Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, große Zahlen menschlicher NK-Zellen schnell zu vermehren. Beginnen Sie ex vivo mit der Isolierung von pBMCs oder NK-Zellen aus einem Buffy-Coat- oder Vollblutprobe. Anschließend koinkubieren Sie PBMCs mit künstlichen antigenpräsentierenden Zellen zur Expansion der NK-Zellen.

Das Kulturmedium, ergänzt mit IL-2, dient zur Erhaltung der NK-Zellkultur über einen Zeitraum von drei Wochen mit wöchentlichen Stimulationen mittels aAPCs, wobei darauf zu achten ist, die Anzahl der NK-Zellen unter 1 × 10⁶ pro Milliliter Kulturmedium zu halten. Abschließend wird die funktionelle Wirksamkeit der expandierten NK-Zellen mittels eines nicht-radioaktiven Zytotoxizitätsassays überprüft. Eine typische Ausbeute an NK-Zellen nach diesem Expansionsverfahren beträgt nach 21 Tagen eine mediane Expansion um den Faktor 21.000; diese Zellen weisen eine hohe Zytotoxizität gegenüber verschiedenen Tumoren auf, wie durch einen Kalziumfreisetzungsassay bestimmt wurde.

Dieses Verfahren kann eine zentrale Fragestellung im Bereich der NK-Zellbiologie beantworten, da es historisch gesehen äußerst schwierig war, große Mengen an NK-Zellen zu gewinnen. Diese Technik hat Auswirkungen auf die Immuntherapie menschlicher Krebserkrankungen, da die Erzeugung ausreichender Mengen an NK-Zellen für eine solche Therapie bisher sehr schwierig war. Die Demonstration dieses Verfahrens wird Cecily, die leitende wissenschaftliche Assistentin in meinem Labor, durchführen, um P BMCs aus Blut von gesunden Spendern zu gewinnen.

Üblicherweise wird als Quelle der Buffy-Coat aus der Blutbank verwendet. Zunächst wird PBS hinzugefügt, um das Volumen des Buffy-Coats auf 140 Milliliter einzustellen. Anschließend werden 35 Milliliter der Probe auf 15 Milliliter Fial-PA geschichtet und für die Gradientenseparationszentrifugation 20 Minuten bei 400 ×g zentrifugiert.

Ohne Unterbrechung. Gewinnen Sie die P-BMCs vorsichtig von der Plasmagrenzfläche der Fial-PA und stellen Sie das Röhrchen mit den Erythrozyten beiseite, um es später zu verwenden. Waschen Sie die P-BMCs dreimal mit PBS, wobei jedes Mal bei 400 ×g für 10 Minuten zentrifugiert wird.

Verwenden Sie diesen Anteil der P BMCs zur Expansion von NK-Zellen. Kehren Sie nun zur Gradientenröhre zurück. Aspirieren Sie das Fi.

Rufen Sie die Erythrozyten an und überführen Sie sie in zwei 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen; waschen Sie sie mit PBS, das bis zur 50-Milliliter-Marke zugegeben wird. Nach der Zentrifugation aspirieren Sie den Überstand, indem Sie die Oberfläche der Erythrozytenschicht abschöpfen. Um Granulozyten zu entfernen.

Führen Sie drei Waschschritte durch, resuspendieren Sie die Erythrozyten anschließend in einem gleichen Volumen von Else's Lösung und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius bis zu einem Monat lang. Dieser Erythrozytenanteil kann zur Rosetten-SEP-Reinigung von NK-Zellen am Ende von zweiwöchiger Expansion verwendet werden. Um funktionelle NK-Zellen effizient ex vivo zu expandieren, verwenden Sie K562-Klon-9-Zellen mit membrangebundenem IL-21, im Folgenden als K562 bezeichnet.

Klon neun IL-21 wird als künstliche antigenpräsentierende Zelle verwendet. Zählen Sie zunächst PBMCs und berechnen Sie das Volumen für fünf mal 10 hoch sechs Zellen, die für die NK-Zell-Expansion ausgesät werden sollen, pro fünf mal 10 hoch sechs PBMCs. Bestrahlen Sie 10 mal 10 hoch sechs K562-Klon-neun-IL-21-Zellen mit einem Gamma-Bestrahlungsgerät bei 100 Gray. Bestrahlte Zellen können auch für die spätere Verwendung eingefroren werden. Waschen Sie die vorbestrahlten Zellen nun mit PBS und resuspendieren Sie sie in NK-Zell-Expansionsmedium.

Stellen Sie nun ein Verhältnis von zwei zu eins bestrahlter Zellen zu PBMCs in 40 Milliliter NK-Zell-Expansionsmedium her und platzieren Sie den T-75-Flasche aufrecht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid am dritten Tag. Gewinnen Sie die stimulierten Zellen durch Zentrifugation bei 400 × g für fünf Minuten und ersetzen Sie die Hälfte des Mediums durch frisches NKEM, um die Kultur weiterzuführen. Wiederholen Sie einen Mediumwechsel am fünften Tag. Am Ende einer Woche zählen Sie die Anzahl der Zellen, stellen fünf mal 10 hoch fünf Zellen für die Phänotypisierung per Durchflusszytometrie beiseite und bestrahlen Sie ein Verhältnis von eins zu eins von K562.

