Nach Rohre abgekühlt haben, fügen Sie 1 mL 0,9% Natriumchlorid mit 1 mL Hexan und kräftig vortexen gefolgt. Centrifuge Proben bei 1000xg für 3 Minuten. </li><li> In der Abzugshaube, entfernen Sie die Hexan / obere Schicht der Probe mit Pasteurpipette und legen Sie sie in eine neue 13x100 mm Glasrohr. </li><li> Dampft Hexan unter einem langsamen Strom von N 2 ohne Trocknung vollständig. </li><li> Lösen Sie die resultierende Fettacyl Methylester s in 60 ul Hexan. Transfer-Proben in Autosampler-Vials und fest verschließen. Die Proben können bei 4 ° C für die kurzfristige und -20 ° C für ein paar Tage gelagert werden. </li></ol> 4. Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) 10 <ol><li> Vor Beginn der GLC, sicher, dass das Helium, Wasserstoff und Luft Flaschen gefüllt werden. </li><li> Ausreichende Hexan müssen, um das Lösungsmittel-Reservoir aufgenommen werden und die Abfallbehälter müssen leer sein. Für Fettacyl Methylester Trennung, fügen Sie eine DB-23 Säule an der Maschine. </li><li> Legen Flaschen in den Autosampler. Starten Sie den Chemstation Software für GLC auf dem System Computer. </li><li> Stellen Sie die Vorlauftemperatur bei 250 ° C mit Helium Durchfluss mit 48,6 mL min -1 und der Druck bei 21,93 psi. Das Teilungsverhältnis beträgt 30,0: 1. </li><li> Die Ofentemperatur wird zunächst bei 140 ° C für 2 min eingestellt und raiste auf 160 ° C mit einer Rate von 25 ° C min -1. Dann die Temperatur auf 160 ° C ansteigen zu 250 ° C mit einer Rate von 8 ° C min -1 und halten bei 250 ° C für 4 min durch einen Rückgang um 140 ° C mit einer Rate von 38 ° C min - 1. Ein Run dauert ca. 21 Minuten. </li><li> Die Temperatur der Flammenionisationsdetektor ist 270 ° C mit einem Wasserstoff-Volumenstrom von 30,0 mL min -1, Luftdurchsatz von 400 mL min -1 und Helium Durchfluss bei 30,0 mL min -1. </li><li> Geben Sie die Anzahl der Fläschchen und Probe Namen in der Ablaufreihenfolge Tisch. Stellen Sie die 10 l Injektor zu 2 ul Probe pro Flasche zu injizieren. </li><li> Wenn das Instrument fertig ist, starten Sie die Ablaufreihenfolge. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Beispiele für irreversible Verfärbung der TLC-Trennung Lipide aus 4-Wochen alten Arabidopsis-Keimlinge sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Schwefelsäure gebeizt Lipiden (Abbildung 2A) sind verkohlt und erscheinen als braune Flecken. α-Naphthol wird bevorzugt, Glycolipide wie MGDG Fleck, DGDG, SQDG etc. Glycolipide mit α-Naphthol tragen eine rosa-lila Farbe, während andere polare Lipide Fleck gelb (Abbildung 2B) gefärbt. Das Jod-Färbung ist reversibel und ermöglicht Lipide eine gelbliche Farbe, die über einen kurzen Zeitraum wie Jod verdunstet (Abbildung 2C) verschwinden. Kurz Jod gefärbt Lipide können zur GLC-Analyse unterzogen werden, obwohl