Ein einfacher Weg zu Ethanol Empfindlichkeit in Flies Measure

Hallo, ich bin Thomas Maples aus dem Labor von Dr. Adrian Rothenfluh in der Abteilung für Psychiatrie am UT Southwestern Medical Center in Dallas. Heute werde ich eine einfache Methode zur Bestimmung der Empfindlichkeit von Fliegen gegenüber Ethanol-induzierter Sedierung demonstrieren. Dieser Test basiert auf dem Verlust des Aufrechte-Haltungs-Reflexes und der Gehfähigkeit von Fliegen nach Exposition gegenüber Ethanol.

Dieses Maß kann verwendet werden, um Unterschiede in der Alkoholempfindlichkeit zwischen verschiedenen Stämmen von Drosophila und Mutanten zu bestimmen. Wir können diesen Test auch nutzen, um eine Toleranz bei Fliegen zu induzieren, wobei Toleranz eine verminderte Reaktion auf Alkohol nach wiederholter Exposition bedeutet. Beginnen wir.

Für dieses Experiment benötigen Sie die folgenden Gefäße mit jeweils acht Fruchtfliegen, die Sie ein oder zwei Tage zuvor gesammelt haben. Die Expositionen können entweder mit Männchen oder Weibchen durchgeführt werden.

Jedoch sollte jedes Gefäß nur ein Geschlecht enthalten. Ein leeres Futtergefäß, das keine Fliegen enthält, eine Rasierklinge, zwei Stopfen aus einem baumwollähnlichen Material. Falls Sie diese Art von Stopfen nicht haben, können Sie auch Wattebällchen, eine 1000-Mikroliter-Mikropipette mit Spitzen, 200-prozentigen Ethanol, der Lebensmittelfarbe enthält (erhältlich in jedem Lebensmittelgeschäft), und einen Timer verwenden.

Als Erstes müssen wir eine Expositions­kammer herstellen, in der wir die Fliegen Ethanol aussetzen und ihre Beweglichkeit überwachen. Um diese Kammer herzustellen, schneiden Sie zunächst einen Vial­stopfen mit einer Rasierklinge der Länge nach in zwei Hälften. Dann schieben Sie eine der Hälften bis zum Boden eines Vials, wodurch das Futter bedeckt wird.

Dadurch entsteht eine ebene, nicht klebrige Oberfläche, auf der die Fliegen laufen können. Wenn Sie einen Wattebausch verwenden, drücken Sie ihn gleichmäßig nieder und versuchen Sie, ihn so glatt wie möglich zu machen, damit die Fliegen nicht in den Wattefasern hängen bleiben. Wenn Sie mehrere Kammern anlegen, stellen Sie sicher, dass das Futter und der Vialstopfen in jeder Kammer denselben Platz einnehmen.

Dadurch wird sichergestellt, dass die Fliegen in jeder Kammer dem Alkohol in gleichem Volumen ausgesetzt sind. Mit etwas Übung lassen sich leicht drei Gefäße mit Fliegen parallel behandeln. Sobald die Expositions-Kammern hergestellt sind, können wir die Fliegen nun Alkohol aussetzen.

Überführen Sie zunächst ein Gefäß mit acht Fliegen in eine Expositions­kammer und verschließen Sie die Kammer mit dem Stopfen aus dem ursprünglichen Fliegen­gefäß. Pipettieren Sie anschließend 500 µL gefärbten Ethanol der gewählten Konzentration auf ein Ende eines baumwoll­ähnlichen Gefäßstopfens. Ersetzen Sie dann den Stopfen der Expositions­kammer durch den mit Ethanol beschichteten Stopfen, wobei das mit Ethanol beschichtete Ende in die Kammer hineinragt.

