Subkutane Infektion von Methicillin-resistenten Staphylococcus Aureus (MRSA)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, das Überleben und die Ausbreitung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus oder MA sowie die Chemokin- und Zytokinspiegel an den Infektionsstellen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem das Fell vom Rücken der Mäuse entfernt wird, um einen klaren Beobachtungsbereich zu ermöglichen. Als zweiter Schritt.

MRSA in einer Suspension wird Mäusen drei Tage nach der Infektion subkutan verabreicht, Infektionspathologien und Bakterienzahlen können durch Bestimmung der Anzahl der koloniebildenden Einheiten aus Gewebehomogenaten auf Agarplatten beurteilt werden. Guten Tag, wie geht es dir? Mein Name ist De Lordon.

Ich bin Post-Researcher. Hallo, mein Name ist Mariel Sanchez. Ich bin Doktorandin Und ich bin Andrea Huda.

Ich bin wissenschaftlicher Mitarbeiter, wir sind Teil des Labors von George Lee in der pädiatrischen Abteilung des Cedar-Sinai Medical Center. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im medizinischen Bereich zu beantworten, wie z. B. die Modellierung schwerer Infektionen, einschließlich Myositis, Polymyositis und nekrotisierender Fasziitis. Obwohl diese Methode Aufschluss über schwere Notfallinfektionen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Streptokokken der Gruppe A und andere Organismen angewendet werden.

Darüber hinaus können wir die Funktion und Pathogenese anderer Organismen untersuchen, die Myositis und Polymyositis verursachen. Im Allgemeinen können Personen, die mit diesem Verfahren noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da einer der Mitarbeiter der globalen Regulierungsbehörde der Caucus-Bereiche sehr veränderlich ist. Wenn nicht vorsorglich vorgegangen wird, können die gesammelten Daten erhebliche Abweichungen aufweisen, was zu Schwierigkeiten bei der Interpretation der Daten führen wird.

Fangen wir an. Bereiten Sie in einer BSL two-Anlage eine Schafblut-Agarplatte auf TSA-Basis und eine sterile Schlaufe mit einem gefrorenen Block vor. Übertragen Sie die Mercer-Stammkultur aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.

Brechen Sie dann mit der sterilen Schlaufe einen kleinen Eissplitter aus der Stammkultur auf die Platte. Nachdem Sie einen kleinen Chip Mercer-Stammkultur erworben haben, stellen Sie die Stammkultur sofort wieder in den Gefrierschrank um, um ein Auftauen zu vermeiden, da wiederholtes Einfrieren und Auftauen die Stammkultur beschädigen kann. Verwenden Sie die Schlaufe, um den Agar zu streifen, um das Wachstum einzelner Mercer-Völker zu erleichtern.

Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius ohne CO2-Zugabe. Am nächsten Tag. Bereiten Sie sowohl ein neues Blattblut-Ei, eine TSA-Platte als auch ein 15-Milliliter-Schnappverschlussröhrchen mit drei Millilitern THB vor und etikettieren Sie es.

Entnehmen Sie die über Nacht kultivierte M SSA-Platte und untersuchen Sie den hämolytischen Phänotyp der Kolonien. Wählen Sie mit einer sterilen Schlaufe eine Kolonie aus, deren Phänotyp mit früheren experimentellen Kolonien übereinstimmt. Beimpfe den THB mit der ausgewählten Kolonie mit demselben Schlingenstreifen.

Die Platte inkubiert die THB-Lösung über Nacht bei 37 Grad Celsius und schüttelt mit 220 Umdrehungen pro Minute. Diese Bakterien werden in späteren Schritten verwendet, um die Kultur für eine subkutane Infektion der Mäuse zu impfen. Legen Sie die Blutagarplatte ebenfalls in den Inkubator.

Die Platte wird am nächsten Morgen verwendet, um zu bestätigen, dass der hämolytische Phänotyp der Bakterien in der THB-Lösung mit dem der ursprünglich ausgewählten Kolonie übereinstimmt. Wenn der Hämolyse-Phänotyp nicht mit dem ursprünglichen Klon übereinstimmt, starten Sie das Experiment nicht. Setze die Maus auf eine Plattform und rasiere ihr das Fell vom Rücken.