ungefärbten Lipide vorzuziehen reduzieren Abbau von Lipiden sind. Wenn dies geschehen ist erfolgreich, wird markante Signale, die verschiedene Fatty Acyl-Methylester nach GLC beobachtet werden (Abbildung 3). Fatty Acyl-Methylester mit kürzeren Kohlenstoffkette und weniger Doppelbindungen haben kürzere Verweildauer mit dem DB-23 Säule. Fatty Acyl-Methylester-Profiling ist ein empfindliches Werkzeug, um Mutanten mit veränderten Lipid-Zusammensetzung zu identifizieren. In Abbildung 4, die MGDG18: ist 3-Fettsäure-Molverhältnis in der tgd4-1-Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Typ 18 verringert. Durch die Aufteilung der Mole von Fatty Acyl-Methylester für eine Lipid-Klasse mit der Mole aller Lipidklassen sind das Molverhältnis von jedem Lipid berechnet. Zum Beispiel, um das Molverhältnis von MGDG berechnen: (MGDG) mol% = Σ [FAME (MGDG)] / Σ [FAME (gesamt)] x100% Die daraus resultierenden Molverhältnisse der einzelnen Lipid-Klasse sowohl aus dem Wildtyp und der Mutante verglichen werden kann. Zum Beispiel hat die tgd4-1 Mutante relativen Mengen von MGDG und PG erhöht, sondern verringert Mengen DGDG und PE (Abbildung 5) 18. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Flussdiagramm der polaren Lipid-Analyse unter Verwendung von Arabidopsis-Keimlinge. Insgesamt Lipide sind aus 4-Wochen alten Arabidopsis-Keimlinge entnommen und getrennt durch TLC. Die getrennten Lipide können von DC-Platte für die Umesterung durch GLC-Analyse gefolgt abgekratzt werden. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Trennung von Lipiden auf DC-Platten. Lipid-Extrakte von 35 mg (Frischgewicht) Wildtyp-Keimlingen sind durch TLC getrennt und gefärbt durch Schwefelsäure (A), α-Naphthol (B) oder Joddampf (C). Drei Wiederholungen sind in jeder Färbemethode gezeigt. DGDG, Digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, Phosphatidylcholin, PE, Phosphatidylethanolamin, PG, phosphatidylglycerol; PI, Phosphatidylinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. GLC-Analyse von Fettsäure-Methylester (FAME) aus MGDG des Wildtyp abgeleitet. FAME sind auf einer 30 m Kapillarsäule aufgetrennt und durch Flammenionisationsdetektor. Pentadecansäure (15:0) wird als interner Standard verwendet. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Fettsäure-Profil MGDG im Wildtyp Col2 (weiße Säulen) und die tgd4-1-Mutante (schwarze Säulen). Fettsäuren sind als die Anzahl der Kohlenstoffatome durch die Anzahl der Doppelbindungen, gefolgt vorgestellt. Drei Wiederholungen gemittelt und Standardabweichungen dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Polar Lipide Zusammensetzung des Wildtyp Col2 (weiße Säulen) und die tgd4-1-Mutante (schwarze Säulen). Drei Wiederholungen gemittelt und Standardabweichungen sind durch Fehlerbalken dargestellt.

