Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den viralen Tropismus bei einem HIV-infizierten Patienten abzuleiten, indem die V-3-Region des viralen Hüllgens sequenziert wird, um mit der Extraktion von H-I-V-R-N-A aus dem Blutplasma des Patienten zu beginnen. Amplifizieren Sie als Nächstes die V-3-Region von HIV GP one 20 mit dem verschachtelten R-T-P-C-R. Identifizieren Sie dann das Vorhandensein des Produkts mithilfe der Gelelektrophorese, gefolgt von einer populationsbasierten Sequenzierung der amplifizierten V 3-Produkte.

Analysieren Sie schließlich die Sequenzen mit Hilfe der Base-Calling-Software und leiten Sie die Co-Rezeptor-Nutzung mit dem Genom-zu-Phäno-Algorithmus ab. Letztendlich können diese Ergebnisse durch populationsbasierte Sequenzierung der HIVV-3-Schleife zeigen, ob die Virustruppe eines Patienten R fünf oder nicht R fünf ist. Der Hauptvorteil dieser Technik ist also ein Troop-Assay gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. phänotypischen zellbasierten Assays, besteht darin, dass er in jedem Labor durchgeführt werden kann, das mit Sequenziergeräten ausgestattet ist, um die Kosten in kürzerer Zeit und mit weniger Ausgangsmaterial zu senken.

Diese Technik ist für die Behandlung mit antiretroviraler Therapie relevant, da sie feststellen kann, ob die Viruspopulation eines Patienten wahrscheinlich auf einen CCR-Fünf-Antagonisten aus 500 Mikrolitern Plasma anspricht. Verwenden Sie einen einfachen automatischen Extraktor, um H-I-V-R-N-A zu extrahieren. Begeben Sie sich nun in einen PCR-Reinraum, um das R-T-P-C-R einzurichten und eine angemessene Probenahme der Viruspopulation zu gewährleisten.

Planen Sie, jede reverse Transkriptionsreaktion in dreifacher Ausführung in dieser einstufigen Reaktion durchzuführen. Verwenden Sie virale RNA zur Synthese von CDNA, wobei die HIVV-3-Region spezifisch mit der SQV-3-F1- und CO 6 0 2-Prime-Reparatur amplifiziert wird. Basierend auf den Komponenten pro Reaktion.

Stellen Sie mit einer Repeater-Pipette eine Stammmischlösung her, die für die Anzahl der zu amplifizierenden Proben ausreicht. Geben Sie 36 Mikroliter Probenmischung in jede Vertiefung der PCR-Platte. Wechseln Sie nun zu einer Mehrkanalpipette, um Mikroliter RNA-Probenextrakt in jede der dafür vorgesehenen Vertiefungen umzuwandeln. Achten Sie darauf, die Trinkgelder zwischen den einzelnen Zusätzen zu wechseln.

Sobald der Transfer abgeschlossen ist, decken Sie die Vertiefungen mit PCR-Streifenkappen ab. Legen Sie dann die PCR-Platte in einen Thermocycler, der für ein einstufiges R-T-P-C-R der HIVV-Drei-Region programmiert ist. Verwenden Sie für die Nested PCR die SQV drei F zwei und CD vier R Primer Repair.

Berechnen Sie die Reagenzmenge, die für die Anzahl der Proben erforderlich ist, die in einem PCR-Reinraum amplifiziert werden sollen. Generieren Sie die verschachtelte PCR-Mischung und verwenden Sie dann eine Repeaterpipette, um 19 Mikroliter pro Vertiefung einer sauberen PCR-Platte zu aliquotieren. Nach Fertigstellung des R-T-P-C-R begeben Sie sich in einen Post-Amplifikationsraum.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette mit acht Kanälen, um einen Mikroliter des R-T-P-C-R-Templates in den verschachtelten PCR-Mix zu übertragen. Ändere die Spitzen zwischen den einzelnen Ergänzungen. Decken Sie die Wells mit PCR-Streifenkappen ab und geben Sie die Platte zur Amplifikation in einen Thermocycler.