Klonen Sie neun IL-21-Zellen, um deren Zellen zu vermehren, und kombinieren Sie anschließend die Zellen in NK-Zell-Expansionsmedium mit insgesamt 2,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter. Bringen Sie die Zellen nun in T-75-Flaschen aus und kultivieren Sie sie weiter; passagieren Sie die Zellen am Tag 10 und Tag 12 in NK-Zell-Expansionsmedium mit 2,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter bis zum Tag 14 der Expansion. Zählen Sie die Zellen erneut und phenotypisieren Sie eine Probe mittels Durchflusszytometrie.

Reinigen Sie diese aus PBMCs stammende Zellvermehrung mithilfe des Rosetten-SEP-Reinigungsprotokolls und überprüfen Sie die Reinheit der NK-Zellen durch Durchflusszytometrie-Phänotypisierung. Führen Sie eine dritte Stimulation der gereinigten NK-Zellen mit einem Verhältnis von eins zu eins von bestrahlten K562-Klon-neun-IL-21-Zellen durch. Analysieren Sie abschließend am Tag 21 die amplifizierten NK-Zellen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines vollständigen Antikörpersets zur Phänotypisierung.

Tiefgefrieren Sie Zellbestände in FBS mit 10 % DMSO bei einer maximalen Dichte von fünf mal 10 hoch 7 Zellen pro Röhrchen. Verwenden Sie für den Zytotoxizitätsassay entweder frische oder gefrorene NK-Zellen. Wenn gefrorene NK-Zellen verwendet werden, tauen Sie zunächst das Röhrchen mit NK-Zellen auf und säen Sie sie 24 Stunden lang in NKEM aus, um der Zellerholung am Tag des Assays Rechnung zu tragen; resuspendieren Sie 10 hoch 6 Zielzellen in einem Milliliter NKEM, das Calcium enthalten, und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit gelegentlichem Schütteln in einer UBO-96-Well-Platte. Geben Sie jeweils 200 Mikroliter NK-Zellen, die bei einer Konzentration von ein mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter suspendiert sind, im Triplikat hinzu und führen Sie die serielle Verdünnung der Zellen wie angegeben durch.

Nach einer Stunde der Kalziumbeladung die Zielzellen zweimal durch Zentrifugation fünf Minuten bei 400 × g in NK-Zell-Expansionsmedium waschen. Die Zielzellen erneut zählen und in einer Konzentration von einer mal 10 hoch 5 Zellen pro Milliliter resuspendieren. 100 Mikroliter der Zielzellen in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte geben und eine Minute bei 100 × g zentrifugieren, um den Zellkontakt herzustellen; anschließend vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.

Um das freigesetzte Calcium gleichmäßig zu suspendieren, mischen Sie die Kultur vorsichtig durch Pipettieren, zentrifugieren Sie die Zellenpellets bei 100 ×g für fünf Minuten und übertragen Sie 100 Mikroliter des Überstandes in eine neue flache 96-Well-Platte, wobei Sie gegebenenfalls Blasen vermeiden. Stechen Sie gegebenenfalls entstehende Blasen mit einer feinen Nadel auf. Messen Sie die Platte mit einem fluoreszenzbasierten Plattenreader, der auf einen Anregungsfilter von 485 Nanometern und einen Emissionsfilter von 530 Nanometern eingestellt ist.

Berechnen Sie die prozentuale spezifische Lyse. Typischerweise ergibt die Expansion von fünf mal 10 hoch 6 PBMC, isoliert aus Buffy Coat, zwischen ein mal 10 hoch 9 und 10 hoch 10 NK-Zellen. Die expandierten NK-Zellen exprimieren verschiedene NK-Zellrezeptoren, die mit den nicht expandierten primären NK-Zellen im Buffy Coat vergleichbar sind.

NK-Zellen können zwei bis 18 % der PBMC am Tag 14 ausmachen. Die Rosetten-SEP-Reinigung der expandierten Zellen kann 40 bis 70 % der im Kulturansatz vorhandenen NK-Zellen mit einer Reinheit von 99 %, angegeben durch CD drei, zurückgewinnen. Negativ für CD 56 und positiv für expandierte NK-Zellen wurde eine Zytotoxizität gegenüber einer Reihe von Tumorzelllinien nachgewiesen, einschließlich Neuroblastom, A ML Osteosarkom und Melanom.

Hier wird die repräsentative A ML-abhängige Zerstörung als prozentuale spezifische Lyse dargestellt. Das Live-BIOT-Video zeigt die Zerstörung der Neuroblastomzelllinie CHP 134 durch NK-Zellen, die mit Calcium am beladen wurden, nach diesem Verfahren. Andere Methoden wie die Analyse der Zytokinproduktion durch NK-Zellen und die adaptive Übertragung in tierischen Tumormodellen können durchgeführt werden, um weitere Fragen bezüglich der Funktionen der NK-Zellen zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man große Mengen an NK-Zellen vermehren und reinigen kann. Dies kann direkt aus peripheren mononukleären Blutzellen erfolgen, gefolgt von der Reinigung der NK-Zellen, oder die Vermehrung kann mit mittels Rosettenmethode gereinigten NK-Zellen initiiert werden. Zu Beginn liefert ein typischer Buffy Coat 15 bis 40 Millionen NK-Zellen, die alle zur Vermehrung einer sehr großen Anzahl an NK-Zellen unter Verwendung des in dieser Methode beschriebenen Schemas genutzt werden können.