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</ol>

TLC gekoppelt mit GLC bietet eine robuste und schnelle Werkzeug für die quantitative Analyse von polaren Lipiden in Pflanzen. Kleine Veränderungen in Lipid-Zusammensetzung identifiziert werden können, daher hat diese Methode für große Screening von Mutanten in polaren Lipid-Stoffwechsel 1,20 beeinträchtigt worden. Diese Methode wird auch häufig für die Überwachung der Aktivitäten der Enzyme nutzen polaren Lipiden als Substrat verwendet. 2,6,7 Neben verlässt, kann die Lipid-Zusammensetzung von anderen pflanzlichen Geweben wie Wurzeln und Samen oder subzellulären Fraktionen wie Chloroplasten und Mitochondrien auch in der gleichen Weise bestimmt werden. Das Lösungsmittel-System (Aceton, Toluol, Wasser) ist hier für die Trennung von Glycolipiden und Phospholipiden in Pflanzen optimiert. Doch in tgd1, 2,3,4-Mutanten und isolierten Chloroplasten läuft TGDG zusammen mit PE während tetragalactosyldiacylglycerol läuft mit PC. In diesem Fall wird ein Lösungsmittel mit Chloroform, Methanol, Essigsäure und Wasser (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) wird 13 verwendet. Manchmal zweidimensionale TLC mit zwei verschiedenen Lösungsmittel-Systeme ist es, weitere separate Glycolipide und Phospholipide 19 durchgeführt. Darüber hinaus können pflanzliche Gewebe direkt auf die FAME Reaktion durch GLC gefolgt, um den gesamten Fettsäuregehalt Profil ohne anfängliche Trennung auf TLC 5 zu bestimmen unterzogen werden. Neben dem Beweis TLC-GLC System, ist eine weitere Methode für die Lipid-Profile genutzt, auf direktem Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie 17 beruht. Bei dieser Methode wird die erste chromatographische Trennung von Lipiden in der Extrakt wird weggelassen. Allerdings erfordert diese Methode teure Ausrüstung und erfahrenes Personal, das es weniger nützlich für Routine-Analysen im Labor oder für Mutanten-Screening macht.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-Naphthol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>Methanolische HCl 3N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33050-U</td><td>Mit Methanol auf 1N verdünnen</td></tr><tr><td>TLC-Platten Si250-PA</td><td>JT Baker</td><td>7003-04</td><td>Mit Vorabsorptionszone</td></tr><tr><td>TLC-Kammer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z266000</td><td></td></tr><tr><td>Schraubkolben</td><td>VWR international</td><td>53283-800</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschlüsse</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-Scheibe</td><td>Sun Sri</td><td>200 608</td><td></td></tr><tr><td>GLC-System</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP6890</td><td></td></tr><tr><td>Säule DB-23</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>122-2332</td><td></td></tr><tr><td>GLC-Probenfläschchen</td><td>Sun Sri</td><td>500 132</td><td></td></tr><tr><td>Verschlüsse für GLC-Probenfläschchen</td><td>Sun Sri</td><td>201 828</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation-Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2070AA</td><td></td></tr></tbody></table>

arabidopsis thaliana polar glycerolipid profiling durch dünnschichtchromatographie (tlc) mit gas-flüssigkeits-chromatographie (glc) coupled

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biologische Membranen einzelner Zellen aus der Umwelt. Aus einer einzigen Zelle zu vielzelligen Pflanzen und Tieren, Glycerolipide, wie Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin, Form-Doppelschicht-Membranen, die sowohl als Grenzen und Schnittstellen für die chemische Austausch zwischen Zellen und ihrer Umgebung zu handeln. Im Gegensatz zu Tieren haben Pflanzenzellen eine spezielle Organellen für die Photosynthese, die Chloroplasten. Die komplizierte Membransystem der Chloroplasten enthält einzigartige Glycerolipide, nämlich Glykolipide fehlt Phosphor: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), Digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. Die Rolle dieser Lipide sind über die reine strukturelle. Diese Glykolipide und andere Glycerolipide wurden in den Kristallstrukturen von Photosystem I und II mit den Engagements von Glycerolipiden bei der Photosynthese 8,11 gefunden. Während Phosphat Hunger, ist DGDG zu extraplastidic Membranen übertragen, um den Verlust von Phospholipiden 9,12 kompensieren. Viel von unserem Wissen über die Biosynthese und Funktion dieser Lipide wurde aus einer Kombination von genetischen und biochemischen Studien mit Arabidopsis thaliana 14 geschlossen wurde abgeleitet. Während dieser Studien wurde ein einfaches Verfahren für die Analyse von polaren Lipiden wurden für das Screening und Analyse von Lipid-Mutanten wesentlich und werden im Detail erläutert werden. Ein Blatt Lipidextrakt wird zunächst durch Dünnschichtchromatographie (TLC) getrennt und Glycerolipide sind reversibel mit Joddampf gefärbt. Die einzelnen Lipide werden aus der DC-Platte abgekratzt und konvertierte zum Fettacyl Methylester (FAME), die durch Gas-Flüssigkeits-Chromatographie mit Flammenionisationsdetektor (FID-GLC) (Abbildung 1) gekoppelt analysiert werden. Diese Methode hat sich bewährt, um eine zuverlässige Werkzeug für Mutanten-Screening werden. Zum Beispiel die tgd1, 2,3,4 endoplasmatischen Retikulum-to-Plastiden Lipid Handels-Mutanten wurden auf Basis der Akkumulation von einer anormalen galactoglycerolipid entdeckt: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) und eine Abnahme in der relativen Menge von 18:3 (Kohlen: Doppel- Anleihen) Fettacylgruppen in Membranlipiden 3,13,18,20. Diese Methode ist auch anwendbar für die Bestimmung enzymatischer Aktivitäten von Proteinen unter Verwendung von Lipiden als Substrat 6.