Starten Sie unmittelbar nach dem Hinzufügen des mit Ethanol beschichteten Pfropfens zur Expositions­kammer einen Timer. Der Farbstoff im Ethanol hilft sicherzustellen, dass das Ethanol in Richtung der Expositions­kammer und nicht in Richtung der Vialwand zeigt. Dies ist besonders wichtig, wenn Sie Wattebäusche anstelle von Buzz-Pfropfen verwenden, da jede Seite eines Wattebäuschens in das Vial weisen kann.

In dieser Exposition verwenden wir 100 % Alkohol, der nun in die Expositions­kammer diffundiert, wo die Fliegen ihn aus der Luft einatmen. Jede Minute nachdem der mit Ethanol beschichtete Stopfen der Expositions­kammer hinzugefügt wurde, zählen wir, wie viele Fliegen unbeweglich geworden sind, das heißt, sie können sich nicht mehr umdrehen und laufen. Je länger die Fliegen beweglich bleiben, desto resistenter sind sie in jedem einminütigen Intervall.

Verblüffen Sie die Fliegen, indem Sie die Kammer auf die Bank klopfen, um sicherzustellen, dass alle Fliegen, die sich bewegen können, sich tatsächlich bewegen. Beobachten Sie die Fliegen 10 Sekunden lang nach dem Klopfen, um ihnen Zeit zu geben, sich zu bewegen oder sich umzudrehen, und zwar für jedes einminütige Intervall. Notieren Sie, wie viele der acht Fliegen zu Beginn des Experiments regungslos sind.

Die meisten Fliegen laufen normalerweise schnell die Wand des Gefäßes hinauf, nachdem sie erschreckt wurden. Nach etwa sechs Minuten Exposition gegenüber 100 %igem Ethanol beginnen sie, sich träge zu bewegen, manchmal auch unregelmäßig, bis 12 Minuten erreicht sind. Die meisten Fliegen verharren in Ruhe, unfähig zu laufen oder sich von der Rückenlage wieder umzudrehen.

Nur Fliegen, die in der Lage sind, sich aufzurichten und zu laufen, sollten als beweglich gezählt werden. Fliegen, die lediglich ihre Beine oder Flügel an Ort und Stelle bewegen, sollten als unbeweglich gezählt werden. Fliegen, die während des gesamten Beobachtungszeitraums auf dem Rücken liegen bleiben, sollten ebenfalls als unbeweglich gezählt werden, da ihre Unfähigkeit, sich aufzurichten, ein Zeichen von Intoxikation ist. Fliegen, die während der gesamten zehnsekündigen Beobachtungszeit ihre Flügel heftig vibrieren lassen, sollten ebenso als unbeweglich gezählt werden, auch wenn sie ihre Position wechseln. Die überwiegende Mehrheit dieser Fliegen verharrt zwischen Phasen schneller Flügelbewegungen unbeweglich.

Zusammenfassend sind Fliegen, die sich umdrehen und laufen können, beweglich, während Fliegen, die sich nicht umdrehen können, ihre Beine und Flügel an Ort und Stelle bewegen oder ihre Flügel rasch vibrieren lassen, stationär sind. Wenn wir diese Regeln anwenden, stellen wir fest, dass immer mehr Wildtyp-Fliegen mit zunehmender Expositionszeit gegenüber Ethanol-Dämpfen stationär werden. Der Wert, den dieser Test zur Quantifizierung der Ethanol-Empfindlichkeit verwendet, ist die mediane Sedierungszeit oder MST.

Wir definieren MST als die Minuten der Ethanol-Exposition, die erforderlich sind, damit vier der acht Fliegen in der Expositions­kammer bewegungslos werden. Dieser Wert lässt sich leicht bestimmen, wenn genau vier Fliegen zu einem bestimmten Beobachtungs­zeitpunkt regungslos sind. Wenn beispielsweise nach 11 Minuten Exposition genau vier Fliegen stillhalten, beträgt der MST 11.

