Name: Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Lernen Sie Whole Mount In Situ Hybridisierung zur Untersuchung von Genexpressionsmustern in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode verbindet molekulare und organismische Biologie für die Entwicklungsbiologie.

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Die Autoren möchten an das Department of Biology an der Syracuse University und Dr. Marilyn Kerr anerkennen für ihre Rollen in der Verwaltung des Comparative Biology Wirbeltiere natürlich. Die Albertson Labor ist durch Zuschüsse R21DE019223 von den National Institutes of Health / National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung sowie zu gewähren R01AG031922 von den National Institutes of Health / National Institute on Aging unterstützt.

1. Plasmid Transformation von Target-cDNA Teil I: Die Transformation von Plasmid (Zeitaufwand: 3 Stunden plus Inkubation über Nacht) <ol><li> Warm SOC Nährlösung in einem 42 ° C Wasserbad (500 ul pro Reaktion) </li><li> Thaw kompetenten Zellen auf Eis </li><li> Add 1 ul Plasmid auf 25 ul kompetenten Zellen </li><li> Auf Eis für 20 Minuten </li><li> Hitzeschock-Zellen in 42 ° C Wasserbad für 45 Sekunden </li><li> Unmittelbar Ort Zellen auf Eis für 2 Minuten </li><li> Add 500 ul von 42 ° C Nährbouillon in jedes Fläschchen von Zellen </li><li> Schütteln bei 37 ° C für 2 Stunden bei 255 Umdrehungen pro Minute (rpm) </li><li> Tafel 75 ul Transformation Mix auf Luria Bertani (LB) Agarplatten </li><li> Die Platten bei 37 ° C über Nacht invertiert </li></ol> Teil II: E. coli Kultur (Zeitaufwand: 15 Minuten plus Inkubation über Nacht) <ol><li> Für jede Reaktion Aliquot 3 ml LB-Bouillon und 3 ul 50 mg / mL Ampicillin in einer Kultur Rohr </li><li> Scrape 1 Bakterien Kolonie von der Agarplatte und fügen Sie jede Kultur Rohr </li><li> Schütteln Sie Kulturröhrchen bei 37 ° C bei 255 rpm über Nacht </li></ol> Teil III: Plasmid Prep (Zeitaufwand: 1,5 Stunden) <ol><li> Isolieren von Übernacht-Kulturen mit dem 5 Prime FastPlasmid Mini Kit (Katalog Nr. 2300000) Plasmid </li><li> Um zu überprüfen, auf die Anwesenheit von Plasmid vorbereitet, führen Sie die DNA aus dem Kit auf einem 1% Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Gel mit Ethidiumbromid gefärbt eluiert </li></ol> 2. In Situ DIG-markierten RNA-Sonde Synthese Teil I: Linearisierung der Plasmid (Zeitaufwand: 2,5 Stunden) <ol><li> In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren: <table border="1"><tbody><tr><td> Vorbereitet Plasmid </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> Restriction Enzyme * </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Buffer ** </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> 10X Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Diethylpyrocarbonat (DEPC) Wasser </td><td> 58 mL </td></tr><tr><td></td><td> 100 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Bei 37 ° C für 2 Stunden * Variiert mit Plasmid ** Variiert mit dem Restriktionsenzym </li></ol> Teil II: Transkription (Zeitaufwand: 3 Stunden) <ol><li> In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren: <table border="1"><tbody><tr><td> Linear Plasmid </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> 10X Transcription Buffer ** </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Digoxigenin Label Mix </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Polymerase * </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> RNase-Inhibitor </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> DEPC Wasser </td><td> 24 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Bei 37 ° C für 1 Stunde </li><li> Add 2 ul der Polymerase * </li><li> Bei 37 ° C für 1 Stunde </li><li> Add 2 &amp;mgr; l DNase </li><li> Bei 37 ° C für 20 Minuten * Variiert mit Plasmid ** Variiert mit Polymerase </li></ol> Teil III: Niederschlag (Zeitaufwand: 5 Minuten plus 2 Stunde Inkubation über Nacht, 1 Stunde, um Zentrifuge und resuspendieren) <ol><li> Add 4 ul 0,2 M EDTA </li><li> Add 5 ul 4M Lithiumchlorid </li><li> Fügen Sie 150 ul eiskaltem 100% Ethanol </li><li> Inkubation bei -80 ° C für 2 Stunden bis über Nacht </li><li> Zentrifuge bei 14.000 rpm für 30 Minuten bei 4 ° C, Dekantieren entfernt Überstand </li><li> Dry Pellet für 7 Minuten </li><li> In 20 ul DEPC-Wasser Re-suspend </li><li> Bei 37 ° C für 5 Minuten </li></ol> Teil IV: Die Fraktionierung - Führen Sie nur, wenn Sonde größer ist als 0,6 kb (Zeitaufwand: variiert je nach Sonde Größe, in der Regel nicht mehr als 20 Minuten) <ol><li> In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren: <table border="1"><tbody><tr><td> RNA-Sonde </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> DEPC Wasser </td><td> 12 mL </td></tr><tr><td> Natriumbikarbonat </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Sodium Carbonate </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Inkubieren in einem 60 ° C Wasserbad. Basis der Inkubationszeit auf die Gleichung: Dauer (Min.) = (ab kb - gewünschte kb) / (.11 x beginnend kb x gewünschte kb) Durchschnittliche gewünschte Größe = 0,6 kb </li></ol> Teil V: Final Niederschlag (Zeitaufwand: 5 minnuten plus 2 Stunde Inkubation über Nacht, 1 Stunde, um Zentrifuge und wieder auszusetzen, 1 Stunde für die Gel-Elektrophorese) <ol><li> Zugabe von 40 ul DEPC-Wasser </li><li> Add 8 &amp;mgr; l Natriumacetat </li><li> Add 1,04 ul Eisessig </li><li> Add 240 &amp;mgr; l eiskaltem 100% Ethanol </li><li> Inkubation bei -80 ° C für 2 Stunden bis über Nacht </li><li> Zentrifuge bei 14.000 rpm für 30 Minuten bei 4 ° C, Dekantieren entfernt Überstand </li><li> Dry Pellet für 7 Minuten </li><li> In 20 ul DEPC-Wasser Re-suspend </li><li> Vortex mischen </li><li> Um zu überprüfen, auf das Vorhandensein von Ribosonde, führen Sie den resuspendierten Lösung auf einem 1% TAE-Gel mit Ethidiumbromid angefärbt </li></ol> 3. Whole mount in situ Hybridisierung Teil I: Fixation des Embryos und Proteinase K Verdau (Zeitaufwand: Fix Nacht plus 4 Stunden am nächsten Tag für die Lagerung, 2,5 Stunden von der Lagerung bis Part II) <ol><li> Sammeln Sie inszeniert Zebrafischembryonen und fix in 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht bei 4 ° C </li><li> Wash festen Embryonen in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Tween-20 (PBST) 3 mal für jeweils 10 Minuten </li><li> Um das Risiko der Embryonen in die experimentelle Reagenzien, manuell dechorionate Embryonen (falls erforderlich) mit spitzen Pinzette zu gewährleisten </li><li> Entwässern Embryonen durch Waschen in einer abgestuften Reihe von 25% und 50% Methanol in PBST für jeweils eine Stunde zu waschen, dann in 100% Methanol bei -20 ° C </li><li> Wenn Sie bereit sind zu verwenden, rehydrieren Embryonen in PBST durch Waschen in 50% (2 mal) und 25% (1 Mal) Methanol in PBST für jeweils 10 Minuten. Schließlich waschen 2 mal für jeweils 10 Minuten in 100% PBST. Der genaue Zeitablauf ist nicht für PBST / Methanol wäscht wichtig </li><li> Bleach Embryonen in einer 10% igen Wasserstoffperoxid-Lösung in PBST, wenn nötig, dunkle Pigmente zu entfernen. Embryonen sollten in Wasserstoffperoxid-Lösung für 10-20 Minuten inkubieren, je nach Alter des Embryos, und die Kappe der Mikrozentrifugenröhrchen sollte offen bleiben, um zu verhindern den Aufbau von Luftdruck </li><li> Digest Embryonen mit 50 mg / mL Proteinase K 1:5000 verdünnt in PBST für 3-15 Minuten, je nach dem Alter des Embryos </li><li> Re-fix Embryonen in 4% PFA für 30 Minuten, und dann 3 x waschen in PBST für jeweils 5 Minuten </li></ol> Teil II: Die Hybridisierung der Ribosonden (Zeitaufwand: 3 Stunden plus Übernachtung für die Hybridisierung, 1,5 Stunden am nächsten Tag an Teil III) <ol start="9"><li> Prehybridize Embryonen mit Prähybridisierungslösung (PHS) in eine vorgewärmte 70 ° C Wasserbad für 2-3 Stunden </li><li> Entfernen PHS, 0,5 mL Hybridisierungslösung und 1,5 ul zuvor synthetisierten Digoxigenin markierte Ribosonden, bei 70 ° C über Nacht inkubieren. Die Temperatur kann innerhalb von ein paar Grad in Abhängigkeit von der Ribosonde Ziel schwanken </li><li> Am nächsten Tag waschen Embryonen bei 70 ° C in abgestuften Lösungen von 75%, 50% und 25% PHS in 2X Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) für jeweils 10 Minuten, dann in 0,2 X SSC waschen und 30 Minuten bei 68 ° C </li><li> Wash in Maleinsäure-Puffer (MAB) 2 mal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur </li></ol> Teil III: Anti-Digoxigenin (α-DIG) Antikörper Inkubation (Zeitaufwand: 3 Stunden plus Übernachtung zu blockieren, zu 2,5 Stunden am nächsten Tag zum Teil IV) <ol start="13"><li> -Embryonen zu einem 12-Well-Platte </li><li> Pre-Block Embryonen in 1-2 ml Blocking-Lösung für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur </li><li> Gleichzeitig pre-Block der Antikörper hergestellt, indem ein zweiter Band der Blockierungslösung und Verdünnen der anti-Digoxigenin-Antikörper 1:2000 in dieser Lösung </li><li> Entfernen Sie vor Block und fügen 1-2 ml pre-blocked α-DIG-Lösung über Nacht inkubieren bei 4 ° C </li><li> Am nächsten Tag waschen Embryonen in MAB. Lassen Sie die Embryonen in MAB für 5 Minuten Uraufführung inkubieren, dann führen Puffer Änderungen und inkubieren für zwei 10 Minuten, eine 30 Minuten und einem 60 Minuten Intervall. Der genaue Zeitablauf ist nicht notwendig </li><li> Wash Embryonen 3 mal für jeweils 5 Minuten in alkalische Phosphatase (AP)-Puffer </li></ol> Teil IV: Die Färbung und Endbearbeitung (Zeitaufwand: 