Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mit dem Hitzeschock-Methode

Hallo, ich bin Alex Hoge. Ich arbeite im Fitnessstudio Hall Lab in der Abteilung für Physiologie und Biophysik an der University of California Irvine. Und heute zeige ich Ihnen, wie Sie elektrisch kompetente E-Coli nach der Methode jedes Schocks transformieren können.

Heute verwende ich diese Technik, um einen Coli mit meinem Lationsprodukt zu transformieren, weil ich ein Problem mache, um eine ganze Montage im Zebrafisch durchzuführen. Okay, wir werden also mit der Transformation beginnen. Zuerst müssen Sie also Ihr Wasserbad oder Ihren Trockenbus bei 42 Grad haben.

Du musst deine Bakterien, die du gerade aus der Hauptstadt geholt hast, in Eis haben. Heute verwenden wir elektrische Kompetenzzellen aus Itäten und auch Ihre DNA im Eis. Außerdem benötigen Sie eine Tube mit SOC-Medien bei Heimtemperatur oder 37 und Ihre Platten mit LV plus antibiotischen Medien.

Jetzt füge ich die DNA mit den Bakterien hinzu. Also arbeite ich neben der Flamme, um die Bakterien nicht zu kontaminieren. Also füge ich mit den Bakterien eine Verbindung hinzu.

Es sind 50 Mikroliter Bakterien und dann sofort wieder im Eis, man kann es ein wenig schnippen, um die Bakterien und die DNA zu vermischen, und man lässt es bis zu 15 Minuten im Eis. Jetzt sind also 15 Minuten vergangen und wir sind bereit für den Hitzeschock, bei dem die Bakterien 45 Sekunden lang auf 42 Grad gebracht werden. Also nehme ich die Röhren direkt bei 42 Grad eingestellt, 30 Timer 45 Sekunden, und dann lege ich sie sehr schnell wieder ins Eis und lege sie aus 42 direkt auf Eis.

Und dann warten wir zwei Minuten. Jetzt füge ich den Bakterien das SOC-Medium hinzu und setze sie 30 Minuten lang auf 37. Also verdampfe ich 500 Mikroliter des SOC-Mediums und gebe es in die Bakterien und lege sie in meine kleine provisorische Kammer.

Wenn Sie also Eend-Röhren und provisorische Kammern für Ihren Inkubator verwenden, stellen Sie sicher, dass Sie Ihre Eend-Röhren horizontal aufstellen, da sie so viel besser schütteln. Jetzt sind wir also bereit, die Röhrchen in den Shaker zu legen. Deshalb haben wir diese kleine Kammer 30 Minuten lang bei 37 Grad.

Jetzt haben wir die Inkubation bei 37 Grad beendet und werden die Bakterien auf Pfund plus Antibiotika plattieren. In meinem Fall ist es also Chloral. Also bei I 50 Mikroliter von jeder Probe und legen Sie sie auf die Platte.

Also mit den restlichen 500 Mikrolitern schleudert man sie in einer kleinen Tischplatte herunter, etwas Müll, um es mit den Bakterien zu schälen. Nach der Ifizierung erhalten wir also ein schönes Pellet und was wir jetzt tun werden, ist, fast alle SOC-Medien zu entfernen, lassen Sie einfach 50 Mikroliter übrig und dann können wir diese 50 Mikroliter konzentrierter Bakterien plattieren. Also zahle ich bezahlt ca. 450 Mikroliter raus.

Ich lasse einfach so viel übrig. Jetzt werde ich die Palette in den 50 Mikrolitern links des SOC-Mediums aufhängen. Und danach kann ich diese 50 Mikroliter auf eine andere Platte plattieren.

Also widerstehe ich jeder Palette, dann maroniere ich sie und richte sie an. Es werden also am Ende zwei Platten pro Probe stehen. Jetzt müssen wir also die Bakterien auf die LB-Platte verteilen.

Ich werde also ein paar Autoklaven-Glasperlen verwenden, aber man kann auch eine Rohrpasta verwenden, die man so zu einem Spreizer formt. Also werde ich ein paar Perlen auf die Petrischale geben. Ich mag das.

Nun, 10 15. Nachdem Sie also die Perlen hinzugefügt haben, legen Sie alle Ihre Teller auf einen solchen Stapel und schütteln sie vorsichtig, damit die Kügelchen die Bakterien überall gleichmäßig auf den Platten verteilen. Also, während ich die Platten bewege, bis sie trocken sind.

Das bedeutet, dass Sie keine großen Flüssigkeitsstreifen sehen sollten, wenn Sie sich mit den Perlen bewegen. In dieser Platte neigen die Perlen zum Beispiel dazu, zusammen zu kollabieren und viele Schlieren zu sehen. Es ist Schweiß, der eine, die Perlen bewegen sich frei, der ist trocken.

Jetzt sind die Platten trocken, so dass wir die Perlen entsorgen können. Also gehe ich einfach so, damit man sie recyceln kann. Jetzt legen wir die Platte über Nacht bei 37 in den Inkubator, und Sie stellen die Platten nach 12 Stunden Inkubation bei 37 auf den Kopf, wir holen die Platte aus dem Inkubator.

Und wie wir sehen können, haben wir weniger Kolonien in der Platte, auf der ich 50 Mikroliter plattiere, als in der Platte, auf der ich den Rest platiert habe. Wichtig bei der Umwandlung von Bakterien ist, dass Sie die richtige Menge an Kolonien auf Ihrem Teller haben, die richtige Dichte. An diesem Ort gibt es also nur sehr wenige Völker, aber wenn man mehr Völker haben möchte, kann man das gute Beispiel in dieser Platte haben, wo es genau die richtige Dichte hat, ungefähr 100 Völker pro Platte.

Diese Platte ist ein schlechtes Beispiel, da es zu viele Völker gibt und man sich keine einzelnen Völker herauspicken kann. Also habe ich Ihnen gerade gezeigt, wie man E-Coli durch jede Transformation transformiert. Der sehr wichtige Aspekt dieser Technik ist also, vor dem Schock alles eiskalt zu halten.

Dann 45 Sekunden normal, eher bei 42 Grad zurück im Eis. Und dann muss alles andere eine warme Temperatur oder 37 Grad haben. Jetzt werde ich meine Völker durch PCR-Screening screenen.

Es geht also auch darum, zwei Platten zu haben. Wir erwarten also, dass wir viele Kolonien haben werden und diese eine weniger Kolonien. Und was wichtig ist, ist, dass Ihre Platten mit der Verwendung von Perlen oder dem Rohr vorbei sehr trocken sind.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück mit Ihrer Bestätigung.