Zusammensetzung der polaren Lipid-Extrakte und der Fettsäure-Zusammensetzung der einzelnen Glycerolipide sind in einem einfachen und robusten Lipid-Profiling Experiment bestimmt. Zu diesem Zweck sind Glycerolipide durch Dünnschicht-Chromatographie isoliert und Transmethylierung ihrer Acylgruppen. Fatty Acyl Methylester durch Gas-Flüssigkeits-Chromatographie quantifiziert.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling durch Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) Coupled

Biologische Membranen trennen Zellen von ihrer Umgebung. Von der Einzelzelle bis hin zu mehrzelligen Pflanzen und Tieren bilden Glycerolipide, wie zum Beispiel ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die polare Lipidzusammensetzung von Arabidopsis-Keimlingen zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst Lipide aus den Keimlingen extrahiert werden. Anschließend werden die polaren Lipide mittels Dünnschichtchromatographie getrennt.Anschließend werden spezifische Lipidflecken von der Dünnschichtplatte isoliert und durch Transveresterung in Fettsäuremethylester umgewandelt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zusammensetzung der Fettsäuremethylester mittels Gas-Flüssigkeits-Chromatographie zu quantifizieren. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die das molare Verhältnis und das Fettsäureprofil jedes polaren Lipids im Wildtyp und im Mutanten zeigen.Hallo, mein Name ist Christophe Benning. Viele von Ihnen haben uns gefragt, wie man eine quantitative Analyse von polaren Lipiden durchführt. Wir verwenden eine sehr einfache und robuste Methode, die sich bei der groß angelegten Untersuchung von Mutanten in der Modellpflanze opsis oder den RG-Kilometer-Motoren bewährt hat.Andere hervorragende Methoden wie die massenspektrometrische Lipidprofilerstellung erfordern teure Geräte sowie viel Erfahrung und Schulung. Wir verwenden ein zweistufiges Verfahren, das eine einfache Dünnschichtchromatographie in Kombination mit der Quantifizierung von Fettsäuremethylestern nach der Isolierung von Mutanten beinhaltet. Üblicherweise ist eine genauere quantitative Analyse erforderlich.Dies erfolgt durch die Isolierung von Membranlipiden aus der Dünnschichtplatte und die Herstellung von Fettsäuremethylestern, die mittels Gas-Flüssigkeits-Chromatographie quantifiziert werden. Die Methode ist hochgradig reproduzierbar, und die Ergebnisse sind vergleichbar mit komplexeren, massenspektrometrischen Techniken. Der Ablauf wird von Zen Wang, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie die Lipidextraktion, indem Sie 30 Milligramm vier Wochen alter Arabidopsis-Blätter von Pflanzen gewinnen, die auf einem Agar-gefestigten Medium oder im Boden gezüchtet wurden. Überführen Sie die Blätter in 1,5-Milliliter-Polypropylen-Reaktionsgefäße.Geben Sie 300 Mikroliter Extraktionslösung, bestehend aus Methanol, Chloroform und Ameisensäure, zu jeder Probe hinzu. Schütteln Sie die Proben fünf Minuten lang kräftig. Fügen Sie danach 150 Mikroliter 0,2-molare Phosphorsäure und 1-molare Kaliumchloridlösung hinzu und wirlen Sie die Probe. Zentrifugieren Sie die Probe kurzzeitig mit 13.000 × g für eine Minute. Bei