1 Stunde oder über Nacht zur Färbung, je nach Ribosonde verwendet wird, kann 4 Stunden, um von Glycerin wäscht, 6-10 Stunden pro Waschglycerinphase, beginnend in Glycerin aufbewahrt werden) <ol start="19"><li> Fügen Sie 1-2 mL Färbelösung, die Embryonen, wickeln Sie die Platte in Folie, und überprüfen Färbung in regelmäßigen Abständen (ca. alle 20 Minuten) bis zur Färbung reicht </li><li> Wash Embryonen mit PBST 2 Mal für jeweils 5 Minuten, um die Farbreaktion zu stoppen </li><li> Entwässern Embryonen mit 10 Minuten wäscht in 25% (1 Mal) und 50% (2 mal) Methanol in PBST, dann in 100% Methanol, um die Hintergrundfärbung zu entfernen </li><li> Lassen Embryonen in 100% Methanol für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren </li><li> Rehydrieren in PBST mit 10 Minuten wäscht in 50% (2 mal) und 25% (1 Mal) Methanol in PBST, dann in 100% waschen PBST 2 Mal </li><li> Transfer gebeizt embryos um eine 80% ige Glycerin-Lösung in PBST mit einer abgestuften Reihe von Waschungen und lagern bei 4 ° C. </li></ol> Rezepte: <ul><li> LB-Agar-Platten-10 g LB-Agar + 250 ml destilliertem Wasser, Autoklaven, wenn kühl an add 250 ul Ampicillin, pour 15-20 ml warme Lösung in jede Petrischale, damit Agar zur Verfestigung </li><li> LB-Medium-12.5 g LB Broth + 200 ml destilliertem Wasser, Autoklaven, erlauben, bevor Sie mit kaltem </li><li> 1% TAE-Gel-0.4 g Agarose, 40 ml 1X TAE, 2 ul Ethidiumbromid; Last 7 ul Plasmid (Plasmid Transformation von Target cDNA) oder 3 ul Ribosonde und 4 ul DEPC Wasser (In-situ-DIG-markierten RNA-Sonde Synthesis) + 1 ul loading Farbstoff, 5 ul DNA-Leiter </li><li> Prähybridisierungslösung-50% Formamid, 5x SSC, 9,2 mm Zitronensäure, 1% Tween-20 </li><li> Hybridisierungslösung-Prähybridisierungslösung plus 500 ug / ml tRNA und 50 pg / mL Heparin </li><li> MAB-100mm Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,2 M NaOH, 0,1% Tween-20, pH auf 7,5 </li><li> Blocking Solution-3 Teile MAB, 1 Teil 10% Boehringer Blockierungsreagenz in MAB, 1 Teil Wärme Lamm Serum deaktiviert </li><li> AP-Puffer-60mm Tris-HCl pH 9,5, 60 mM NaCl, 30 mM MgCl 2, 0,1% Tween-20 </li><li> Färbelösung-5-Bromo-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (BCIP) und Nitro-Tetrazolium (NBT) in AP-Puffer </li></ul> 4. Repräsentative Ergebnisse Wenn richtig ausgeführt, wird die Reaktion zwischen dem NBT, BCIP und alkalische Phosphatase bilden einen violetten Niederschlag, der auf der Zebrafisch-Embryos als violetter Fleck erscheinen soll. Ribosonden sollte vorher aus cDNA entsprechend dem Gen von Interesse synthetisiert werden. Daher kann gefolgert werden jeden Fleck sichtbar repräsentiert Bereichen der Zebrafisch, in denen das Gen von Interesse an diesem speziellen Entwicklungsphase wurde transkribiert werden. Fgf8a (Reifers et al, 1998;;. Abbildung 2); deltaC (Oates et al, 2005.) Für die Zwecke dieses Kurses wurden Ribosonden aus aldh1a2 (; Begemann et al, 2001;. Abbildung 1 zuvor raldh2) synthetisiert; MyoD1 (Weinberg et al, 1996.); shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Abbildung 3) und myl7 (bisher cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. Die Färbung wurde in der Mittellinie und in anatomischen Strukturen einschließlich der Somiten, tailbud, Myotom, Gehirn und Herz zu erwarten. Ace/fgf8a Mutanten erwartet wurde, Mängel in viele dieser Strukturen haben. Die Färbung war einfach visualisiert mit Hilfe eines Standard-Binokular. Weitere Quellen enthalten weitere Informationen und Fehlersuche an WISH Techniken ähnlich denen hier beschriebene (Clark, 2003;. D'Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ein Zebrafisch-Embryos 24 Stunden nach der Befruchtung, die mit Ribosonden spezifisch für aldh1a2 wurde hybridisiert. Die spezifische Markierung kann in den Augen, Hinterhirn, Brustflosse Knospe Primordien und Somiten zu sehen. Anterior ist oben, ist hinten auf den Boden. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Ein Zebrafisch-Embryos in den 13 Somiten Stadium der Entwicklung, die mit einer Sonde spezifisch für fgf8a wurde hybridisiert. Die spezifische Markierung in der Telencephalon, dorsalen Zwischenhirn, Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze, Somiten und tailbud gesehen. Ventral ist auf der linken Seite, ist dorsal nach rechts. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. A 22 Stunden nach der Befruchtung Zebrafischembryo, die mit einem Ribosonde spezifisch für pax2a, einem robusten Marker nützlich für die Visualisierung des Nervensystems wurde hybridisiert. Die spezifische Markierung kann in der Aderhaut Fissur, Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze, Ohr-Vesikel und Rückenmarksneuronen gesehen werden. Dorsalansicht mit anterior der linken Seite.

