Name: Vorbereitung und Kultur von Chicken auditorischen Hirnstamm Slices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Hühnchen-Hirnstammschnitten für physiologische Aufzeichnungen und langfristige Organotypkulturen. Diese Methode ermöglicht Studien zur neuronalen Entwicklung und auditorischen Verarbeitung.

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Aktuelle und ehemalige Rubel lab Mitglieder.

1. Vorbereitung der Dissecting Bereich <ol><li> Kontinuierlich Blase künstliche Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) mit einer Mischung aus 95% O 2 / 5% CO 2 (pH-Wert zwischen 7,2 bis 7,4, Osmolarität 295-310 mOsm / l). </li><li> Während ACSF brodelt, saubere Arbeitsfläche mit 70% EtOH. Reinigen Sie auch die Vibratom und Schneidscheibe. Spülen Klinge mit destilliertem Wasser (dH 2 O). </li><li> Legen Sie saubere Flüssigkeitsaufnahme Pad auf Sezieren mit geeigneten Werkzeugen sezieren. </li><li> Kleber Agarblock (40 mg Agarose / mL, dh 4%, in dH 2 O) auf die Bühne eines Vibratom-Slicing Kammer *. * Tipp: Bereiten Agar vor Dissektion. Shop vorgefertigte Agar in einer Petrischale abgedeckt in den Kühlschrank. Agarose gekauft EMD Chemicals oder Invitrogen. </li></ol> 2. Herstellung von 6-well Platten mit Kulturmedium <ol><li> Unter einer sterilen Haube, füllen 1 gut pro Tier einer 6-well-Platte mit 1 ml Kulturmedium und Inkubation bei 35 ° C und 5% CO 2. </li><li> Bereiten Sie so viele Kultur-Membran-Einsätze nach Bedarf und legen Sie sie in der Kapuze für die spätere Verwendung. </li></ol> 3. Isolation von Chicken auditorischen Hirnstamm <ol><li> Legen Ei unter eine helle Lichtquelle, um die Luft gefüllten Raum void des Embryos (in der Regel der großen Seite des Eies) zu bestimmen. </li><li> Aufbrechen, große Seite Ei auszusetzen Membran sac. Machen Sie schneiden in der Membran sac mit Skalpell und entfernen Sie vorsichtig den Kopf des Hühnerembryo. </li><li> Schnell enthaupten Kopf mit einer Schere. </li><li> Platzieren Sie die Spitze der Rasierklinge leicht hinter und zwischen den Augen. Machen Sie eine rostral-to-caudal Mittellinienschnitt durch den Schädel Anwendung nur mit leichtem Druck *. * Tipp: Druck ist abhängig von dem Alter des Embryos (dh jünger = weniger, älter = mehr) </li><li> Vorsichtig beiseite schieben Haut und Federn, um Schädel zu entlarven und zu überprüfen Mittellinie geschnitten. </li><li> Block rostralen Teil des Schädels durch Schneiden mit einer Rasierklinge. Position Klinge hinter Augen und schnell durch das ganze Schädel-Hirn-Gewebe geschnitten *. * Tipp: starker Druck erforderlich ist, um vollständig zu entfernen rostralen Abschnitt. </li><li> Machen Mittellinie zu seitliche Einschnitte mit einer kleinen Schere im kaudalen Bereich des Schädels, leicht anterior sichtbar Nackenmuskulatur auf beiden Seiten des Kopfes. Ziehen Sie sich Schädel und Gewebe des Kleinhirns und des Gehirns aufzudecken. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Hirnstamm von Schädelbasis durch Schneiden angebracht Gewebe mit einer kleinen Schere. Sobald alle Gewebe geschnitten wird, sollte Hirnstamm frei weg von den Schädel *. * Tipp: Sie müssen möglicherweise den Schädel (Gehirn nach unten) blättern, um befestigt Gewebe zu schneiden. </li></ol> 4. Vorbereitung der Hirnstamm für Slicing <ol><li> Einmal aus dem Schädel entfernt, pin Hirnstamm nach unten durch die Optik tecta. </li><li> Vollständig zu entfernen das Kleinhirn durch vorsichtiges Schneiden der Stiele mit einer kleinen Schere, Freilegung der Boden des vierten Ventrikels. </li><li> Entfernen Sie alle häutigen Gewebe und Blutgefäße von der Oberfläche des Hirnstamms mit einer Pinzette und machen seitliche Schnitte durch die Optik tecta zum Hirnstamm zu isolieren. </li><li> Legen Sie eine kleine Menge Sekundenkleber