Raumtemperatur werden Lipide, die in der unteren Chloroformphase gelöst sind, auf Dünnschichtchromatographieplatten aufgetragen. Zum Vorbereiten der Dünnschichtchromatographieplatten tauchen Sie eine 20 mal 20 Zentimeter große Silicagel-beschichtete Dünnschichtchromatographieplatte mit Auftragestreifen in eine 0,15 molare Ammoniumsulfatlösung ein.Nachdem die Platte 30 Sekunden lang untergetaucht wurde, mindestens zwei Tage lang in einem geschlossenen Behälter trocknen lassen. Während der Aktivierung sublimiert das Ammonium und hinterlässt Schwefelsäure, die Phosphat an Glycerin protoniert, was für die Trennung von anderen Glycerinlipiden notwendig ist. Am Tag des Experiments die Dünnschichtchromatographie-Platten aktivieren, indem sie zwei Stunden und eine halbe Stunde lang bei 120 Grad Celsius im Ofen erhitzt werden.Nachdem die aktivierten Platten auf Raumtemperatur abgekühlt sind, verwenden Sie einen Bleistift, um eine gerade Linie über die Platte am Ursprung des Chromatogramms zu zeichnen. In einem Abzug wird Tigon-Schlauch, der an den Regler des Stickstofftanks angeschlossen ist, verwendet, um einen Strom von Stickstoffgas bereitzustellen; geben Sie langsam dreimal je 20 Mikroliter des Lipidextrakts aus der unteren Chloroformphase mit einer 20-Mikroliter-Pipette mit einem gelben 200-Mikroliter-Kunststoffspitzen unter einem langsamen Strom von Stickstoffgas auf die Platte. Eine 20-Mikroliter-Pipette wird verwendet, um den Fleck kleiner als einen Zentimeter im Durchmesser zu halten.Jede Platte kann bis zu 10 Proben aufnehmen, sobald die Lipidflecken vollständig trocken sind. Bereiten Sie im Abzug das Entwicklungslösungsmittel, das aus Aceton, Toluol und Wasser besteht, vor. Gießen Sie 80 Milliliter des Entwicklungslösungsmittels in eine dicht verschließbare Dünnschicht-Chromatographie-Entwicklungskammer und stellen Sie die Platte in den Behälter.Mit der Probenoberfläche nach unten den Tank verschließen. Mithilfe der Klammer steigt das Lösungsmittel die Platte hinauf und trennt die Lipide. Die Entwicklungszeit beträgt etwa 50 Minuten bei Raumtemperatur.Wenn die Laufmittelfront einen Zentimeter vom oberen Rand der Platte entfernt ist, nehmen Sie die Platte vorsichtig aus dem Behälter und trocknen Sie sie vollständig in der Abzugshaube für 10 Minuten. Mit der Dünnschichtchromatographie getrennte Lipide können entweder kurzzeitig reversibel mit Jod zur quantitativen Analyse angefärbt oder irreversibel mit Schwefelsäure oder Alpha-Naphthol angefärbt werden. Um die Platte irreversibel durch Schwefelsäure-Verkohlung anzufärben, führen Sie die Verkohlung mit Schwefelsäure durch.Sprühen Sie die Platte in einem Abzug mit 50 %iger Schwefelsäure in Wasser aus einer Glas-Sprühflasche und backen Sie sie 15 Minuten bei 120 Grad Celsius. Alternativ, bei der Alpha-Naphthol-Färbung für Glykolipide, sprühen Sie die Platte mit 2,4 % Gewicht pro Volumen Alpha-Naphthol in 10 % Volumen pro Volumen Schwefelsäure, 80 % Volumen pro Volumen Ethanol, und backen Sie die Platte bei 120 Grad Celsius drei bis fünf Minuten lang, bis die Glykolipidflecken rosa oder lila angefärbt sind.Führen Sie die Jodfärbung in einem Abzug durch, indem