<ol><li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li>
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<li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li>
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</ol>

Wunsch wurde in einer vergleichenden Wirbeltiere Biology Laboratory natürlich verwendet werden, um die Schüler verstehen die Rolle der Genetik in der anatomischen Entwicklung durch die Visualisierung von bekannten Genexpressionsmuster. Für den ersten Teil des Kurses, durchgeführt Studenten Sezieren von Organismen aus verschiedenen chordate Taxa, so dass sie genügend Zeit, um zu studieren, zu verstehen, Vergleichen und Gegenüberstellen Wirbeltiere Anatomie. Als Einführung in den zweiten Teil des Kurses wurden die Schüler eine formelle Vortrag beschreibt Zebrabärblingentwicklung und Anatomie gegeben. Die Methoden und die erwarteten Ergebnisse des Wunsches Experiment wurden ebenfalls diskutiert. Die Schüler wurden dann leben Zebrafisch auf Somitogenese und prim-6 Stufen der Entwicklung gegeben, und bei 2 und 5 Tage nach der Befruchtung (dpf) unter dem Binokular untersucht. Das war es, den Studierenden ein besseres Verständnis von dem, was Zebrafischembryonen aussehen und welche Arten von morphologischen Veränderungen, die über Ontogenese auftreten. In den nächsten Labor Sitzung wurden die SchülerInnen Zebrafischembryonen in die WISH zuvor hatte ausgeführt gegeben. Sie wurden gebeten, zu studieren und beschreiben die Genexpressionsmuster für jedes Gen von Interesse (Ribosonde verwendet). Embryonen für WISH wurden aus Paarungen zwischen den Mitgliedern einer heterozygoten ace/fgf8a Linie abgeleitet. Basierend auf Mendelschen Vererbung, waren 25% der Embryonen aus der ace/fgf8a Paarungen erwartet, um homozygote Mutanten zu sein und Mängel in vielen der anatomischen Strukturen auf die in diesem Kurs konzentriert aufweisen. Basierend auf den veröffentlichten Berichten und unveröffentlichte Beobachtungen in der Albertson Labor wurden Defekte im Gehirn und unsachgemäße Herzen looping erwartet, aber auch Mängel in den Somiten (Brand et al, 1996;. Albertson und Yelick, 2005; persönliche Beobachtungen). Die Schüler wurden gebeten, alle Proben, Wildtyp (heterozygote Tiere sind nicht von Wildtyp-Geschwister in frühen Stadien der Entwicklung) und homozygote Mutanten zu untersuchen, für jeden Genexpressionsmuster vorgestellt. Sie wurden dann gebeten, Laborberichte beschreiben ihre Ergebnisse zu schreiben, und auf der Grundlage ihrer Kenntnisse der Anatomie und Genetik, wie defekte Gen-Expression kann anatomische Fehlbildungen gefällt haben. Die Schüler schienen diese Laborübung mit Spannung und Neugier zu erhalten. Die meisten hatten noch nie verwendet WISH vor und waren sehr in diesem Teil des Kurses interessiert. Die Schüler fanden die unterschiedlichen Muster der Genexpression in der Zebrafisch-Embryos faszinierend, visualisiert einige sogar beschrieb die Färbungsmuster indem man sie mit bekannten Designs und Symbole, wie ein Smiley-Gesicht. Die daraus resultierende Laborberichte zeigten die Schüler hatten ein allgemeines Verständnis für den Wunsch-Protokoll und die Expression von Genen in bestimmten anatomischen Strukturen. Die Studierenden wurden auch erforderlich, um die spezifischen Funktionen der Gene zu verstehen studierte mit WISH während des Labor (Stickney et al, 2000;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;.. Geetha-Loganathan et al, 2008b ). Es war offensichtlich, aber dass bestimmte Teilnehmer beschränkt Hintergrundwissen über die Signalwege und Gene von Interesse war. Weitere Informationen zu diesen Konzepten in dem Wunsch Einführungsvortrag kann eine willkommene Ergänzung für die Verwendung von WISH in Zukunft Comparative Biology Vertebrate Kurse. Da das Protokoll dauert in der Regel vier aufeinander folgenden Tagen, je nach dem Zeitplan des Kurses können die Schüler nur in der Lage sein, einen Teil des Experiments in der Klasse und der Lehrer muss für den Rest abgeschlossen. In unserem Comparative Biology Wirbeltiere Klasse abgeschlossen Studenten die Färbung Reaktionen im Labor, während die Teaching Assistant durchgeführt alle vorangegangenen Schritte. Wenn es bevorzugt ist, den Schülern durchführen wollen in der Klasse haben, kann das Protokoll in Untereinheiten, die über mehrere Sitzungen Labor durchgeführt werden, können je nach den zeitlichen Rahmen für die Klasse geteilt werden. Wenn es nicht machbar ist für Studenten das gesamte Protokoll durchführen, um, wie es hier war aufgrund der Labor-Sitzung nur einmal in der Woche können die Schüler die Färbelösung zu Beginn der Klasse hinzu, und, je nach Ribosonde verwendet werden, haben die Färbung komplett innerhalb einer Stunde. Die Zeit, die für den Fleck zu entwickeln variiert stark mit jedem Ribosonde und eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen und sollten vor der Klasse vorgegeben werden. Bemerkenswert ist, wenn die Schüler nur dann entwickeln Sie den Fleck in Labor, wird Trainer ist verantwortlich für alle vorhergehenden Schritte, die viel Zeit und Aufwand außerhalb des Klassenzimmers erfordert. Falls gewünscht, könnte eine kürzere Alternative zu wünschen Immunhistochemie mit Antikörper Etiketten Proteinlokalisierung visualisieren, aber in dieser Zeit, sind Zebrafisch-spezifische Antikörper für Entwicklungsbiologie Gene nicht ohne weiteres verfügbar. Eine weitere Möglichkeit wäre, WISH auf verschiedenen Wirbeltierarten durchführennd haben die Schüler vergleichen die Expressionsmuster der gleichen Gene in verschiedenen Organismen (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. Schwellenländer Modellorganismen, 2008; Schwellenländer Modellorganismen, 2010). Das übergeordnete Ziel der Verwendung von WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology Kurses war es, die Studierenden, wie molekularbiologische Techniken verwendet, um anatomische Entwicklung Studie zu demonstrieren. Es bot auch Gelegenheit für Studenten, wie veränderte Genexpression kann nicht nur zu Missbildungen, sondern auch auf evolutionären Wandel führen zu spekulieren. Formalisiert als evolutionäre Entwicklungsbiologie (oft als &quot;Evo-Devo&quot; genannt), soll mit diesem schnell wachsenden Bereich der Studie zur Genotyp und Phänotyp durch die Entwicklung zu verknüpfen und potenzielle mechanistischen Grundlagen der evolutionären Wandel zu erläutern. Mit dem Aufstieg der auf diesem Gebiet sind mehr Ökologen, organismal Biologen und Physiologen Einsatz molekularbiologischer Techniken in ihre Forschung. Wir behaupten, dass die Verwendung von WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology natürlich wird dazu beitragen, den Lehrplan halten, um mit der derzeitigen technologischen und konzeptionellen Fortschritte in der Forschung bisher und eine bessere horizontale Ausrichtung der oberen Ebene der Biologie Kurse durch die Kombination von biologischen Teilfelder zu erleichtern. Darüber hinaus wird diese integrative Ansatz bieten den Studierenden die Möglichkeit, eine Auswahl an biologischen Forschung Techniken in einem Kurs lernen, was zu einer stärker diversifizierten Bildung und die Förderung der Zukunft interdisziplinäre wissenschaftliche Forschung.