auf der Vibratom Bühne vor dem Agar-Block (gegen Vibratom Klinge). </li><li> Mit Pinzette, sanft und schnell heben Sie den Hirnstamm in das Rückenmark und Ort Gewebe auf den Superkleber mit der rostralen Seite nach unten und dorsal in Richtung auf Vibratom Klinge *. * Tipp: überschüssigen Kleber sollte mit aufgenommen werden einen Kim-Wisch-oder Filterpapier vor dem nächsten Schritt. </li><li> Vorsichtig gießen Sauerstoff ACSF in die Vibratom Bühne *. * Hinweis: dieser ACSF kann kontinuierlich mit O 2 / CO 2 perlen. Allerdings Sprudeln ACSF in einem so kleinen Volumen der Lösung ergibt sich unerwünschte Bewegungen (und mögliche Schäden) an Hirnstamm Scheiben schneiden. Wenn erfolgen schnell, bereits mit Sauerstoff ACSF aus der Zerlegung ist ausreichend. </li><li> Vibratom Klinge sollte bei 20-22 ° Winkel sein. Starten Vibratom (Schwingung bei maximaler Amplitude eingestellt werden) und bewegen Bühne bis zur Klinge, so dass die Spitze des Gewebes parallel mit der Klinge vor dem Schneiden. </li><li> Schnell bewegen Klinge in Richtung Hirnstamm Gewebe. Slow down erheblich kurz vor Klinge Kontakt mit dem Gewebe. </li><li> Begin Slicing Gewebe mit langsamsten Vorwärtsbewegung. Einmal durch die gesamte Frontalschnitt des Gewebes, sanft bewegen Stück weg von der Klinge mit einer Bürste oder ein zerbrochenes Glas, feuerte polierten Pipette, fit an einem Ende mit einem Gummiball. </li><li> Untere Bühne in 300-500 um Schritte und in Scheiben schneiden erneut. Wiederholen, bis anatomischen Unterschriften sichtbar in Hirnstamm Gewebe. Zu diesem Zeitpunkt Dicken Scheibe Hirnstamm Gewebe mit auditiven Strukturen auf 200-1000 um, je nach Alter des Gewebes und experimentellen Anforderungen. </li><li> Sorgfältig pflegen nutzbare Scheiben in der Reihenfolge des Schneidens, dh, stellt der 1. Scheibe den kaudalen Bereich der Schaltung (low-frequency-Sound Processing) und die letzte Scheibe repräsentiert die rostralen Abschnitt (Hochfrequenz-Processing) *. * Hinweis: für die Platzierung von Scheiben für Kultur zu verwenden, mit Abschnitt 6 fort. Für in-vitro Physiologie Lagerung, siehe nächster Abschnitt. </li></ol> 5. Slice-Speicher für in-vitro Physiology <ol><li> Je nach Alter des Hühnerembryo und die Dicke der Scheibe, sollte jedes Tier bieten 1 bis 6 Scheiben schneiden. </li><li> Sanft statt einzelne Segmente in der Kammer mit feuerpolierte Glaspipette an einem Ende mit einem Gummi-Glühlampe. Kammer sollten nummeriert werden. Legen Sie nur eine Scheibe pro Vertiefung, um einige tonotopen Spezifität (z. B. die meisten caudal Scheibe in der Kammer 1 und die meisten rostral Scheibe in die letzte Kammer) zu halten. Kammer sollte mit ACSF gefüllt werden und kontinuierlich mit einer Mischung aus 95% O 2 / 5% CO 2 (pH 7,4, Osmolarität 295-310 mOsm / l) geleitet. </li><li> Lassen Sie Slices, indem die Kammer in ein warmes Bad (36 ° C) für ca. 1 Stunde ausgleichen. </li><li> Entfernen Kammer vom warmen Bad und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für ca. ½ Stunde ruhen lassen. </li><li> Nach ½ Stunden bei Raumtemperatur, können Scheiben von der Aufnahmekammer eine ~ 0,5 mL Aufnahme Kammer an einem Mikroskop für elektrophysiologische Experimente montiert übertragen werden. </li><li> Scheiben kann verwendet werden für bis zu ca. 6 Stunden nach der Entnahme aus der warmen Badewanne. </li></ol> 6. Vorbereitung der organotypischen Kulturen 8 <ol><li> Unmittelbar nach dem Aufschneiden Verfahren (siehe Abschnitt 6) übertragen Scheiben mit ~ 500 ul ACSF mit einem feuerpolierte Glaspipette an einem Ende mit einem Gummiball auf eine 48-Well-Platte auf Eis ausgerüstet. Eine Scheibe pro Well *. * Tipp: Scheiben müssen mindestens 300 um und bis 1000 um dick sein. </li><li> Nach Scheiben gesammelt worden sind, übertragen Sie