Name: Passive Verwaltung von monoklonalen Antikörpern gegen H. capsulatum Ua Pilzpathogene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Erfahren Sie die passive Verwaltung monoklonaler Antikörper gegen Histoplasma capsulatum bei C57BL/6-Mäusen. Diese Methode untersucht den Schutz durch humorale Immunität und die Reduktion der Pilzlast in vivo.

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1. Wachstum von H. Capsulatum <ol><li> Bereiten Sie eine Biosicherheitswerkbank für die Arbeit mit dem Pilz durch die Reinigung der Schrank mit 10% Bleichmittel durch 20 min UV-Bestrahlung gefolgt. H. capsulatum in der Hefe Phase erfordert Biosafety Level (BSL) II Praktiken, während die Form Form erfordert BSLIII. Verwenden Sie Hefe Form in den folgenden Schritten. </li><li> Nächste bereiten ein 15 ml konische Röhrchen mit 5 ml PBS. Ernte eine Kolonie von H. capsulatum (Stamm ATCC Hc G217B) aus einer BHI Blutagarplatte [Glucose 10 g / L, Cystein 0,1 g / L, Penicillin-Streptomycin 1% und rote Blutzellen von Schafen 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, USA) ] bei 37 ° C kultiviert oder einen aliquoten aus gefrorenen Hefe Lager bei -80 ° C und fügen Sie sie der PBS. Vortex die Zellen kräftig und Zentrifuge für 1100 xg für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet und fügen 10 mL frisches PBS. Wiederholen Sie diese Prozedur dreimal. Die Zellen in 5 ml PBS und Transfer zu einem 50 mL konischen Rohr. </li><li> Zu stören aggregierten Zellen, vorbei an der Hefezelle Suspension durch eine 26 G1 / 2 Nadel u singen ein 10 mL Spritze 5 Mal in einer Biosicherheitswerkbank (mit Gesichtsschutz). Zur Isolierung kleine, gleichmäßig Größe Hefe, Zentrifuge die Zellen bei 55 xg für 1 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie dann die Besten 1 ml. </li><li> Fügen Sie die Zellsuspension auf eine sterile Erlenmeyerkolben mit 100 ml HAM F12-Medium (Gibco) mit 16g / l Glucose, 1 g / L Glutaminsäure, 8.4mg / L Cystin, 6g / L Glutaminsäure und dann wachsen die Zellen bei 37 ergänzt ° C für 48 h in einem Inkubator mit 150rpm geschüttelt. </li></ol> 2. Hybridoma Wachstum und Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern <ol><li> Übertragen Sie die ausgewählten Hybridome auf DMEM-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 10% NCTC, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren und 1% Penicillin-Streptomycin. Wachsen die Zellen in einer Zellkulturflasche (Becton Dickenson) für 5-7 Tage bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Dann Zentrifuge das Medium bei 1100 xg für 10 min bei Raumtemperatur und sammeln Sie alle Überstand ohne Störung des Pellets. </li><li> Anschließend reinigen die zellfreie Überstand mit einem Protein A / G Harz durch FPLC. </li><li> Der mAk-Konzentration kann dann durch einen ELISA (1) mit einem IgG Isotyp-Kontrolle als Standard (Abbildung 1B) berechnet werden. </li></ol> 3. Histoplasma capsulatum Inokulum Vorbereitung <ol><li> Nehmen Sie einen 48 h Histoplasma capsulatum (Stamm ATCC Hc G217B) Hefephase Kultur in HAM F-12-Medium. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1100 xg für 10 min. Überstand verwerfen und fügen Sie frisches PBS. </li><li> Wiederholen Sie die 3,2 Prozedur 3 mal. </li><li> Pass the Hefezellensuspension 5 mal durch eine 26G1 / 2 Nadel mit einer Spritze. </li><li> Die Suspension bei 55 xg für 1 min auf Pellet verbleibende Zellhaufen. Übertragen Sie den Überstand mit dem einzigen Zellsuspension in ein neues Röhrchen. </li><li> Auflisten der einzelnen Zell-Suspension mit einer Zählkammer. </li><li> Passen Sie die Zellkonzentration um 1,25 x 10 7 Hefe (Überleben) oder 5,0 x 10 6 (CFU, Zytokine und Histologie) in einer Aufschwemmung von &lt;50 ul (Abbildung 2) zu erreichen. </li></ol> 4. Intraperitoneale Verabreichung der MAbs <ol><li> Pick-up mit der Maus am Schwanz und Kragen (Abb. 3A). Immobilisierung der Maus durch das Genick des Halses so nah wie möglich theears (achten Sie darauf, nehmen Sie genügend Haut, so dass die Maus den Kopf cannotturn auf der Bearbeiter beißen; 3B und 3C). </li><li> Stabilisieren Sie den Schwanz withthe kleinen Finger leicht gegen die Handfläche (Abbildung 3D) gedrückt. </li><li> Swab die Injektion mit 70% Ethanol, bevor Sie die Nadel und absaugen, um das Blut vor der Injektion zu suchen. </li><li> Verwenden Sie die 26G1 / 2 auf Haut und abdominalmuscles piercethe der mAb-Lösung enthält 500μg (PBS, Isotypkontrollantikörper oder mAb zu prüfenden verdünnt in 1 mL PBS) in thelower linken oder unteren rechten Unterbauch (Bauchhöhle) zu injizieren, mit das Tier in den Kopf Position, kümmert sich um die Membran andother inneren Organe (Abbildung 3E) zu vermeiden. </li><li> Warten Sie kurz vor dem Rückzug der needleto reduzieren die Wahrscheinlichkeit von Leckagen. </li><li> Warten Sie mindestens zwei Stunden, bevor Sie den nächsten Schritt. </li></ol> 5. Maus Anästhesie und intranasale Infektionen <ol><li> Bereiten Sie die Betäubung mit Ketamin und Xylazin bei 100 mg / kg und 10 mg / kg. Führen intraperitoneale Verabreichung von PBS, Isotypkontrollantikörper oder experimentellen Antikörper wie in der beiliegenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Warten Sie zwei Stunden nach der Injektion mAb vor betäuben die Maus und die Sie mit der intranasalen Infektion. Bereiten Anästhesie mit Ketamin und Xylazin bei 100 mg / kg und 10 mg / kg (7). </li><li> Während der 2h Wartezeit, bereiten die Histoplasma capsulum Inokulum wie in den begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben. </li><li> Gehen Sie nach der itens 5,1 bis 5,5. Toe Prise die Tiere mit einer Pinzette und das Fehlen des Reflexes überprüfen und zu bestätigen, dass die Anästhesie gearbeitet. Nach Betäubung, sanft setzt die Maus durch seine Vorderzähne zu einer Nylon oder Baumwolle String. Verwenden Sie 2-Säule steht, um die Saiten binden, um die Tiere auszusetzen. </li><li> Langsam verwalten rund 50 ul Inokulum in eine nare mit einer Mikropipette, während eine sorgfältige Überwachung der Maus Atemfrequenz. Lassen Sie die Maus, um in dieser Position für 2-5 min nach intranasaler Infektion Rest der Abscheidung der Hefe in das Tier die Lunge (Abb. 3F) zu erleichtern. </li><li> Nach der Maus infiziert wurde, halten Sie die Maustaste in einem überwachten, warme Umgebung (Temperatur zwischen 25 und 37 ° C), sorgfältig unter Verwendung einer Wärmelampe, wenn nötig, bis er aus der Narkose erholt. Wenn die Maus erwacht, schicken Sie es an einem sauberen Käfig mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Käfige sind für unsere Tier-Anlage zurück und hielt in einem sauberen Tierraum (BLSI). </li></ol> 6. Survival-Studies <ol><li> Beurteilen infiziert und mock-infizierten Tieren klinisch Tachypnoe, Lethargie, Abgestumpftheit, und Gewichtsverlust. Die Tiere sollten zweimal täglich im Labor Mitglieder und täglich von Tierpflegern überprüft werden. </li><li> Mit der Maus Histoplasmose, bis nahe an das Ende des Lebens, gibt es normalerweise keine offensichtlichen Anzeichen der Infektion andere als ein leichter Anstieg in der Atemfrequenz. Mit fortgeschrittener Erkrankung, die in der Regel geschieht 10 bis 11 Tagen werden die Mäuse deutlich Tachypnoe und verminderte Aktivität. Typischerweise werden sie rasch zu moribund und verfallen. </li><li> Distressed Tiere entsprechend sollte mit CO 2 in einem eigenen Raum eingeschläfert werden sollte Verstorbene Tiere täglich aufgezählt werden. </li></ol> 7. CFU Studies, Histologie und Zytokine Studies <ol><li> Bereiten Sie 15 ml konische Röhrchen mit 10 ml PBS für jedes Organ zu erheben. </li><li> Euthanize Tieren 7 