Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mit dem Hitzeschock-Methode

Hallo, ich bin Alex Hoge. Ich arbeite im Gym Hall Lab in der Abteilung für Physiologie und Biophysik an der University of California Irvine. Heute zeige ich Ihnen, wie man elektrisch kompetente E. coli mittels Elektroporation transformiert.

Heute verwende ich diese Technik, um ein coli mit meinem Lationsprodukt zu transformieren, da ich einen Prob durchführe, um eine Ganzpräparat-Färbung bei Zebrafischen durchzuführen. Okay, wir werden nun mit der Transformation beginnen. Zunächst benötigen Sie ein Wasserbad oder einen Trockenblock bei 42 Grad.

Sie müssen Ihre Bakterien, die Sie gerade aus der Hauptkultur entnommen haben, auf Eis lagern. Heute verwenden wir elektrokompetente Zellen von ities sowie Ihre DNA auf Eis. Außerdem benötigen Sie ein Gefäß mit SOC-Medium bei Raumtemperatur oder 37 °C und Ihre Platten mit LB-Plus-Antibiotikum-Medium.

Jetzt füge ich die DNA zu den Bakterien hinzu. Ich arbeite dabei neben der Flamme, um die Bakterien nicht zu kontaminieren. Also gebe ich die DNA zusammen mit den Bakterien hinzu.

Es sind 50 Mikroliter Bakterien, danach sofort zurück auf Eis; Sie können es leicht anstoßen, um die Bakterien und Ihre DNA zu mischen, und lassen es bis zu 15 Minuten auf Eis stehen. Nun sind 15 Minuten vergangen, und wir sind bereit, den Hitzeschock durchzuführen, bei dem die Bakterien 45 Sekunden lang 42 Grad Celsius ausgesetzt werden. Ich nehme die Röhrchen also aus dem Eis, gebe sie direkt in den 42-Grad-Block, stelle den Timer auf 30 und starte die 45-Sekunden-Zeit, danach lege ich sie sehr schnell wieder zurück auf Eis, direkt vom 42-Grad-Block auf Eis.

Und dann warten wir zwei Minuten. Nun werde ich das SOC-Medium zu den Bakterien hinzufügen und sie 30 Minuten lang bei 37 °C inkubieren. Dazu pipettiere ich 500 µL des SOC-Mediums und gebe es zu den Bakterien, anschließend stelle ich sie in meine kleine provisorische Kammer.

Wenn Sie also Eppendorfgefäße und eine provisorische Kammer für Ihren Inkubator verwenden, stellen Sie sicher, dass Sie die Eppendorfgefäße horizontal platzieren, da sie sich dann viel besser schütteln lassen. Nun sind wir bereit, die Gefäße in den Schüttler zu geben, damit sie 30 Minuten lang in dieser kleinen Kammer bei 37 Grad inkubiert werden.

Jetzt haben wir die Inkubation bei 37 Grad abgeschlossen und werden die Bakterien auf LB-Platten mit Antibiotika ausplattieren. In meinem Fall ist es Chloramphenicol. Dazu pipettieren wir jeweils 50 Mikroliter jeder Probe auf die Platte.

Mit den verbleibenden 500 Mikroliter zentrifugieren Sie sie in einem kleinen Tischzentrifugengerät, um die Bakterien zu pelletieren. Nach der Zentrifugation erhalten wir ein schönes Pellet, und nun werden wir fast das gesamte SOC-Medium entfernen, lediglich 50 Mikroliter stehen lassen und dann diese 50 Mikroliter konzentrierter Bakterien auf eine Platte auftragen. Ich habe also etwa 450 Mikroliter abpipettiert.

Ich lasse gerade diese Menge stehen. Nun werde ich das Pellet in den verbleibenden 50 Mikrolitern SOC-Medium resuspendieren. Danach kann ich diese 50 Mikroliter auf eine weitere Platte auftragen.

Ich resistentiere also jede Palette, dann puppette ich sie und plattiere sie. Am Ende wird es also zwei Platten pro Probe geben. Nun müssen wir die Bakterien auf die LB-Platte ausstreichen.

Ich werde also einige Autoklav-Glaskügelchen verwenden, aber Sie können auch einen Pipettenstil verwenden, den Sie zu einem Verteiler in dieser Form biegen. Ich gebe nun einige Kügelchen auf die Petrischale. Das gefällt mir.

Nun, 10 15. Nachdem Sie die Kügelchen hinzugefügt haben, stapeln Sie alle Ihre Platten derart und schütteln sie vorsichtig, damit sich die Kügelchen gleichmäßig auf den Platten verteilen und die Bakterien überall gleichmäßig verteilen. Während ich die Platten bewege, bis sie trocken sind.

Das bedeutet, dass Sie beim Bewegen der Perlen keine großen Flüssigkeitsstreifen sehen sollten. Zum Beispiel neigen auf dieser Platte die Perlen dazu, zusammenzufallen, und es sind viele Streifen sichtbar. Diese hier ist verschwitzt, die Perlen bewegen sich frei; jene ist trocken.

Jetzt sind die Platten trocken, sodass wir die Perlen entsorgen können. Ich ziehe sie einfach so ab, damit Sie sie wiederverwenden können. Nun werden wir die Platte über Nacht bei 37 °C in den Inkubator stellen. Nach 12-stündiger Inkubation bei 37 °C nehmen wir die Platte aus dem Inkubator, wobei Sie die Platten nach dieser Zeit auf den Kopf stellen.

Und wie wir sehen können, haben wir weniger Kolonien auf der Platte, auf die ich 50 Mikroliter pipettiert habe, im Vergleich zu der Platte, auf die der Rest aufgebracht wurde. Wichtig bei der Transformation von Bakterien ist es, die richtige Anzahl an Kolonien auf der Platte zu haben, also die richtige Dichte. Hier haben Sie sehr wenige Kolonien; wenn Sie jedoch mehr Kolonien benötigen, finden Sie ein gutes Beispiel auf dieser Platte, auf der die Dichte genau richtig ist – etwa 100 Kolonien pro Platte.

Diese Platte ist ein schlechtes Beispiel, da sich zu viele Kolonien befinden und man keine einzelnen Kolonien auswählen kann. Ich habe Ihnen also gerade gezeigt, wie man E. coli mittels jeweiliger Transformation transformiert. Ein sehr wichtiger Aspekt dieser Technik besteht darin, alles vor dem Schock eiskalt zu halten.

Dann 45 Sekunden normal, anschließend länger bei 42 Grad zurück auf Eis. Danach muss alles andere bei warmer Temperatur oder 37 Grad erfolgen. Nun werde ich meine Kolonien mittels PCR-Analyse auswerten.

Ein weiterer Punkt besteht also darin, zwei Platten zu verwenden. Auf einer erwarten wir viele Kolonien, auf der anderen weniger Kolonien. Wichtig ist, dass Ihre Platten mit Hilfe von Kügelchen oder dem Pipettenstrich sehr trocken sind.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrer Bestätigung.