die 48-Well-Platte an der Kapuze. </li><li> Entfernen einer 6-well-Platte mit Kulturmedium aus dem Inkubator und überträgt es auf die Motorhaube. </li><li> Kurz vor der Platzierung Scheiben aus einem einzigen Gehirn auf Membranen, eine der vorbereiteten Membran-Einsätze statt (siehe Abschnitt 2.2) in eine gut mit Kulturmedium. Achten Sie darauf, keine Luftblasen unter der Membran zu präsentieren. </li><li> Mit einer Glaspipette, Übertragung einer Scheibe in einem Tropfen ACSF auf die Kultur-Membran und entfernen überschüssige ACSF mit der Pipette. Wiederholen Sie für die restlichen Scheiben (max 4 Scheiben pro Membran) *. * Tipp: Achten Sie darauf, Scheiben nicht berühren einander und legen Scheiben zentral auf der Membran, so dass sie sich nicht berühren der Membran Felge. </li><li> Wiederholen Sie dies für so viele Hirnschnitten nach Bedarf *. * Tipp: Wenn Kulturen zu einem späteren Zeitpunkt manipuliert werden, könnte es vorteilhaft sein, den Betrag von Membranen bis 3 Limit pro 6-Well-Platte als die Zeit, die Kulturen aus dem Brutschrank entnommen sind zu reduzieren. </li><li> Ändern Kulturmedium 3 mal pro Woche unter einer Haube: Entfernen Sie alte Medium mit einer Vakuum-Röhre mit einer sterilen Spitze, während Membran eingefügt wird aus dem Brunnen mit einer Pinzette angehoben. 1 ml frisches Kulturmedium in gut während die Membran eingefügt wird aus dem Brunnen gehoben. Wenn alle Medium gewechselt wird, setzen Platte zurück in den Inkubator. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Binaural Schaltung des Huhns auditorischen Hirnstamm. (A) Schematische Darstellung eines koronalen Abschnitt und (BF) in-vitro Schnittbilder des Huhns auditorischen Hirnstamm. Die Schaltung in (A) zeigt afferenten erregenden Eingänge aus den Hörnerv (AN) zu Kern magnocellularis (NM) und Nucleus angularis (NA). NM Projekte bilateralen exzitatorischen Eingänge Kern Laminaris (NL) auf beiden Seiten des Hirnstamms. Eine inhibitorische Eingang von der oberen Olive Kern (SON) Projekte zur NA, NM und NL. Die in-vitro Scheiben in (BF) sind aufeinander folgenden Bildern (200 um jeweils) geht von kaudal (B) zu rostral (F) des Huhns auditorischen Hirnstamm, die die niedrig-bis hochfrequente Regionen bzw.. Circuitry ist verantwortlich für die Codierung von zeitlichen Eigenschaften von Ton in erster Linie für Sound-Lokalisierung verwendet. Balken in (B) = 500 um und gilt für Bilder in (CF). Arrows in (D) weisen auf die einzelne Zelle Körper Schicht aus NL. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Kultivierten Neuronen entwickeln normale physiologische Reaktion Eigenschaften. Überlagert Membran Spannungsänderungen in Reaktion auf Hyperpolarisation und depolarisierende aktuellen Schritte von akuten (A &amp; C) und gezüchtetes Gewebe in 4 (B) und 7 (D) Tagen in Kultur (DIC). Hinweis Änderungen in hyperpolarisierenden Spannung "sag", starke Reduktion der nach außen gerichteten Strom, und einzelne AP Feuern, die sich ähnlich entwickeln, die Scheibe Kultur-Ansatz im Vergleich zum Alter entspricht akuten Gewebe. Aktuelle Injektionen wurden 200 ms, nur wenige Schritte von 50-100 pA. RMP wurden zwischen -55 und -60 mV. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Anatomische Strukturen in Kultur slices. linken Hälfte des auditorischen Hirnstamm eines E11 Huhn nach 7 Tagen in Kultur (DIC). Ein Antikörper gegen das Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP2), die im Soma und Dendriten auftritt, ist in grün gekennzeichnet. Eine Gruppe von Kern magnocellularis (NM) Neuronen und ihre Axone sind in rot über Elektroporation eines Alexa Dextran Farbstoff markiert. Beide NM und NL-Zelllinie sichtbar sind. Ipsilateral NM Axonterminalen sehen projizieren zum dorsalen NL Dendriten (weiße Pfeilspitzen) werden.