und 14 Tage nach der Infektion mit einem subletalen inuculum (5,0 x 10 6) wie zuvor dargestellt, und entfernen Sie die Lunge, Milz und Leber sofort. </li><li> Nehmen Sie ein Stück von der Orgel zu bewerten und führen Sie die Fixierung in Formalin über Nacht. Die Abschnitte werden unter dem Mikroskop auf pathologische Auswertung untersucht werden. </li><li> Bereiten Sie 50 ml konische Röhrchen mit 5 ml PBS belegt mit 70 um Zelle Siebe für jedes Organ, homogenisiert werden. Mazerat jeweils verbleibende Teil der Organe getrennt in den 50 ml Röhrchen mit sterilen 5 ml Spritze Kolben. </li><li> Als nächstes seriell verdünnten Orgel Homogenaten (1:100, 1:1000 und 1:5000) und die Platte 100 &amp;mgr; l jeder Verdünnung auf BHI-Blut-Agar-Platten (2). </li><li> Add Protease-Inhibitor Tabletten, die Homogenate nach den Herstellerangaben (Roche, Deutschland). </li><li> Die Platten bei 37 ° C für bis zu 14 Tage und aufzählen KBE. </li><li> Centrifuge die Orgel Homogenate 4000xg für 10 min und entfernen Orgel Überstände werden whish in Verwendung in der Zytokin-Assays durch Standardverfahren nach Angaben des Herstellers durchgeführt werden. </li></ol> 8. Monoklonale Antikörper zum Schutz vor H. Capsulatum ist abhängig von Antikörper Spezifität und Isotyp <ol><li> MAb Isotyp ist von entscheidender Bedeutung beim Schutz gegen H. capsulatum, als Mäuse mit IgG1 oder IgG2a mAb an Hsp60 behandelt wurden, signifikant verlängertes Überleben im Vergleich zu Mäusen Erhalt einer IgG2b mAb an Hsp60 oder entweder ein Isotyp-Kontroll-mAb oder PBS (Abbildung 4) zu kontrollieren. </li><li> Weitere, in Mäusen, die schützende mAbs erhielten, wurde eine signifikante Reduktion in der Anzahl der Lungen-und Milz-CFU am Tag 7 und sinkt von 2 und 2,5 log-Einheiten von Hefe-Nummern in der Lunge am Tag 14 (Abbildung 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Wachstum von H. capsulatum und Hybridome. (A) Liquid HAM F-12 Kultur-Präparation aus einer einzelnen Kolonie von H. erhalten capsulatum auf einer BHI-Agar-Platten kultiviert. (B) Hybridoma Wachstum in Zellkulturflaschen und mAb Reinigung durch Protein A / G Harz mit Affinität cromatography. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: H. capsulatum Inokulum Vorbereitung für die intranasale Infektion. Zellsuspension nach H. erhalten capsulatum Aggregate Störung mit einer Spritze und Zentrifugation wird durch Zählen in einer Zählkammer gezählt. Zellkonzentration ist eingestellt auf 1,25 x 10 7 (Überlebens-Experimente) oder 5 x 10 6 (CFU, Zytokine und Histologie) in &lt;50 ul. upload/2532/2532fig3.jpg "alt =" Bild 3 "/&gt; Abbildung 3: Maus Handhabung während mAb Verwaltung. (A) Die Maus wird durch den Schwanz hob und (B und C), indem das Genick seines Halses zu theears nahe immobilisiert. (D) Der Schwanz ist zwischen dem kleinen Finger und Handfläche. (E) Die mAb-Lösung injiziert wird mit einem 26G1 / 2 Nadel. (F) Der H. capsulatum Inokulum wird intranasal durch vorsichtiges Pipettieren der Zellsuspension in eine nare verwaltet. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4: MAbs zu Hsp60 kann der Pathogenese der Histoplasmose ändern. ip Injektionen mit 500 ug IgG1, IgG2a oder mAbs 2 h vor der Infektion signifikant verlängerten Überlebenszeit (p &lt;0,05, im Vergleich zur Kontrollgruppe), sondern eine IgG2b mAb. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5: CFU-Bestimmungen in den Lungen bei 7 und 14 Tage nach einer subletalen intranasale Herausforderung mit 5x10 6 HC Hefen der behandelten Mäuse ip mit ausgewählten mAb an Hsp60 oder irrelevant mAb zeigte Reduzierung Pilz Belastung für IgG1 und IgG2a mAb behandelten Tieren. Schwarze Balken stellen KBE am Tag 7 und weißen Balken 14 Tage nach der Infektion (* p &lt;0,001 bei 7 Tagen und ** p &lt;0,001 bei 14 Tagen nach der Infektion).