Wenn das Tier übermäßig aggressiv ist, kann eine Sedierung mit Fluor erforderlich sein. Tragen Sie etwa fünf Kubikmillimeter Haarentfernercreme wie NA auf die rasierte Stelle auf. NA kann in der örtlichen Drogerie gekauft werden.

Achten Sie darauf, die Haarentfernungscreme mit Babyöl zu kaufen, da das Produkt ohne Babyöl für die Mäuse zu stimulierend ist. Lassen Sie die Creme etwa eine Minute lang auf der Hautoberfläche inkubieren, während die Haarentfernercreme nach einer Minute einige Papiertücher mit doppelt destilliertem Wasser befeuchtt. Wischen Sie die rasierte Stelle mit den feuchten Papiertüchern sauber.

Stellen Sie sicher, dass die Haut frei von der Haarentfernungscreme ist, erwärmen Sie 10 Milliliter THB in einer 50-Milliliter-Schraubverschlusstube bei 37 Grad Celsius in einem Bakterieninkubator für vier bis 10 Stunden. Übertragen Sie 20 Mikroliter der Bakterienkultur über Nacht in das vorwarme THB. Dadurch wird der Söldner über Nacht verwässert.

Eine Federung von eins bis 500. Legen Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius bei 220 Umdrehungen pro Minute für etwa zweieinhalb bis drei Stunden nach der Inkubationszeit in einen Schüttelinkubator. Verwenden Sie mehr THB, um die Bakteriensuspension weiter auf eins bis 10 zu verdünnen, und messen Sie die Suspension mit einem Spektralphotometer.

Mit einer Saugfähigkeit von 514 Nanometern. Inkubieren Sie die Suspension bei 37 Grad Celsius und Schütteln mit 220 Umdrehungen pro Minute erneut, bis die ein- bis 10 verdünnte Suspension 0,25 erreicht. Um die M er Zentrifuge zu sammeln, das 50 Milliliter Röhrchen bei 3, 225-facher Schwerkraft für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, entsorgt man das Supinat-Resus.

Suspendieren Sie die Bakterienpalette in 10 Millilitern DPBS und waschen Sie die Bakterien erneut, indem Sie den Zentrifugationsschritt für dieses schwere Infektionsmodell wiederholen. Das Bakterienpellet wird in etwa einem Milliliter DPBS resuspendiert, was zu etwa 10 mal 10 bis 10 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter führt. Montieren Sie Schafsblut A-R-T-S-A-Platten, verdünnen Sie die Bakterien seriell von 10 auf das Eins- bis 10-fache auf das Achtfache in der DPBS-Platte.

10 Mikroliter der seriell verdünnten Bakteriensuspension in dreifacher Ausfertigung auf eine Blutagarplatte geben. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Platten 16 bis 18 Stunden lang inkubiert haben, beobachten und notieren Sie den Hämolyse-Phänotyp des Inokulars.

Zählen Sie die koloniebildenden Einheiten auf den Platten. Das Infektionsinokular wird auf der Grundlage der koloniebildenden Einheit berechnet. Nummer auf den Schildern.

Bereiten Sie eine Spritze mit 100 Mikrolitern der zuvor hergestellten Bakteriensuspension in DPBS vor. Vor der Injektion sollten Mäuse sediert werden, so dass ihre Atemfrequenz etwa einmal pro Sekunde beträgt. Zu Demonstrationszwecken wird in diesem Video eine euthanasierte Maus gezeigt.

Injizieren Sie den M ser nach der Injektion in eine Flanke. Bringen Sie die Maus zurück in ihren Käfig. Beobachten Sie die Tiere drei bis fünf Stunden nach der Injektion, um sicherzustellen, dass die Maus am Leben ist, bevor Sie sie zurück in den Tierraum bringen.

Überwachen Sie die Läsionen auf dem Rücken der Tiere täglich, nachdem die Tiere getötet wurden. Messen und notieren Sie die Größe und den Zustand der Läsionen auf der Haut. Sowohl Haut- als auch Muskelläsionsbereiche werden quantifiziert, indem die Länge und Breite der Läsion in Millimetern multipliziert wird.