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</ol>

Seit mehreren Jahrzehnten hat sich die akuten Scheibe Vorbereitung des Huhns Hirnstamm verwendet worden, um Studie auditiven Verarbeitungs-9, 10. Dieser Ansatz hat eine enorme Menge von in-vitro physiologischen Daten auf binauralen Verarbeitung sowohl von Entwicklungs-und reifen Staaten 4, 11, 12 vorgesehen. Viel ist über diese hoch spezialisierten Schaltung und die Rolle jeder Kern spielt in der zeitlichen Verarbeitung von Ton 13, 14 bekannt. In der Tat haben kurzfristige exper...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Hühner-ACSF&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11624</td><td>130 mM</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M-10576</td><td>26 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-9333</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8282</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>423525000</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hühner-Kulturmedium (bei 4&amp;#x00B0;C lagern)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>erweitertes Minimum-Essential-Medium (mit NEAA, Natriumpyruvat bei 110 mg/l, ohne L-Glutamat)</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>48,00 %</td></tr><tr><td>Earl&amp;rsquo;s abgeglichene Salzlösung</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2888</td><td>24,00 %</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7513</td><td>1,00 %</td></tr><tr><td>Glucoselösung (200 g/l, sterilfiltriert)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td>2,75 %</td></tr><tr><td>Pferdeserum (hitzeinaktiviert, sterilfiltriert)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138</td><td>24,00 %</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin*</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0781</td><td>1,00 ml&lt;br/&gt;* = Bei Bedarf 1,00 ml zu 100 ml Kulturmedium hinzufügen, um Kontaminationen zu verhindern</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Spezifische Ausrüstung&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM Zellkultur-Einsätze</td><td>PICMORG50</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-Loch-Platte</td><td>6-Loch-Zellkultur-Platte</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brutschrank</td><td>Forma Scientific CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Wassermantel-Brutschrank</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung und kultur von chicken auditorischen hirnstamm slices

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Das Huhn auditorischen Hirnstamm ist ein gut etabliertes Modell, das in großem Umfang verwendet wurde, um die Anatomie und Physiologie der auditiven Verarbeitung bei diskreten Perioden der Entwicklung 1-4 sowie Mechanismen für die zeitliche Kodierung in das zentrale Nervensystem 5-7 studieren. Hier präsentieren wir eine Methode, um Hühner auditorischen Hirnstamm Scheiben, die für die akute experimentelle Verfahren oder zur Kultur organotypischen Schnitten für die langfristige experimentelle Manipulationen genutzt werden kann vorzubereiten. Das Huhn auditorischen Hirnstamm ist der Kern angularis, magnocellularis, Laminaris und oberen Olive zusammen. Diese Kerne sind verantwortlich für die binaurale Signalverarbeitung und Single koronare Schicht Präparate erhalten die gesamte Schaltung. Letztlich kann organotypischen Kulturen die Möglichkeit bieten, mehrere Entwicklungs-Parameter wie synaptische Aktivität, Expression von Pre-und postsynaptischen Komponenten, Ausdruck von Aspekten Controlling Erregbarkeit und differenziellen Genexpression zu manipulieren Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die allgemeinen Kenntnisse über neuronale Schaltkreis Entwicklung, Verfeinerung und Reifung zu erweitern.

Das Huhn auditorischen Hirnstamm ist der Kerne verantwortlich für die binaurale Signalverarbeitung zusammen. Ein einziger koronare Schicht Vorbereitung unterhält die gesamte Schaltung, während die kultivierten Ansatz bietet eine einzigartige Vorbereitung auf die Entwicklung der neuronalen Struktur und auditiven Funktion auf molekularer, zellulärer und Netzebenen zu studieren.