<ul><li> Autoclave </li><li> Micro-Zentrifuge </li><li> 37 ° C Inkubator (mit Schüttler) </li><li> 4 ° C Mikro-Zentrifuge </li><li> Wasserbad </li><li> Wirbel </li><li> Gel-Elektrophorese Apparat </li><li> -20 ° C Gefrierschrank </li><li> -80 ° C Gefrierschrank </li><li> Rocker / Schüttler </li><li> 4 ° C Kühlschrank </li><li> Präpariermikroskop (vorzugsweise mit einem Lehr-Bildschirm oder Kamera) </li></ul>

mit whole berg in situ hybridisierung zu molecular biology und organismal link-

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ Hybridisierung (WISH) ist eine verbreitete Technik in molekularbiologischen Laboratorien verwendet werden, um die Genexpression durch die Lokalisierung von spezifischen mRNA-Transkripte innerhalb der gesamten Probe aufsetzen zu studieren. Diese Technik (in Anlehnung an Albertson und Yelick, 2005) wurde in einer oberen Ebene Bachelor Vergleichende Wirbeltiere Biology Laboratory Klassenzimmer an der Syracuse University verwendet. Die ersten zwei Drittel des Comparative Biology Vertebrate Praktikum gab Studenten die Möglichkeit, der Embryologie und der makroskopischen Anatomie von mehreren Organismen, die verschiedene chordate Taxa in erster Linie über traditionelle Sezieren und die Verwendung von Modellen zu studieren. Der letzte Teil des Kurses beteiligt einen innovativen Ansatz zur Lehre Anatomie durch Beobachtung der Entwicklung von Wirbeltieren beschäftigt molekulare Techniken, bei denen Wunsch auf Zebrafisch-Embryos durchgeführt wurde. Eine heterozygote Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 a (fgf8a) Mutantenlinie, ace, verwendet wurde. Aufgrund Mendelschen Vererbung, Kreuzungen ace produziert Wildtyp, heterozygot und homozygot ace/fgf8a Mutanten in einer 1:2:1-Verhältnis. RNA-Sonden mit bekannten Expressionsmuster in der Mittellinie und in der Entwicklung anatomischen Strukturen wie Herz, Somiten, tailbud, Myotom und Gehirn verwendet. WISH wurde mit Zebrafisch auf den 13 Somiten und prim-6 Stufen, mit Studenten der Durchführung der Farbreaktion in der Klasse. Die Studie des Zebrafisch-Embryos in verschiedenen Stadien der Entwicklung gab den Studierenden die Fähigkeit zu beobachten, wie diese anatomischen Strukturen über Ontogenese verändert. Darüber hinaus zeigten einige ace/fgf8a Mutanten unsachgemäße Herzen Looping und Mängel in Somiten und die Entwicklung des Gehirns. Die Schülerinnen und Schüler in diesem Labor beobachtet die normale Entwicklung der verschiedenen Organsysteme mit beiden äußeren Anatomie sowie Genexpressionsmuster. Darüber hinaus identifiziert und Embryonen Anzeige falsche anatomische Entwicklung und Genexpression (dh, putative Mutanten) beschrieben. Für Lehrer an Institutionen, die nicht bereits über die erforderlichen Geräte oder wo die Mittel für Labor-und curriculare Innovation beschränkt sind, können die finanziellen Kosten für die Reagenzien und Geräte ein Faktor zu betrachten, da wird die Zeit und Mühe auf den Teil der benötigten Lehrer unabhängig von der Einstellung. Trotzdem behaupten wir, dass die Verwendung von WISH in dieser Art von Unterricht im Labor Einstellung kann ein wichtiges Bindeglied zwischen Entwicklungsgenetik und Anatomie bieten. Die Entwicklung schreitet voran und die Fähigkeit zur organismischen Entwicklung auf molekularer Ebene Studie wird einfacher, billiger und immer beliebter, viele Evolutionsbiologen, Ökologen und Physiologen Forschungsstrategien im Bereich der Molekularbiologie drehen. Mit WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology Laboratory Klassenzimmer ist ein Beispiel dafür, wie Moleküle und Anatomie kann in einem einzigen Kurs zusammen. Dies gibt oberen Ebene College-Studenten die Möglichkeit, moderne biologische Forschung Techniken, was zu einer stärker diversifizierten Bildung und die Förderung der Zukunft interdisziplinäre wissenschaftliche Forschung der Praxis.