Sie einen geschlossenen LC-Tank vorbereiten, in dem sich Jodkristalle in einem Behälter am Boden des Tanks befinden, um die Atmosphäre mit Joddampf zu saturieren. Legen Sie die Dünnschichtchromatographie-Platte in den Tank, um sie dem Jod so lange auszusetzen, bis die Lipide sichtbar werden. Vermeiden Sie eine zu lange Belichtung gegenüber Jod, da das Jod kovalent binden könnte.Modifizieren Sie mehrfach ungesättigte Fettsäuren. Entfernen Sie das Silikat um identifizierte Lipidflecken auf der Dünnschichtchromatographieplatte mit dem Rasiermesser und kratzen Sie das Lipid enthaltende Silikat ab. Überführen Sie das Silikatpulver mithilfe eines Trichters in ein Glasröhrchen mit Teflon-Innendichtung und Schraubverschluss.Geben Sie mit einer Glaspipette je ein Milliliter einer chlorwasserstoffhaltigen Lösung in wasserfreiem Methanol zu jeder Probe hinzu. Fügen Sie anschließend mit einer 200-Mikroliter-Pipette mit gelber Kunststoffspitze je 100 Mikroliter einer Lösung mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Pentadecansäure als interne Standardsubstanz zu jeder Probe hinzu. Bereiten Sie außerdem ein Reagenzglas nur mit Pentadekansäure in methanolischer Chlorwasserstoffsäure als Kontrolle vor.Schließen Sie die Glasröhrchen dicht mit Teflon-versiegelten Kappen. Inkubieren Sie die Glasröhrchen 25 Minuten lang in einem Wasserbad bei 80 Grad Celsius. Die Röhrchen müssen versiegelt sein, damit das Lösungsmittel nicht verdunstet, nachdem die Röhrchen abgekühlt sind.Geben Sie ein Milliliter 0,9 %iger Natriumchloridlösung gefolgt von einem Milliliter Hexan hinzu und wirbeln Sie anschließend kräftig. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1000 × g für drei Minuten. Nach der Zentrifugation entfernen Sie die obere Hexanschicht der Probe mit einer Pasteurpipette im Abzug und geben Sie in ein neues Glasrohr mit den Maßen 13 × 100 Millimeter. Verdampfen Sie das Hexan unter einem langsamen Stickstoffstrom, ohne vollständig auszutrocknen, und lösen Sie die resultierenden fettsauren Methylester in 60 Mikrolitern Hexan auf. Überführen Sie die Proben in Autosampler-Fläschchen und verschließen Sie diese anschließend fest. Die Proben können kurzfristig bei vier Grad Celsius und über einige Tage bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, bevor die GLC beginnt. Stellen Sie sicher, dass die Helium-, Wasserstoff- und Luftflaschen gefüllt sind; ausreichend Hexan muss dem Lösungsmittelreservoir zugegeben werden, und der Abfallbehälter muss für die Trennung von Fettsäuremethylestern leer sein. Befestigen Sie eine DB-23-Säule an dem Gerät.Stellen Sie die Vials in den Autosampler. Starten Sie die ChemStation-Software für die GLC am Systemcomputer. Stellen Sie die Injektortemperatur auf 250 Grad Celsius bei einer Heliumströmungsrate von 48,6 Milliliter pro Minute und einem Druck von 21,93 PSI ein.Das Aufteilungsverhältnis beträgt 30 zu eins. Die Ofentemperatur wird zunächst zwei Minuten lang auf 140 Grad Celsius eingestellt und anschließend mit einer Rate von 25 Grad Celsius pro Minute auf 160 Grad Celsius erhöht. Danach wird die Temperatur mit einer Rate von acht Grad Celsius pro Minute von 160 Grad Celsius auf 