Vorbereitung und Kultur von Chicken auditorischen Hirnstamm Slices

Der auditorische Hirnstamm des Huhns ist ein etabliertes Modellsystem, das in großem Umfang eingesetzt wurde, um die Anatomie und Physiologie der auditorischen Verarbeitung bei ... zu untersuchen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hörstammpräparate aus Hühnerembryonen für die in-vitro-Ganzzellphysiologie oder langfristige organotypische Kulturen vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst das Embryo aus dem Ei entnommen wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gehirn aus dem Schädel zu präparieren und die auditorische Hirnstammregion zu isolieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Schnitte des Hirnstammgebiets auf einem Viotom vorzubereiten. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Platzieren von Hirnstammschnitten in einer Kammer zur Ableitung physiologischer Signale oder auf Millipore-Platten zur Kultivierung. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die gesunde auditorische Hirnstammschnitte aus Hühnerembryonen mittels physiologischer Ableitungen oder langfristiger organotypischer Kulturen zeigen.Hallo, mein Name ist Armand Sidle. Beide Methode kann Einblicke in die auditorische Entwicklung von Vögeln liefern. Sie kann auch verwendet werden, um die topographische Exonregeneration, Dendritendynamik sowie intrinsische und synaptische Eigenschaften aufgrund der einzigartigen Struktur und Funktion dieser binauralen auditorischen Schaltung zu untersuchen.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten haben. Das Gewebe muss schnell disseziert, geschnitten und gelagert werden, um lebensfähige Proben für physiologische Untersuchungen und Kultivierungsansätze zu erhalten. Stellen Sie zunächst eine 4 %ige Agar-Lösung her, indem Sie 40 Milligramm Agar pro Milliliter destilliertem Wasser hinzufügen und in der Mikrowelle zum Kochen erhitzen.Gießen Sie die heiße Agar-Lösung in eine Petrischale und lassen Sie sie abkühlen, bis sie nach dem Erstarren fest ist. Schneiden Sie einen kleinen Agarblock aus und kleben Sie ihn auf die Vibratomstufe. Bereiten Sie anschließend 500 bis 1000 Milliliter künstlichen zerebrospinalen Flüssigkeit oder A CSF für später vor.Verwenden Sie die Vibratokammer, die kontinuierlich mit einer Mischung aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid durchblubbert wird, bei einem pH-Wert von 7,2 bis 7,4 und einer Osmolarität von 295 bis 310 Milliosmol pro Liter. Während das ACSF durchblubbert wird, reinigen Sie die Dissektions- und Kulturbereiche, den Vibratom und die Klinge mit 70 %igem Ethanol. Spülen Sie die Vibratomklinge mit destilliertem Wasser ab und lassen Sie sie trocknen. Legen Sie ein sauberes Flüssigkeitsabsorptionspad in den Dissektionsbereich und bereiten Sie die entsprechenden Dissektionsinstrumente vor, die in der Regel aus einem Skalpell, einer Schere, einer Pinzette, Rasierklingen, Nadeln, einer Petrischale und einem Spatel bestehen. Unter einer sterilen Gewebekulturhaube füllen Sie je ein Loch pro Hühnerembryo in einer Sechslochplatte.Mikrotiterplatte mit einem Milliliter Kulturmedium und Inkubation bei 35 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Bereiten Sie so viele Kulturmembraneinsätze vor, wie benötigt werden, und lagern Sie diese im Sicherheitswerkbank für den späteren Gebrauch. Verwenden Sie sie auf dem Präparationsbrett.Legen Sie ein Ei unter eine Lichtquelle, um den luftgefüllten Bereich zu lokalisieren, der frei von dem Embryo ist und sich gewöhnlich an der größeren Seite des Eis befindet. Öffnen Sie die größere Seite des Eis mit dem flachen Ende des Spatels und legen Sie die Membranhülle frei. Schneiden Sie mit dem Skalpell oder der Schere in die Membranhülle und entnehmen Sie vorsichtig den Kopf des Hühnerembryos mit dem Spatel.Mit einer Schere das Kopfende des Embryos schnell abtrennen. Die Spitze einer Rasierklinge leicht hinter der Mitte der Augen ansetzen und einen medianen Schnitt von rostral nach kaudal durch den Schädel führen.Sanften Druck bei jüngeren Embryonen anwenden. Verwenden Sie weniger Druck bei älteren Embryonen. Erhöhen Sie den Druck jetzt, da der Einschnitt erfolgt ist.Schieben Sie die Haut und die Federn bei älteren Tieren vorsichtig beiseite, um den Schädel