Nehmen Sie die Platte aus dem Thermocycler, nachdem die Temperatur wieder auf 25 Grad Celsius gesunken ist. Um zu bestätigen, dass die V-3-Region erfolgreich amplifiziert wurde, analysieren Sie zunächst die Produkte mittels Gelelektrophorese. Bereiten Sie ein 1,6%iges AROS-Gel mit cybersicherer Gelfärbung vor.

Mit einer 10-Mikroliter-Mehrkanalpipette. Übertragen Sie acht Mikroliter-PCR-Proben in die entsprechenden Wells. Laden Sie außerdem eine DNA-Leiter zu mindestens einer Vertiefung pro Reihe.

Lassen Sie das Gel 10 Minuten lang bei etwa 100 Volt laufen. Visualisieren Sie Banden durch ultraviolette Fluoreszenz und dokumentieren Sie das Bild durch Fotografie. Notieren Sie sich die Proben, bei denen alle dreifachen Amplifikationen erfolgreich waren.

Falls erforderlich, R-T-P-C-R für Proben mit weniger als drei Produktamplifikationen wiederholen. Die amplifizierten viralen CDNA-Proben werden durch DNA-Sequenzierung weiter verifiziert: Reaktionen werden unter Verwendung der V 3, 0, 2 F und S QV, drei R one Primer durchgeführt. Nehmen Sie das Big Di-Reagenz aus dem Gefrierschrank und tauen Sie es bei Raumtemperatur auf.

Berechnen und bereiten Sie die Reagenzien vor, die für die Anzahl der zu fahrenden Proben erforderlich sind. Aliquotieren Sie fünf Mikroliter der Sequenzierungsreaktionsmischung mit einer Mehrkanalpipette in die entsprechenden Plattenvertiefungen. Decken Sie den Teller mit einem Kim-Tuch ab und legen Sie es beiseite.

Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Verdünnung des amplifizierten PCR-Produkts von 1 bis 15 vor, indem Sie dem restlichen PCR-Produkt 180 Mikroliter steriles Wasser hinzufügen. Pipettieren Sie einen Mikroliter der verdünnten Probe auf den Boden der entsprechenden Platte. Die Vertiefungen wechseln die Spitzen immer zwischen den Proben, wenn der Probentransfer abgeschlossen ist.

Verschließen Sie die Platte mit Streifenkappen und wirbeln Sie sie eine Sekunde lang ein. Um die Platte zu zentrifugieren, stellen Sie die Geschwindigkeit auf 140 5G ein. Wenn die Schleudergeschwindigkeit 140 5G erreicht, stoppen Sie den Spin.

Legen Sie die Platte in einen Thermocycler, damit die Reaktion fortgesetzt werden kann. In jeder Vertiefung die DNA mit vier Mikrolitern drei molaren Natriumacetat und 40 Mikrolitern gekühltem 95%igem Ethanol ausfällen und die Verschlüsse wieder verschließen. Drehen Sie die Platte 10 Sekunden lang mit dem Kortex und klopfen Sie auf die Platte, um alle Luftblasen zu entfernen.

Stellen Sie die Teller zwischen 30 Minuten und zwei Stunden bei minus 20 Grad Celsius auf. Die DNA wird durch Zentrifugation bei 2000 g für 20 Minuten gewonnen. Entfernen und entsorgen Sie die Streifenkappen.

Drehen Sie die Platte über den Abfallbehälter und dekantieren Sie das Super Natin. Befreien Sie sich von restlichem Super Natin. Indem Sie die umgedrehten Platten auf einem Papiertuch abtupfen.

Falten Sie zwei Blätter eines Papiertuchs, um den Teller zu belegen. Legen Sie die Platte mit der Vorderseite nach unten in die Zentrifuge und drehen Sie sie bei 140 5 G. Stoppen Sie den Spin, wenn er 140 5G erreicht.

Anschließend mit 155 Mikrolitern 95%igem Ethanol waschen und dekantieren. Wiederholen Sie dann die Zentrifugation. Lassen Sie die Platte zwei bis fünf Minuten ruhen, damit das letzte Ethanol verdampfen kann.