Whole mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (WISH) wurde in einer oberen Ebene Bachelor Vergleichende Wirbeltiere Biology natürlich zusätzlich zu Dissektionen Wirbeltiere eingesetzt. Dies gab den Studierenden die Möglichkeit zu Genexpressionsmuster sowie grobe Anatomie zu studieren und verbindet das Studium der molekularen und organismischen Biologie in einem Kurs.

Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link-

Die Whole-Mount-In-Situ-Hybridisierung (WISH) ist eine gängige Technik in molekularbiologischen Laboren, die verwendet wird, um die Genexpression durch die Lokalisierung von ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Muster der Genexpression in Zebrafischembryonen während bestimmter Entwicklungsstadien zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine mit Digoxigenin markierte Antisense-Riboprobe mit der mRNA des gewünschten Gens hybridisiert wird. Der zweite Schritt besteht in der Detektion der Riboprobe.Unter Verwendung eines Antikörpers gegen Doxycyclin wird der Antikörper an ein alkalische Phosphatase-Enzym konjugiert. Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Färbung durch Zugabe von NBT und BCIP, die mit dem alkalischen Phosphatase-Enzym reagieren und einen unlöslichen violetten Niederschlag ergeben. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, ausreichend gefärbte Embryonen in Methanol zu inkubieren, um unspezifische Färbungen zu reduzieren.Schließlich können Ergebnisse, die Genexpressionsmuster in ganzen Zebrafisch-Embryonen zu bestimmten Entwicklungsstadien zeigen, mithilfe der In-situ-Hybridisierung am Ganzpräparat erhalten werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie traditionellen Unterrichtsdemonstrationen der Histologie oder von Präparationen besteht darin, dass sie den Studierenden die Möglichkeit bietet, konzeptionelle Brücken zwischen Molekularbiologie und Trends in der organismischen Entwicklung und Evolution zu bilden und so ein wirklich integratives Erlebnis zu ermöglichen. Obwohl diese Methoden traditionell zur Untersuchung der Entwicklung einiger Modellorganismen verwendet wurden, lassen sie sich leicht auf andere Nicht-Modellorganismen anwenden, um die Erhaltung von Entwicklungsprogrammen über verschiedene Wirbeltiergruppen hinweg zu verstehen sowie die Stellen zu identifizieren, an denen diese Programme abweichen und zu evolutionären Neuerungen führen.Diese Methode ist möglicherweise unbekannt für Studierende im Grundstudium, sodass einige Studierende anfangs Schwierigkeiten haben könnten, doch das Erlernen dieser Methode wird ihnen bei Forschungserfahrungen im Grundstudium und in fortgeschrittenen Kursen gut zugutekommen. Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie eine Transferpipette, um etwa 50 Zebrafischembryonen in ein Mikroabfallröhrchen zu überführen. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit und pipettieren Sie anschließend 1,5 Milliliter 4 % Paraformaldehyd in das Röhrchen.Stellen Sie das Röhrchen mit den Embryonen über Nacht bei Raumtemperatur auf einen Schüttler. Am nächsten Morgen entfernen und verwerfen Sie das Fixansatzmittel. Geben Sie 1,5 Milliliter Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 hinzu, um die Embryonen zu waschen.Falls erforderlich, verwenden Sie feine Pinzette, um die Embryonen manuell zu beschichten, und eine Transferpipette, um die beschichteten Embryonen in ein sauberes mikrofusiertes Röhrchen zu geben. Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter einer 25 %igen Methanol-PBST-Lösung in das Röhrchen. Nach einer einstündigen Inkubation aspirieren Sie so viel wie möglich dieser Lösung, ohne die Embryonen zu stören.Danach mit 1,5 Milliliter 50 % Methanol in PBST ersetzen und mindestens eine Stunde inkubieren. Schließlich mit 1,5 Milliliter 100 % Methanol ersetzen und bei minus 20 Grad Celsius lagern. Die Embryonen können in Methanol bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden.Wenn bereit zur Verwendung, pipettieren Sie das Methanol aus dem Reaktionsgefäß und entsorgen Sie die Pipette. Geben Sie 50 % Methanol in PBST in das Reaktionsgefäß und inkubieren Sie 10 Minuten lang. Wiederholen Sie diesen Schritt, waschen Sie ein zweites Mal, saugen Sie dann die Lösung ab und wiederholen Sie die Inkubation mit 25 % Methanol in PBST.Spülen Sie abschließend zweimal je 10 Minuten in 100 % PBST. Bereiten Sie eine 10 %ige Wasserstoffperoxidlösung in PBST vor. Geben Sie die Zebrafischembryonen bei Raumtemperatur in diese Lösung, wobei die Kappe des Mikrozentrifugenröhrchens geöffnet bleibt, und belassen Sie sie je nach Alter des Embryos 10 bis 20 Minuten darin. Um eventuelle dunkle Pigmentierung zu entfernen, nehmen Sie mit einer Transferpipette die Wasserstoffperoxidlösung vorsichtig ab und entsorgen Sie sie.Spülen Sie die Embryonen mehrmals mit 1,5 Milliliter PBST, um die Reaktion zu stoppen. Verdünnen Sie eine 50 Milligramm pro Milliliter Stammlösung von Proteinase K im Verhältnis 1 zu 5.000 in PBST. Typischerweise ein Mikroliter Proteinase K in 4,999 Milliliter PBST.Entfernen Sie das PBST von den Embryonen. Verwenden Sie eine Transferpipette, um das PBST zu verwerfen, und geben Sie 1,5 Milliliter Proteinase-K-Lösung in das Röhrchen. Inkubieren Sie die Embryonen je nach Alter für drei bis 15 Minuten bei Raumtemperatur in der Proteinase-K-Lösung.Mehrfach mit PBST waschen, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend das PBST entfernen und die Embryonen zur erneuten Fixierung 30 Minuten bei Raumtemperatur in 4% Formaldehyd einlegen, das Para-Formaldehyd mit einer Transferpipette entfernen und entsorgen. 