freizulegen und die Mittellinie zu überprüfen. Schneiden Sie. Blockieren Sie mithilfe starker Druckausübung den rostralen Teil des Schädels, indem Sie mit einer Rasierklinge schneiden. Positionieren Sie die Klinge hinter den Augen und schneiden Sie schnell durch den gesamten Schädel und das Gehirngewebe hindurch.Legen Sie das blockierte Gewebe mit der Coddle-Seite nach oben in eine Petrischale. Fixieren Sie das Gewebe durch die seitliche Muskelregion mit Nadeln und tauchen Sie es vollständig in gebraustes ZNS ein.Führen Sie mit einer kleinen Schere Schnitte von der Mittellinie nach lateral im kaudalen Bereich des Schädels durch, leicht vor den sichtbaren Nackenmuskeln auf beiden Seiten des Kopfes. Ziehen Sie den Schädel und das Gewebe zurück, um das Kleinhirn und das Gehirn freizulegen. Nachdem das Gehirngewebe freigelegt ist, lokalisieren Sie das Kleinhirn und den Hirnstamm, um das Gewebe aus dem Schädel zu entfernen.Verwenden Sie ein kleines Paar Schere, um vorsichtig das am Schädelbasis befestigte Gewebe, das den Hirnstamm an der ventralen Seite umgibt, abzutrennen. Sobald der Hirnstamm vom Schädel entfernt wurde, befestigen Sie ihn mit Nadeln in einer Petrischale, die mit Zigarre durch die Optica gefüllt ist. Entfernen Sie anschließend vollständig das Kleinhirn, indem Sie die Pedunkel mit der kleinen Schere durchtrennen, wodurch der Boden des vierten Ventrikels freigelegt wird.Entfernen Sie mit einer Pinzette jegliche Membran, Gewebe und Blutgefäße von der Oberfläche des Hirnstamms und führen Sie seitliche Schnitte durch das Optische Teta durch. Um den Hirnstamm zu lösen, geben Sie mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig, aber zügig eine kleine Menge Sekundenkleber auf die Vibram-Ablage vor dem Agarblock. Heben Sie den Hirnstamm am Rückenmark an und platzieren Sie das Gewebe mit der rostralen Seite nach unten und der dorsalen Seite in Richtung der Vibram-Schneide auf den Sekundenkleber.Nehmen Sie jeglichen überschüssigen Klebstoff mit einem Papiertuch oder Filterpapier auf. Füllen Sie die Vibrationsmesserschneidstufe vorsichtig mit etwa 100 Milliliter oxygeniertem A-CSF. Falls das Schneiden schnell durchgeführt wird, kann das vorbereitete oxygenierte A-CSF verwendet werden.Aus dem ersten Abschnitt. Positionieren Sie die Vibram-Säge so, dass sie einen Winkel von 20 bis 22 Grad in Bezug auf die Vibram-Plattform bildet. Starten Sie die Vibram mit maximaler Schwingungsamplitude.Bewegen Sie dann den Ständer entlang der Klinge nach oben, sodass die Oberseite des Gewebes parallel zur Klinge liegt. Vor dem Schneiden bewegen Sie die Klinge schnell in Richtung des Hirnstammgewebes, verlangsamen die Bewegung jedoch erheblich, kurz bevor die Klinge das Gewebe berührt.Da die Klinge nun in Position ist, beginnen Sie mit dem Schneiden des Gewebes mit der langsamsten möglichen Vorwärtsbewegung. Nachdem der gesamte koronare Gewebeschnitt durchlaufen ist, schieben Sie die Schnitte vorsichtig mit einem Pinsel von der Klinge weg und entsorgen Sie diese. Senken Sie die Vibratomschneidebühne in Schritten von 300 bis 500 Mikrometern und schneiden Sie weiter.Wiederholen Sie dies erneut, bis anatomische Merkmale im Hirnstammgewebe sichtbar sind, und verwerfen Sie alle vorherigen Schnitte. Schneiden Sie nun das Hirnstammgewebe, das auditorische Strukturen enthält, bei Dicken von 200 bis 1000 µm und sammeln Sie die brauchbaren Schnitte vorsichtig in der Reihenfolge des Schneidens.Wenn die Schnitte für die in-vitro-Physiologie verwendet werden sollen, was in einem späteren Abschnitt dieses Videos gezeigt wird, sollten sie an dieser Stelle einzeln in speziellen Kammern aufbewahrt werden, die aus hohlen Kunststoffröhrchen bestehen, die oben offen sind und unten ein Nylonnetz haben, das am Boden verklebt ist. Jede einzelne Kammer ist mit einer größeren Lagervorrichtung verbunden, in der kontinuierlich etwa 350 Milliliter A-CSF durchperlt wird. Wenn die Schnitte für organotypische Kulturen verwendet werden sollen, siehe den nächsten Abschnitt unmittelbar nach der Schnittsammlung: Überführen Sie die Schnitte mit etwa 500 Millilitern A-CSF mithilfe einer fein abgeschliffenen Glaspipette, an deren einem Ende ein Gummiballon angebracht ist, in eine 48-Well-Platte auf Eis.Je einen Schnitt pro Vertiefung