Um die DNA-Proben zu denaturieren, verteilen Sie mit einer Mehrkanalpipette 10 Mikroliter Farbstoff für Maide in alle Vertiefungen auf der Platte, auch in die leeren. Verschließen Sie die Platte mit einer Septima und legen Sie sie für zwei Minuten bei 90 Grad Celsius in einen Thermocycler. Legen Sie abschließend die Probenplatte in eine Sequenzierplatte und in den Sequenzierer.

Ein akzeptabler Weg zur Datenanalyse ist die Verwendung des Software-Recalls, um automatische Base-Calls ohne menschliches Eingreifen durchzuführen. Recall ist eine kostenlose, benutzerdefinierte Anrufsoftware: Melden Sie sich an und wählen Sie Beispieldateien aus, die Sie mit der Option "Durchsuchen" hochladen möchten. Suchen Sie die Rohsequenzierungsdatendatei, und laden Sie bis zu 20 Megabyte hoch.

Stellen Sie als Nächstes die Referenzsequenz auf V drei ein. Klicken Sie auf Daten verarbeiten. Wählen Sie den resultierenden Ordner auf der rechten Seite der Seite aus, um die Liste der Beispiele anzuzeigen.

Diejenigen, die rot sind, sind gescheitert. Diejenigen, die grün sind, sind vorbei. Wenn Sie auf ein bestimmtes Beispiel und die Schaltfläche "Ansicht" klicken, können Sie die Sequenz überprüfen, den Anweisungen auf der rechten Seite der Seite folgen, um durch die Sequenz zu navigieren, und Dateien in einen Zip-Ordner herunterladen.

Viraler Tropismus kann aus Sequenzen abgeleitet werden, die durch populationsbasierte Sequenzierung unter Verwendung des Geno-zu-Phäno-Co-Rezeptor-Algorithmus erzeugt wurden. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü der signifikanten Einstellung die auf der Analyse klinischer Daten basierende Optimierung aus motivieren 2 % und 5,75 % FPR aus. Wählen Sie nun, ob Sie eine Sequenz für die Analyse hochladen oder einfügen möchten.

FASTA-Dateien sind akzeptabel. Fügen Sie kein anderes Verfahren hinzu, um einen geno Tono FPRA Prädiktor für die Reaktionsfähigkeit auf CCR fünf Antagonisten zu erhalten. Der generierte G zwei P-Bericht liefert die V-Drei-Schleifen-Sequenz in Aminosäuren und zeigt relevante Positionen von Mutationen an, die mit Nicht-R-Fünf-Viren assoziiert sind.

Am Ende des Berichts wird die Falsch-Positiv-Rate angegeben und in Bezug auf die Reaktion auf einen CCR-Fünf-Antagonisten interpretiert. Dieser Bericht kann als PDF-Datei heruntergeladen werden. Wenn eine der drei Sequenzen aus einer Probe als nicht R fünf abgeleitet wird, ist es unwahrscheinlich, dass der Patient wie erwartet auf einen CCR-Fünf-Antagonisten anspricht. Die Gelelektrophorese von RTP CR Amplifikationen der HIV eins V drei Schleife deutet darauf hin, dass nicht alle klinischen Proben ein Produkt produzieren.

Die aus den amplifizierten Proben generierten Sequenzen können in einem durch Abruf ausgelesenen Chromatogramm visualisiert werden. Es wird ein sauberer Ablauf mit wenigen Mischungen erwartet. Gelegentlich können Sequenzen unübersichtlich sein und eine genaue Basiszuweisung nicht ermöglichen.

Bei einigen Patienten kann festgestellt werden, dass sie ein Nicht-CCR-Fünf-Virus haben, wie hier gezeigt. Es ist unwahrscheinlich, dass diese Patienten auf die Behandlung mit einem CCR-Fünf-Antagonisten ansprechen. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Mehrheit der Patienten eine Viruspopulation aufweist, die aus CCR 5-Viren besteht, wie durch ein grünes Kästchen am unteren Rand des G two P-Analyseberichts angezeigt wird.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa vier Tagen von Anfang bis Ende durchgeführt werden. Das ist von der Extraktion bis zur Analyse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie viralen Tropismus mit populationsbasierten Sequenzierungsmethoden in Verbindung mit dem bioinformatischen Genom-Phänoinformatik-Algorithmus vorhersagen können.

In Ordnung, das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.