1,5 Milliliter PBST zu den Embryonen hinzufügen und fünf Minuten lang waschen.Pipettieren Sie vorsichtig das PBST aus dem Röhrchen und entsorgen Sie es. Wiederholen Sie die Waschung mit zwei weiteren Portionen PBST. Fahren Sie anschließend mit der Rip-Probe-Hybridisierung fort, erwärmen Sie das Wasserbad auf 70 Grad Celsius vor und bereiten Sie die Prähybridisierungslösung vor.Verwenden Sie dann eine Transferpipette, um die PBST zu entfernen und zu verwerfen. Tauchen Sie die Embryonen in 0,5 Milliliter Prähybridisierungslösung ein und inkubieren Sie sie 2 bis 3 Stunden im 70 °C warmen Wasserbad, wobei darauf geachtet werden muss, die Embryonen nicht zu stören.Pipettieren Sie die Vorhybridisierungslösung aus dem Mikroabfallröhrchen und entsorgen Sie sie. Pipettieren Sie vorsichtig 0,5 Milliliter Hybridisierungslösung in das Röhrchen. Geben Sie dann schnell zuvor synthetisiertes Doxygen in beschriftetes Ribo hinzu.Verwenden Sie für die Sonde im Reaktionsgefäß Ribo-Sonden in Konzentrationen im Bereich von etwa einem Mikrogramm pro Milliliter. Inkubieren Sie über Nacht bei 70 Grad Celsius. Bereiten Sie am nächsten Tag Lösungen mit 75 %, 50 % und 25 % PHS in zweifacher Salin-Natriumcitratlösung sowie zweifache SSC- und 0,2-fache SSC-Lösungen vor.Erwärmen Sie weitere Lösungen im Wasserbad bei 70 Grad Celsius. Sobald die Lösungen 70 Grad Celsius erreicht haben, nehmen Sie sie aus dem Wasserbad heraus. Saugen Sie dann die Hybridisierungslösung aus dem Röhrchen ab und entsorgen Sie sie.Fügen Sie 0,5 Milliliter jeder warmen P-H-S-S-S-C-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Embryonen in jeder Lösung 10 Minuten bei 70 Grad Celsius. Schließlich inkubieren Sie die Embryonen in der 0,2-fachen SSC-Lösung bei 68 Grad Celsius für 30 Minuten. Aspirieren Sie die 0,2-fache SSC-Lösung aus dem Röhrchen und entsorgen Sie sie.Die Embryonen 10 Minuten bei Raumtemperatur in 1,5 Milliliter Malpuffer mit pH 7,5 inkubieren. Dies wiederholen und ein zweites Mal waschen. Die Blockierungslösung gemäß dem schriftlichen Protokoll herstellen.Überführen Sie die Embryonen in MAB in jede Vertiefung einer 12-Loch-Platte. Entfernen Sie überschüssiges MAB und pipettieren Sie ein bis zwei Milliliter Blockierungslösung in jede Vertiefung.Gut bei Raumtemperatur unter Rühren mindestens drei Stunden inkubieren. Das Antigen im ersten Antikörper im Verhältnis 1:2000 in der verbleibenden Blockierungslösung verdünnen. Bei Raumtemperatur mindestens drei Stunden unter sanfter Bewegung inkubieren.Unter Beachtung der Embryonen vorsichtig die Blockierungslösung aus den Vertiefungen der Platte abpipettieren und entsorgen. Die zuvor zubereitete Anti-Doxygen-Lösung in Antikörper- und Blockierungslösung vorsichtig in die Vertiefungen pipettieren und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Am nächsten Tag die Embryonen in fünf Wechseln mit jeweils 1,5 Milliliter Malpufferpuffer waschen. Die Embryonen zunächst fünf Minuten im Malpufferpuffer inkubieren lassen. Danach Pufferwechsel durchführen und zweimal zehn Minuten inkubieren.Ein Intervall von 30 Minuten und ein Intervall von 60 Minuten. Den letzten Waschschritt mit Meic-Säure-Puffer aus den Vertiefungen absaugen und die Pipette entsorgen. 1,5 bis zwei Milliliter alkalische Phosphatase-Puffer in die Vertiefungen geben und fünf Minuten lang inkubieren.Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal. Entfernen Sie den alkalischen Phosphatase-Puffer und geben Sie 1,5 bis zwei Milliliter Färbelösung in die Vertiefungen. Wickeln Sie die gesamte Platte in Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen, und schwenken Sie sie vorsichtig alle 20 Minuten. Beenden Sie die Agitation und untersuchen Sie die Embryonen unter dem Stereomikroskop, um zu überprüfen, ob eine ausreichende Färbung erreicht wurde. Sobald eine ausreichende Färbung sichtbar ist, pipettieren Sie die Färbelösung aus den Vertiefungen und entsorgen Sie sie. Ersetzen Sie sie durch PBST, um die Färbereaktion zu stoppen.Wiederholen Sie den Waschvorgang mit einer weiteren Portion PBST, pipettieren Sie das PBST aus den Vertiefungen und verwerfen Sie es, um die Embryonen zu dehydrieren. Geben Sie 1,5 bis zwei Milliliter 25 % Methanol in PBST in die Vertiefungen und inkubieren Sie 10 Minuten lang. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal mit jeweils 50 % Methanol in PBST, wobei jede Waschung weitere 10 Minuten dauert. Überführen Sie anschließend die Embryonen in 100 % Methanol und inkubieren Sie mindestens zwei Stunden lang, um unspezifische Färbungen zu reduzieren.Nach der Inkubation das Methanol mit einer Pipette aus den Vertiefungen entfernen und verwerfen, um die Embryonen erneut zu hydratisieren. Jeweils zweimal 10 Minuten lang mit 50 % Methanol in PBST waschen, gefolgt von 25 % Methanol in PBST. Anschließend zweimal jeweils 10 Minuten mit 100 % PBST waschen.Überführen Sie die gefärbten Embryonen schließlich unter Verwendung einer abgestuften Serie von Waschschritten in eine 80 %ige Glycerinlösung in PBST und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis die Beobachtung erfolgt. Bei korrekter Durchführung weist das Auftreten einer violetten Färbung am Zebrafisch-Embryo auf die Expression des Zielgens hin. Dieses Bild zeigt einen Zebrafisch-Embryo 24 Stunden nach der Personalisierung, der mit RIBA-Sonden, die spezifisch für AAL DH one A zwei sind, hybridisiert wurde. Eine spezifische Färbung ist in den Augen, dem Hinterhirn, dem Brustflossenknospen, der Ria und den Somiten zu erkennen.Dieses Bild zeigt einen Zebrafisch-Embryo im Stadium von 13 Somiten, der mit einer Sonde spezifisch für FGF eight A hybridisiert wurde. In diesem Fall ist eine spezifische Färbung in der tline kelon, dem dorsalen Dion, dem Kelon-Mittelhirn, der Grenze zwischen Mittel- und Hinterhirn, den Somiten und dem Schwanzkegel zu sehen. Dieses Bild zeigt einen Zebrafisch-Embryo 22 Stunden nach der Befruchtung, der mit der Sonde spezifisch für PAX two A hybridisiert wurde. Ein robuster Marker, der zur Visualisierung des Nervensystems nützlich ist.Spezifische Färbungen sind im Choroideauspalt, Mitthirn, Grenze zwischen Mittel- und Hinterhirn, otikulärem Vesikel und den Neuronen des Rückenmarks sichtbar, sobald die Technik beherrscht wird. Diese Technik kann je nach Stundenplan des Kurses so modifiziert werden, dass sie über mehrere Laborveranstaltungen durchgeführt wird. Der Dozent muss möglicherweise Zeit und Aufwand außerhalb des Unterrichts investieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, hoffen wir, dass Sie sich wohler dabei fühlen, die Ganzpräparat- und C2-Hybridisierung in ein Laborpraktikum für Studierende zu integrieren. Wenn Studierende diese Fähigkeiten erwerben, kann das Wissen über diese Technik ihren Übergang zu forgeschrittenen Kursen oder zur graduierten Forschung erleichtern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Entwicklungsbiologie. Hier präsentieren wir ein hochauflösendes Doppel-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll zur Analyse der genauen Expressionsmuster eines einzelnen Gens und zur Bestimmung der Überlappung der Ausdruck Domains von zwei Genen. Wir gehören eine Propidiumiodid nukleare Gegenfärbung des Gewebes Organisation hervorzuheben.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Eine Kombination verschiedener Techniken, um die Datenerfassung von der Maus Gewebe zu maximieren wird vorgestellt.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Durch die Kombination von Methoden zur RNA whole...