<ol><li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li>
<li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li>
</ol>

Das Protokoll hier vorgestellten zeigt, dass mAb an H. ist capsulatum ändern können Laufe der experimentellen murinen Histoplasmose. MAbs zu Zelloberflächenantigene von Krankheitserregern können die komplexe Dynamik, die während des Zusammenspiels zwischen einem Host und einem Erreger auftreten. Diese Studie stellt fest, dass mAbs Schutz in einem Mausmodell der tödlichen Histoplasmose vermitteln, wenn intraperitoneal, und es schlägt Kandidaten-Proteine ​​für die Entwicklung von Impfstoffen, wie H2B, M-...

<table border="1"><tbody><tr><th> Bezeichnung des Gutes </th><th> Firma </th></tr><tr><td> Biologische Sicherheitswerkbank (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> 15 mL konischen Rohren </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> HAM F-12-Medium </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C Schüttler </td><td></td></tr><tr><td> Wirbel </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konische Röhrchen </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 Nadel </td><td> BD </td></tr><tr><td> 10 mL Spritze </td><td> BD </td></tr><tr><td> 250 ml Flaschen </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)-System </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> ELISA-Reader </td><td> BioTek </td></tr><tr><td> Anästhesie (Ketamin und Xylazin) </td><td></td></tr><tr><td> Spalte steht </td><td></td></tr><tr><td> Nylon-String </td><td></td></tr><tr><td> Wärmelampe </td><td></td></tr><tr><td> 70μm Zelle Siebe </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> BHI-Agar-Platten </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

passive verwaltung von monoklonalen antikörpern gegen h. capsulatum ua pilzpathogene

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Der Zweck der Anwendung dieser Methodik ist 1) unsere Fähigkeit voraus, um Menschen mit Antikörper oder Impfstoff zur Vorbeugung oder Behandlung Histoplasmose durch den Pilz Histoplasma capsulatum und 2) die Rolle der Virulenzfaktoren als Ziel für eine Therapie zu untersuchen schützen. Zur Erzeugung von mAbs, Mäuse immunisiert sind, sind die Immunreaktionen anhand einer Festphasen-ELISA-System in unserem Labor entwickelt und die besten Responder-Mäuse sind für die Isolierung von Milzzellen für die Fusion mit Hybridomzellen ausgewählt. C57BL / 6 Mäuse wurden ausgiebig verwendet, um H.-Studie capsulatum Pathogenese und bieten das beste Modell für die Beschaffung der erforderlichen Daten. Um die Rolle der mAbs in Infektion zu beurteilen, werden Mäuse intraperitoneal entweder mit mAb an H. verabreicht capsulatum oder Isotyp Kontroll-mAb und dann infiziert entweder durch intravenöse (iv), intraperitoneal (ip) oder intranasal (in) Routen. In der wissenschaftlichen Literatur setzt Wirksamkeit von mAbs gegen Pilzinfektionen bei Mäusen auf die Mortalität als Endpunkt, in Verbindung mit Kolonie formin Einheiten (KBE) Einschätzungen zu früheren Zeitpunkten. Survival (Zeit bis zum Tod) Studien sind notwendig, da sie am besten repräsentieren menschliche Krankheiten. So würde die Wirksamkeit unserer Maßnahmen nicht ausreichend, ohne Überlebenskurven ermittelt werden. Dies gilt auch für die Errichtung Wirksamkeit des Impfstoffes oder Prüfung von Mutanten für die Virulenz wahr. Mit Histoplasmose, die Mäuse oft als energisch, um tote über mehrere Stunden gehen. Die Kapazität einer Intervention, wie die Verwaltung eines mAb kann anfänglich zu schützen ein Tier aus Krankheit, aber die Krankheit kann Rückfall, die nicht in kurzer CFU Experimente realisiert werden. Zusätzlich zu Überleben und Pilz-Belastung Assays, untersuchen wir die entzündliche Antwort auf eine Infektion (Histologie, zelluläre Rekrutierung, Zytokin-Antworten). Für das Überleben / Zeit bis zum Tod Experimente werden die Mäuse infiziert und beobachtet mindestens zweimal täglich auf Anzeichen von Morbidität. Um zu beurteilen, Pilz-Belastung, Histopathologie und Zytokinreaktionen werden die Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion eingeschläfert. Tierversuche sind nach den Richtlinien des Institute for Animal Studies der Albert Einstein College of Medicine durchgeführt.