platzieren und die Reihenfolge der Schnitte beibehalten. Nach Abschluss sammeln Sie alle Schnitte eines Gehirns und bringen die 48-Loch-Platte in die Zellkulturwerkbank. Holen Sie die zuvor vorbereitete 6-Loch-Platte aus dem Inkubator und bringen Sie diese ebenfalls in die Werkbank.Platzieren Sie einen Membraneinsatz in eine Vertiefung mit Kulturmedium, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keine Luftblasen darunter befinden. Übertragen Sie mithilfe einer Glaspipette einen Schnitt in einem Tropfen A-CSF auf die feuchte Membran. Saugen Sie mit einer Mikropipette überschüssiges A-CSF, das sich noch auf der Oberseite befindet, vorsichtig ab.Wiederholen Sie dies für maximal vier Schnitte pro Membran, und positionieren Sie die Schnitte so, dass sie sich nicht berühren und auch nicht den Rand der Membran berühren. Lagern Sie die Kulturen in einem 35-Grad-Celsius-Inkubator und pflegen Sie sie, indem Sie das Kulturmedium dreimal pro Woche unter einem Zellkulturwerk wechseln. Platzieren Sie jeden Schnitt mit einer an einem Ende mit einem Gummiballon ausgestatteten, feuerpolierten Glaspipette in einer separaten Haltekammer.Die Reihenfolge des Schneidens beibehalten. Die Haltekammer sollte mit dem zuvor hergestellten A-CSF gefüllt und während der gesamten physiologischen Experimente kontinuierlich mit einer Mischung aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid durchblubbert werden. Die Schnitte durch Einbringen der Haltekammer in ein Wasserbad von 35 °C etwa eine Stunde lang äquilibrisieren lassen und anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen.Schnitte können bis zu sechs Stunden nach dem Entfernen aus dem warmen Bad verwendet werden. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur können die Schnitte aus der Haltekammer in eine 0,5-Milliliter-Aufzeichnungskammer überführt werden, die auf einem Mikroskop für elektrophysiologische Experimente montiert ist. Hier sind eine repräsentative schematische Darstellung und In-vitro-Schnittbilder der auditorischen Schaltung des Huhns gezeigt.Die Schnittbilder sind typisch für die Region des auditorischen Hirnstamms und können nach etwas Übung leicht identifiziert werden. Die exzitatorischen Eingänge aus dem Hörnerv oder aN projizieren sowohl auf den Nucleus magnocellularis (NM) als auch auf den Nucleus angularis (Na). Der NM sendet bilaterale exzitatorische Eingänge zum Nucleus laminaris (NL) auf beiden Seiten des Hirnstamms.Ein hemmender Eingang vom Nucleus olivaris superior oder SON projiziert auf die na, nm und nl. Hier ist eine koronare Schnittpräparation des auditorischen Hirnstamms eines Huhns vom Embryonalentwicklungsstadium E11 nach sieben Tagen in Kultur dargestellt.Neuronen wurden mithilfe immunhistochemischer Methoden markiert, wobei ein Antikörper gegen das mit Mikrotubuli assoziierte Protein 2, das im Soma und in den Dendriten vorkommt, die Neuronen grün färbt. Ein Haufen von NM-Neuronen und -Axonen wird durch Elektroporation eines rin-Farbstoffs rot markiert. Die ipsilateralen NM-Axonendigungen, die durch die weißen Pfeilspitzen angezeigt werden, sind sichtbar und reichen zu den dorsalen NL-Dendriten hin.Hier sind überlagerte Änderungen der Membranspannung in Reaktion auf hyperpolarisierende und depolarisierende Stromsprünge aus akutem und kultiviertem Gewebe nach vier und sieben Tagen in Kultur dargestellt. Beachten Sie die Veränderungen im hyperpolarisierenden Spannungssag, die starke Abnahme des Auswärtsstroms und das Feuern einzelner Aktionspotentiale, die sich im Schnittkulturansatz ähnlich entwickeln. Im Vergleich zu akutem Gewebe gleichen Alters lagen die Ruhemembranpotentiale zwischen minus 55 und minus 60 Millivolt. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als 15 Minuten durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, geeignete sterile Techniken anzuwenden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hörbalkenschnittpräparate von Hühnern herstellt, die für physiologische Ableitungen oder zum Kultivieren verwendet werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dies ist ein Protokoll zu erstellen und Aufrechterhaltung eines Neokortex Scheibe Vorbereitung in organotypischen Kultur zum Zwecke der Herstellung elektrischer Aufnahmen von pyramidalen Neuronen.