Wenn nach 11 Minuten Exposition genau vier Fliegen unbeweglich sind und dies nach 12 Minuten weiterhin zutrifft, dann wird der erste Wert als Zeitpunkt genommen, zu dem die Fliegen erstmals ihre ST erreichen. Falls zu einem bestimmten Beobachtungszeitpunkt nicht genau vier Fliegen unbeweglich sind, muss der Zeitpunkt, zu dem vier Fliegen stationär wurden, linear interpoliert werden. Beispielsweise kann, wenn die Anzahl der unbeweglichen Fliegen zwischen neun und zehn Minuten Exposition von drei auf fünf ansteigt, grafisch ermittelt werden, dass die MST 9,5 beträgt. Die folgenden mit diesem Assay erhobenen Daten zeigen, dass dieses experimentelle Design eine genaue Methode zur Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber Ethanol darstellt.

Bei den folgenden Experimenten wurden sechs bis acht Vials verwendet, was innerhalb der Balken angegeben ist. Die MST von männlichen Wildtyp-Fliegen, die 100 % Ethanol ausgesetzt waren, beträgt etwa 11 Minuten mit einem geringen Standardfehler. Die Variabilität von Tag zu Tag ist gering und meist nicht statistisch signifikant, dennoch empfehlen wir, Ihre Experimente und Kontrollen am selben Tag parallel durchzuführen.

Beachten Sie außerdem, dass die Fliegen, die am Tag A und am Tag B exponiert wurden, nicht dieselben Individuen sind. Es handelt sich um Geschwister, die denselben genetischen Stamm repräsentieren. Männliche und weibliche Fliegen, die 100 % Ethanol ausgesetzt waren, zeigen keinen Unterschied in der mittleren Überlebenszeit (MST). Dennoch empfehlen wir, sich auf ein einziges Geschlecht zu beschränken.

Wenn wir männliche und weibliche Fliegen steigenden Dosen Ethanol aussetzen, erhalten wir eine deutliche Dosis-Wirkungs-Kurve, die eine statistisch signifikante Abnahme der MST in Abhängigkeit von der erhöhten Ethanolkonzentration zeigt. Dieser Test reproduziert außerdem zuvor veröffentlichte Phänotypen, die mit einer aufwändigeren Ethanolverdampfungsanordnung gemessen wurden: Fliegen mit der right-rabbit-one-Mutation zeigten eine signifikante Zunahme der MST. Dieser Anstieg wurde sowohl bei 100 % als auch bei 90 % Ethanol beobachtet.

Mit diesem Assay können wir auch Ethanol-Toleranz bei Fliegen induzieren und messen. Toleranz ist definiert als eine Verringerung der Reaktion auf Alkohol nach einer Vorbehandlung mit Alkohol zur Induktion der Toleranz. Exponieren Sie eine Röhre mit Fliegen für etwa die doppelte Zeit ihrer MST gegenüber Ethanol.

Beispielsweise setzen wir diesen männlichen Berliner Wildtyp-Stamm 24 Minuten lang 100%igem Ethanol aus. Nach der Exposition klopfen Sie die acht Fliegen vorsichtig zurück in ihr Nahrungsröhrchen, in dem sie sich vier Stunden lang erholen können. Notieren Sie die ursprüngliche MST der Fliegen auf ihrem Röhrchen nach vierstündiger Erholungsphase, setzen Sie dieselben Fliegen erneut derselben Dosis Ethanol aus und erfassen Sie ihre zweite MST.

Wie Sie an diesem Diagramm sehen können, ist die MST bei der zweiten Exposition gegenüber Ethanol signifikant höher als die MST bei der ersten Exposition, was darauf hinweist, dass die Fliegen eine Toleranz gegenüber den sedierenden Wirkungen von Ethanol entwickelt haben. Ein Maß für die Toleranz wird berechnet, indem die zweite MST einer bestimmten Fläschchenportion Fliegen durch die erste MST derselben Fliegen dividiert und eins subtrahiert wird. Der Wert wird als prozentuale Toleranz angegeben, was in unserem Fall etwa 50 % beträgt. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.