C57BL / 6 Mäuse wurden verwendet, um Hc Pathogenese zu studieren und bieten das beste Modell. Wir erforschen die potenziellen Vorteile der humoralen Immunität gegen diesen Pilz erzeugt und mehrere mAbs [zum Histon H2B und ein heat shock protein 60kDa], dass wir für ihre Schutzwirkung nach intraperitonealer Verabreichung getestet.

Passive Verwaltung von monoklonalen Antikörpern gegen H. capsulatum Ua Pilzpathogene

Der Zweck der Anwendung dieser Methodik besteht darin, 1) unsere Kapazitäten zum Schutz von Personen mit Antikörpern oder Impfstoffen zur Prävention oder Behandlung von ... zu verbessern

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, unsere Fähigkeit zu verbessern, Individuen durch Antikörper oder Impfstoffe vor Histoplasmose zu schützen oder diese zu behandeln, sowie die Rolle von Virulenzfaktoren bei der Krankheitspathogenese zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst monoklonale Antikörper gegen Zielantigene isoliert und charakterisiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die ausgewählten monoklonalen Antikörper intraperitoneal zwei Stunden vor der intranasalen Infektion zu verabreichen. Um sicherzustellen, dass diese Moleküle Zeit haben, sich im Körper zu verteilen, besteht der dritte Schritt des Verfahrens darin, die Mäuse zu anästhesieren und sie intranasal mit dem gewünschten Inokulum zu infizieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Überwachung des Gesundheitszustands der Tiere. Die Tiere werden entweder zu verschiedenen Zeitpunkten euthanasiert, um den Pilzbefall zu bestimmen und entzündliche Reaktionen zu bewerten, oder sie werden hinsichtlich ihres Überlebens beobachtet.Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine Verlängerung des Überlebens und eine Modifikation der pathologischen Reaktionen in den betroffenen Organen tödlich infizierter Mäuse zeigen. Durch die peritoneale Verabreichung der schützenden monoklonalen Antikörper vor der Infektion wird die Methode demonstriert von Ally Emer, einer Postdoktorandin mit umfangreicher Erfahrung in der Pilzpathogenese und in Tierinfektionsmodellen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Antimykotika besteht darin, dass die monoklonalen Antikörper Moleküle mit spezifischen Eigenschaften sind, die durch die Bindung an einen potenziellen Wirtsfaktor wirken. Eine visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend.Da die Verabreichung eines monoklonalen Antikörpers und die intranasale Infektion schwierig zu erlernen sind, weil sie Fachkenntnisse im Umgang mit den Tieren erfordern. Bereiten Sie einen Sicherheitswerkbank der Biosicherheitsstufe zwei für die Arbeit mit dem Pilz in der Hefeform vor, indem Sie die Werkbank mit Bleichmittel reinigen und anschließend einer UV-Bestrahlung unterziehen. Bereiten Sie ein 15-Milliliter-Konischgefäß mit fünf Millilitern PBS vor.Entnehme eine Kolonie von H caps AUM aus einer Aliquotprobe der bei minus 80 Grad Celsius eingefrorenen Stammlösung und gebe sie in das PBS-Vortex. Vortexe die Zellen kräftig und zentrifugiere 10 Minuten bei 1100 ×g. Entferne vorsichtig bei Raumtemperatur den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und gebe mindestens 10 Milliliter frisches PBS hinzu.Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal nach dem letzten Waschschritt. Resuspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter PBS. Alle Waschschritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Um aggregierte Zellen aufzulösen, pipettieren Sie die Hefezellen fünfmal mit einer 10-Milliliter-Spritze durch eine 26-Gauge-½-Zoll-Nadel und sammeln die Hefezellen in einem 50-Milliliter-Konischglas.Um kleine, gleichmäßig große Hefe zu isolieren, zentrifugieren Sie die Zellen bei 55 × g für eine Minute und entfernen Sie danach das obere Milliliter. Geben Sie die Zellsuspension in einen sterilen 250-Milliliter-Glaskolben mit 100 Milliliter Ham-F12-Medium und kultivieren Sie die Zellen dann 48 Stunden bei 37 °C in einem Inkubator mit Schütteln bei Raumkonzentration an Kohlendioxid. Diese Kultur wird zur Herstellung des Inokulums verwendet, und die Wirksamkeit der in dem nächsten Schritt erzeugten monoklonalen Antikörper wird bewertet.Züchten Sie die ausgewählten Hybridome fünf bis sieben Tage lang in DMEM. Inkubieren Sie die Kulturen und gewinnen Sie die Antikörper, indem Sie das gesamte Medium aus dem Zellkulturgefäß sammeln und anschließend das Medium bei 1100 × g für 10 Minuten zentrifugieren. Wie bei den Hefezellen können die Antikörper bei Raumtemperatur gewaschen werden.Sammeln Sie das Überstand ohne Störung der Pellets. Reinigen Sie anschließend den zellfreien Überstand mithilfe eines Protein-AG-Harzes durch F-P-L-C-A-Erfassung. Mit ELISA wird die monoklonale Antikörperkonzentration berechnet, um zu bestimmen, wie viel des gereinigten Antikörpers injiziert werden sollte.Führen Sie die intraperitoneale Applikation des PBS-Isotyp-Kontrollantikörpers oder des experimentellen Antikörpers wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben durch. Warten Sie zwei Stunden nach der Injektion des monoklonalen Antikörpers, bevor Sie die Maus anästhetisieren und mit der intranasalen Infektion fortfahren. Bereiten Sie den Histoplasma capsulatum-Inokulum wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben vor, und bauen Sie die Schnurvorrichtung zur Infektion der Maus auf, indem Sie eine Nylon- oder Baumwollschnur straff zwischen zwei Säulenständer binden und anschließend die Ständer so auseinanderziehen, dass die Schnur gespannt ist.Das Anästhetikum Ketamin in einer Dosis von 100 Milligramm pro Kilogramm und Xylazin in einer Dosis von 10 Milligramm pro Kilogramm. Kann auch zu diesem Zeitpunkt vorbereitet werden, wenn den Antikörpern ausreichend Zeit zur Verteilung gegeben wurde. Das Maus wird anästhesiert, und die Sedierung wird durch fehlende Reaktion auf Zehenreiz bestätigt.Mit einer Pinzette anfassen. Die Maus vorsichtig an ihren Vorderzähnen am Faden aufhängen. Langsam etwa 50 Mikroliter Inokulum mit einer Mikropipette in die Luft verabreichen.Während die Atemfrequenz der Maus sorgfältig überwacht wird, die Maus nach der intranasalen Infektion zwei bis fünf Minuten lang in dieser Position ruhen lassen, um die Ablagerung der Hefe in den Lungen des Tieres zu erleichtern, nachdem die Maus infiziert wurde. Die Maus in einer überwachten, warmen Umgebung halten und gegebenenfalls vorsichtig eine Wärmelampe verwenden, bis sie sich von der Anästhesie erholt hat.Wenn die Maus aufwacht, bringen Sie sie in einen sauberen Käfig zurück. Gewähren Sie ad libitum Zugang zu Futter und Wasser, und bewerten Sie infizierte und mock-infizierte