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Das Video zeigt die Vorbereitung von Kleinhirnschnitten. Es zeigt ein detailliertes Verfahren zur Isolierung des Kleinhirns aus einem Hühnerembryo. Die Scheiben werden dann aus dem präparierten Kleinhirn mit einem Gewebehacker für die weitere experimentelle Analyse präpariert.

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Scheibe Kulturen ermöglichen die Manipulation der Embryonalentwicklung durch Gen-und pharmakologische Störungen. Allerdings müssen Kulturbedingungen sicherzustellen, dass eine normale Entwicklung innerhalb der reduzierten Umfeld der Scheibe gehen. Wir stellen ein Protokoll, das normale Entwicklung Rückenmarks erleichtert, um für wenigstens 24 Stunden fort.

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Schwingungen sind grundlegende Netzeigenschaften und sind von Krankheiten und Arzneimittel moduliert. Studieren Gehirn-slice Schwingungen ermöglicht Charakterisierung der isolierten Netze unter kontrollierten Bedingungen. Protokolle sind für die Herstellung von akuten Gehirnscheiben zum Hervorrufen CA1 γ Schwingungen vorgesehen.

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Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

Auditorische Hirnstamm Neuronen von Vogel und Säugetiere sind spezialisiert auf schnelle neuronale Kodierung, ein grundlegendes Verfahren für normale Hörfunktionen. Diese Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern des embryonalen Hinterhirns. Wir präsentieren Techniken, die die Elektroporation verwenden, um Gene im Hirnhirn von Hühnerembryonen zu exprimieren, um die Genfunktion während der auditorischen Entwicklung zu untersuchen.

In Ovo Electroporation im Hühnchen auditorischen Hirnstamm

Dieses Protokoll sowohl visuell kommuniziert die Hirnstamm Rückenmark Vorbereitung und klärt die Vorbereitung der Hirnstamm quer Scheiben in umfassender Weise Schritt für Schritt. Es wurde entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, und erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Erlangung lebensfähiger, lang anhaltender, rhythmisch aktiv Scheiben für die Aufzeichnung von neuronalen Ausgang aus der Atemwege Regionen der Hirnstamm.

Vorbereitung von rhythmisch-Active In Vitro neonatale Nagetier Hirnstamm-Rückenmark und dünne Scheibe

Die Integration verschiedener synaptischer Inputs in Neuronen wird am besten in einer Zubereitung gemessen, die alle präsynaptischen Kerne für natürliches Timing und Schaltplastizität bewahrt, aber Gehirnscheiben trennen in der Regel viele Verbindungen. Wir entwickelten eine modifizierte Gehirnscheibe, um die In-vivo-Schaltungsaktivität nachzuahmen und gleichzeitig die In-vitro-Experimentierfähigkeit aufrechtzuerhalten.

In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Gewinnung nicht-koronaler auditorischer Hirnstammschnitte des Hühnerembryos zur Untersuchung von tonotopischen Eigenschaften und Entwicklungsverläufen innerhalb einer Hirnstammscheibe. Diese Schnitte umfassen sagittale, horizontale und horizontale / transversale Abschnitte, die größere tonotopische Regionen innerhalb einer einzelnen Schichtebene umfassen als die traditionellen koronalen Abschnitte.

Schneiden des embryonalen Hühnerhirnstamms zur Bewertung tonotopischer Gradienten und Mikroschaltkreise

Lernen Sie die Präparation von Hühnchen-Hirnstammschnitten für physiologische Aufzeichnungen und langfristige Organotypkulturen. Diese Methode ermöglicht Studien zur neuronalen Entwicklung und auditorischen Verarbeitung.

Vorbereitung und Kultur von Chicken auditorischen Hirnstamm Slices

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