250 Grad Celsius erhöht und für vier Minuten bei 250 Grad Celsius gehalten, gefolgt von einer Absenkung auf 140 Grad Celsius mit einer Rate von 38 Grad Celsius pro Minute.Mit diesem Temperaturprofil dauert ein Durchlauf etwa 21 Minuten. Die Temperatur des Flammenionisationsdetektors beträgt 270 Grad Celsius bei einer Wasserstoffflussrate von 30 Millilitern pro Minute. Die Luftflussrate liegt bei 400 Millilitern pro Minute und die Heliumflussrate bei 30 Millilitern pro Minute.Geben Sie die Anzahl der Vials und die Probennamen in der Laufsequenztabelle ein. Stellen Sie den 10-Mikroliter-Injektor so ein, dass er zwei Mikroliter der Probe pro Vial injiziert. Wenn das Gerät bereit ist, starten Sie die Laufsequenz.Beispiele für die Färbung von mittels Dünnschichtchromatographie getrennten Lipiden aus vier Wochen alten Arabidopsis-Keimlingen werden hier gezeigt. Die mit Schwefelsäure gefärbten Lipide sind verkohlt und erscheinen als braune Flecken. Alpha natal wird bevorzugt, um Glykolipide wie M-G-D-G-D-G-D-G und SQ dg anzufärben.Glykolipide, die mit Alpha-Naphthol gefärbt wurden, zeigen eine rosa-violette Färbung, während andere polare Lipide gelb anfärben. Die Iodfärbung ist reversibel und verleiht den Lipiden eine gelbliche Farbe, die innerhalb kurzer Zeit verschwindet, da das Iod verdunstet. Kurz gesagt, iodgefärbte Lipide können einer GLC-Analyse unterzogen werden, obwohl ungetränkte Lipide bevorzugt werden, um den Abbau der Lipide zu verringern, sofern dies erfolgreich durchgeführt wird.Charakteristische Signale, die verschiedene fettsäuremethylester repräsentieren, werden beobachtet, nachdem fettsäuremethylester mittels GLC getrennt wurden; Fettsäuremethylester mit kürzeren Kohlenstoffketten und weniger Doppelbindungen weisen eine kürzere Retentionszeit auf. Unter Verwendung der DB-23-Säule ist die Profilierung von Fettsäuremethylestern ein empfindliches Werkzeug, um Mutanten mit veränderter Lipidzusammensetzung zu identifizieren.Das molare Verhältnis der drei Fettsäuren von MGDG 18 ist im TGD4-1-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp verringert, indem die Molzahl der Fettsäuremethylester einer Lipidklasse durch die Molzahl der Fettsäuremethylester aller Lipidklassen dividiert wird. Für alle Lipidklassen werden die molaren Verhältnisse jedes Lipids berechnet; die resultierenden molaren Verhältnisse jeder Lipidklasse können sowohl für den Wildtyp als auch für den Mutanten hier verglichen werden. Es zeigt sich deutlich, dass der TGD4-1-Mutant erhöhte relative Mengen an MGDG und PG, jedoch verringerte Mengen an DGDG, N und PE aufweist. Die Dünnschichtchromatographie ermöglicht die parallele Untersuchung vieler Proben und erlaubt eine visuelle Beurteilung wesentlicher Unterschiede in den Lipidprofilen.Außerdem untersuchen Sie bei einer Dünnschichtchromatographie im Wesentlichen zahlreiche Enzyme und Gene, die für die Synthese der Lipide und somit für das Lipidprofil erforderlich sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Zusammensetzung polarer Lipide mittels TOC und GOC analysiert. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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