Tiere klinisch. Die Tiere sollten zweimal täglich durch Labormitglieder und täglich durch Tierpfleger auf Tachypnoe, Lethargie und Gewichtsverlust überprüft werden.Bei milder Histoplasmose bis kurz vor dem Lebensende gibt es in der Regel keine offensichtlichen Anzeichen der Infektion, außer einer leichten Erhöhung der Atemfrequenz. Bei fortgeschrittener Erkrankung werden die Mäuse deutlich krank und zeigen verminderte Aktivität. Typischerweise verschlechtern sie sich rasch und sterben ab.Verst&uuml;mmelte Tiere sollten in einer separaten Kammer angemessen mit Kohlendioxid euthanasiert werden. Der Tod ist durch das Fehlen einer Reflexreaktion auf Zehenquetschung bei den Tieren zu best&auml;tigen und die Tiere t&auml;glich zu erfassen.Bereiten Sie 15-Milliliter-Kegelröhrchen mit jeweils 10 Milliliter PBS für jedes zu entnehmende Organ vor. Töten Sie Tiere, die mit dem subletalen Inokulum fünf mal 10 hoch 6 Hefezellen infiziert wurden, wie zuvor gezeigt, und entnehmen Sie unmittelbar Lungen, Milz und Leber. Bereiten Sie 50-Milliliter-Kegelröhrchen mit jeweils fünf Milliliter PBS vor.Befestigen Sie eine Petrischale mit 70-Mikron-Zellsieben für jedes zu homogenisierende Organ. Zerkleinern Sie jedes Organ einzeln mit 5-Milliliter-Stößeln und überführen Sie es in 50-Milliliter-Röhrchen. Verdünnen Sie anschließend das Organhomogenat seriell in drei Verdünnungsstufen im Verhältnis 1:100, 1:1001 bis 1:5.000 und geben Sie jeweils 100 Mikroliter auf BHI-Platten.Blutaugerplatten werden bis zu 14 Tage lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und normalem Raumanteil an Kohlendioxid inkubiert, und die koloniebildenden Einheiten (CFUs) werden gezählt. Der Isotyp ist entscheidend für den Schutz gegen hcaps Lotum, da Mäuse, die mit monoklonalen Antikörpern vom Typ IgG1 oder IgG2a gegen HSP60 behandelt wurden, eine signifikant verlängerte Überlebenszeit aufweisen im Vergleich zu Kontrollmäusen, die einen monoklonalen IgG2b-Antikörper gegen HSP60 oder einen isotypischen Kontrollantikörper bzw. PS erhielten. Zudem zeigte sich bei Mäusen, die schützende monoklonale Antikörper erhielten, am Tag sieben eine signifikante Verringerung der Anzahl pulmonaler und splenischer CFUs sowie am Tag 14 eine Reduktion um 2 bzw. 2,5 log-Einheiten der Hefezahlen in der Lunge. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden angewandt werden, wie die Bestimmung der Ugal-Belastung als Indikator für koloniebildende Einheiten, die Analyse der an der Infektion beteiligten Zytokine und die Untersuchung der Topologie, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Klärung des Wirkmechanismus der Antikörper bei der Modifikation des Krankheitsverlaufs, während dieses Verfahren durchgeführt wird.Es ist wichtig, daran zu denken, bei der Handhabung des Knock-outs unter biologischen Sicherheitsbedingungen zu arbeiten und gemäß den Tierschutzvorschriften für intranasale Infektionen vorzugehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Induktion und klinischen Scoring von einem Tiermodell der Multiplen Sklerose: chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in DA-Ratten. Die Krankheit, durch die Immunisierung von Ratten mit einer Emulsion, die ganze Ratte Rückenmark und komplettem Freund-Adjuvans induziert, weist klinische Symptome ähnlich der menschlichen Erkrankung.