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Der Zebrafisch, einem kleinen tropischen Fischen, hat sich zu einem beliebten Modell zum Studium der Genfunktion während Wirbeltiere Entwicklung und Krankheit. Die zeitliche und räumliche Expression von Zielgenen kann bestimmt werden...

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

Wir beschreiben eine Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) Verfahren in intakten Drosophila-Embryos eine gleichzeitige und spezifischen Nachweis von drei verschiedenen mRNA-Verteilungsmuster durch Kontrastfarbe Niederschläge.

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Dieses Video Artikel beschreibt eine einfache In - vivo - Methodik , die verwendet werden können , um systematisch und effizient Komponenten komplexer Signalwege und regulatorische Netzwerke in vielen wirbellosen Embryonen zu charakterisieren.

Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als<em&gt; In Vivo</em&gt; Entwicklungsmodelle für komplexe Zell-zu-Zell-Signalnetzwerk Wechselwirkungen Studieren

Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Genexpression in embryonalen Astyanax Cavefish. Dieser Ansatz wurde mit dem Ziel der Maximierung der gen-Expression-Signal, bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Hintergrundfärbung entwickelt.

Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen

Lernen Sie Whole Mount In Situ Hybridisierung zur Untersuchung von Genexpressionsmustern in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode verbindet molekulare und organismische Biologie für die Entwicklungsbiologie.

Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link-

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