Unregelmäßig geformte Läsionen müssen in kleinere symmetrische Stücke zerlegt und jedes Stück mit der gleichen Methode gemessen werden. Bereiten Sie 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern DPBS für die Gewebeentnahme vor. Schneiden Sie die Haut mit einer sterilen Rasierklinge ein und entfernen Sie die Läsion mit einer sterilen Schere.

Achten Sie bei der Entfernung der Läsion darauf, dass etwa zwei bis fünf Millimeter gesunder Haut, die den Bereich umgibt, ebenfalls herausgeschnitten werden. Legen Sie die Läsion in die Gewebeentnahmeröhrchen, um die Muskelläsionen zu analysieren. Ziehen Sie die Haut vorsichtig ab, um die Größe zu messen und den Zustand der Läsion am Muskelgewebe zu erfassen.

Sammeln Sie die Milz und die Nieren. Legen Sie diese Gewebe in ihre eigenen individuellen Entnahmeröhrchen. Homogenisieren Sie das Gewebe, indem Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze etwa 30 Sekunden lang rühren.

Geben Sie 900 Mikroliter DPBS in jedes Röhrchen. Montieren Sie die THA-Platten und wirbeln Sie die homogenisierten Gewebeproben fünf Minuten lang durch. Verdünnen Sie die Probe seriell.

Suspensionen tendieren zum Eins-zu-10- bis zum Sechsfachen. In 96 Well-Platten werden 10 Mikroliter jeder seriell verdünnten Suspension auf die Platten abgegeben. Inkubieren Sie die Platten über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Bakterien-Inkubator.

Zählen Sie am nächsten Morgen die koloniebildenden Einheiten von den Platten und berechnen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten anhand der Verdünnungsfaktoren. Wenn die Infektion korrekt durchgeführt wird, wird unmittelbar nach der subkutanen Injektion eine Blase auf der Hautoberfläche beobachtet. Wenn keine Blase beobachtet wird, kann die Injektion zu tief sein, was den Ausgang der Infektion beeinträchtigen kann.

Die Größe der Läsion und das Überleben der Bakterien können zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion mit MSA beurteilt werden. Die folgenden Hautläsionen wurden am dritten Tag nach der Infektion untersucht und sind Beispiele für eine Läsion auf einer CD, eine Maus infiziert an einer Flanke mit einer mal 10 auf die sieben koloniebildenden Einheiten. Muskelläsionen befinden sich typischerweise im Gewebe unterhalb der Hautläsionen.

Im Folgenden finden Sie Beispiele für die übereinstimmenden Muskeloberflächenläsionen für die zuvor gezeigten Hautläsionsfotos. Dies sind Muskelläsionen, die am dritten Tag nach der Infektion bei einer Maus beobachtet wurden, die mit einer mal 10 bis sieben koloniebildenden Einheiten infiziert war. Die Läsionsfläche wird als Länge mal Breite der Läsion bestimmt, gemessen in Millimetern, und kann gemessen werden, um die Gewebeschädigung der Haut zu beurteilen.

Die koloniebildende Einheitszahl der an der Infektionsstelle lokalisierten Bakterien kann anhand von Excise-Läsionen quantifiziert werden. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten kann Aufschluss darüber geben, ob ein Virulenzfaktor dem MSA einen Überlebensvorteil verschafft. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Standard-Sicherheitsvorkehrungen aufgrund der Verwendung von Nadeln und hochpathogenen Mikroben nach diesem Verfahren zu treffen.

Da das Abszessmodell, das wir verwenden, einen 1.000-fach niedrigeren Inokular im Vergleich zu unserem Modell verwendet, kann es verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. was sind die S-Faktoren, die eine anhaltende RSA-Infektion begünstigen? Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einer Spritze, die mit einem Mars A gefüllt ist, äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Entsorgen der Spritze direkt in der Spitze wichtig sind, um ein versehentliches Stechen durch die Nadel zu vermeiden. Außerdem ist es für dieses Experiment wichtig, ein Standard-BS O2-Protokoll zu befolgen, um eine ordnungsgemäße Desinfektion des Arbeitsbereichs zu gewährleisten.

Das war's also. Danke fürs Zuschauen. Hallo, auf Wiedersehen.