Induction and Clinical Scoring von chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Bestimmte Maus-Stämme sind in der Lage, die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) mit Myelin basisches Protein zu widerstehen. Hier beschriebene ist ein einfaches Protokoll, das die Immunisierung Teilnahmslosigkeit umkehrt und induziert paralytischen Erkrankung in mehreren typischen EAE resistent Maus Flecken.

Die Überwindung der nicht mehr reagiert, in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) Beständig Mausstämmen durch adoptiven Transfer-und Antigen-Challenge

Dieses Video zeigt eine effiziente Homogenisierungstechnik zur Erzeugung einer Antigen-adjuvanten Emulsion zur Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) in einem Mausmodell. Die Emulsion enthält ein Autoantigen – Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) – in der Wasserphase, umgeben von einer kontinuierlichen Ölphase, die aus einem inaktivierten pathogenen Bakterium besteht. Die Emulsion sorgt für eine anhaltende Freisetzung von Antigenen für eine verlängerte...

Herstellung einer Antigen-Adjuvans-Emulsion zur Induktion der autoimmunen Enzephalomyelitis

Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) ist ein etabliertes Tiermodell für multiple Sklerose. C57BL / 6 Mäuse mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)-Peptid 35-55 (MOG 35-55) immunisiert, was zu einer aufsteigenden schlaffen Lähmung durch autoreaktive Immunzellen im zentralen Nervensystem verursacht. Protokolle für die Krankheitsinduktion und Überwachung diskutiert.

Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 Mäuse

Es wird ein optimiertes Protokoll für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern auf Basis der Hybridom-Technologie vorgestellt. Die Mäuse wurden mit einem Immunkonjugat immunisiert. Milzzellen wurden durch PEG und einen elektrischen Impuls mit unsterblichen Myelomzellen fusioniert. Antikörper-produzierende Hybridomzellen wurden mittels HAT und antigenspezifischem ELISA-Screening selektiert.

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Auswertung von monoklonalen Antikörpern gegen natürliche Produkte für den Einsatz in verschiedenen Immunoassays. Dieses Verfahren beinhaltet Immunisierung, Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA positiven Klon screening und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung. Die Spezifikationen für Antikörper Charakterisierung mittels MALDI-TOF-MS und ELISA Analysen sind ebenfalls vorhanden.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Induzieren von aktiver experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen dar. Eine Methode zur Isolierung und Charakterisierung der infiltrierten Lymphozyten im Zentralnervensystem (ZNS) wird ebenfalls vorgestellt, um zu zeigen, wie Lymphozyten an der Entwicklung einer CNS-Autoimmunerkrankung beteiligt sind.

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Induktion der Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) bei Mäusen. Diese Methode beschreibt die Schritte, um eine zuverlässige und robuste Augenentzündung im Mausmodellsystem zu erzeugen. Mit diesem Protokoll erzeugten wir uveitische Augen und entzündete Augengenossen von einzelnen Tieren zur weiteren Auswertung mit immunologischen, transkriptomischen und proteomischen Assays.

Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) als Modell für postinfektiöse Uveitis

Um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, ein Tiermodell für Multiple Sklerose, zu induzieren, werden Mäuse mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion immunisiert, die ein Autoantigen und ein komplettes Freund-Adjuvans enthält. Während für die Herstellung dieser Emulsionen mehrere Protokolle existieren, wird hier ein schnelles, einfaches und standardisiertes Homogenisierungsprotokoll für die Emulsionsherstellung vorgestellt.

Eine schnelle, einfache und standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen zur Induktion experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

In dieser Arbeit stellen wir ein alternatives Protokoll vor, um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in C57BL/6-Mäusen aktiv zu induzieren, indem wir das immunogene Epitop Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)35-55 verwenden, das in einem unvollständigen Freund-Adjuvans suspendiert ist, das die hitzeabgetötete Mycobacterium avium-Subspezies paratuberculosis enthält.

Adjuvante Aktivität von Mycobacterium paratuberculosis bei der Verbesserung der Immunogenität von Autoantigenen während der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Mäuse sind im Allgemeinen resistent gegen Infektionen mit Mycobacterium abscessus, was die Entdeckung und Entwicklung dringend benötigter Antibiotika gegen Lungeninfektionen erschwert. Hier beschreiben wir eine Methode der Inokulumvorbereitung und intratrachealen Infektion, die bei immunkompetenten Mäusen nachweislich eine anhaltende Infektion auslöst.

Vorbereitung von in Agarperlen eingebettetem Mycobacterium abscessus zur intratrachealen Inokulation immunkompetenter Mäuse

Erfahren Sie die passive Verwaltung monoklonaler Antikörper gegen Histoplasma capsulatum bei C57BL/6-Mäusen. Diese Methode untersucht den Schutz durch humorale Immunität und die Reduktion der Pilzlast in vivo.

Passive Verwaltung von monoklonalen Antikörpern gegen H. capsulatum Ua Pilzpathogene

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