Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Methoden für die Biolumineszenz-Bildgebung von bakteriellen Infektionen in lebenden Tieren beschrieben. Krankheitserreger werden geändert, um auszudrücken Luciferase ermöglicht optische Ganzkörperbildgebungssysteme von Infektionen in lebenden Tieren. Tiermodelle können mit Luciferase exprimierenden Krankheitserreger infiziert werden und die daraus resultierende Verlauf der Erkrankung visualisiert in Echtzeit durch Biolumineszenz-Bildgebung.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein quantitatives Bild einer Infektion bei lebenden Tieren zu erhalten, das eine Lokalisierung des infizierenden Organismus in den Geweben und Organen des Wirts ermöglichen kann. Anästhesierte Mäuse werden zunächst intratracheal mit biolumineszierenden Bakterien infiziert. Infizierten Mäusen wird dann Luciferian injiziert, wodurch eine Live-Bildgebung im IVIS-System durchgeführt werden kann.

Sobald Ganzkörperbilder aufgenommen wurden, werden die infizierten Lungen entnommen. Es kann eine Bildgebung der isolierten Organe durchgeführt werden, um die tatsächliche Lokalisation des Erregers nachzuweisen. Nach der Bildgebung werden die Lungen homogenisiert und zur Quantifizierung der mikrobiellen Belastung auf bakteriellem Wachstumsmedium verdünnt.

Letztendlich erhalten wir Ergebnisse, die den Ort und die Anzahl der im Wirt vorhandenen Krankheitserreger in Echtzeit anzeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass Krankheitserreger in lebenden Tieren durch Echtzeit-Bildgebung visualisiert und überwacht werden können, was einen Einblick in die räumlichen Ticks mikrobieller Infektionen gibt. Dieses Verfahren wird von Dr. Mihi Chang, einem Postdoktoranden in meinem Labor, und SWAT Cillo, einem Forscher in meinem Labor, demonstriert.

Beginnen Sie mit der intraperitonealen Injektion von sechs bis 12 Wochen alten Klappe C-Mäusen mit einer vorgemischten Anästhesielösung, die 100 Mikrogramm Ketamin und 10 Mikrogramm Xylazin pro Gramm Mausgewicht enthält. Setzen Sie die Mäuse wieder in ihre Käfige, bis das Betäubungsmittel wirkt. Um festzustellen, ob die Anästhesie abgeschlossen ist, drücken Sie den Fußballen jeder Maus zusammen und stellen Sie sicher, dass keine Pedalreflexreaktion auftritt.

Sobald die Tiere vollständig betäubt sind, nehmen Sie eine Maus und legen Sie sie auf die Intubation. Stellen Sie sich auf den Rücken liegend. Befestigen Sie die Beine und Arme der Maus mit Klebeband am Ständer.

Befestigen Sie ein Gummiband am Intubationsständer. Platzieren Sie sie dann unter den oberen Schneidezähnen der Maus. Sobald die Maus bewegungsunfähig ist, ziehen Sie die Zunge mit einer Pinzette vorsichtig aus dem Mund.

Führen Sie anschließend das Spekulum vorsichtig mit dem Otoskop in den Mund der Maus ein und suchen Sie die Kehlkopföffnung, die sich vor der Speiseröhre auf der ventralen Seite des Oropharynx befindet. Sobald die Kehlkopföffnung identifiziert wurde, führen Sie einen 22-Gauge-Katheter mit einem Führungsdraht in die Luftröhre ein, bis die Katheternabe die Schneidezähne erreicht. Entfernen Sie den Führungsdraht und schließen Sie den Katheter an die Kunststoffpumpe an.

Drücken Sie dann Luft in den Katheter. Die Brust der Maus bläht sich auf, wenn die Intubation korrekt ist. Sobald die korrekte Platzierung des Katheters bestätigt wurde, pipettieren Sie 50 Mikroliter biolumineszierende Bakterienlösung in der gewünschten Konzentration in den Katheter und legen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit 50 Mikrolitern Luft an, um die Lösung in die Lunge der Maus zu drücken.

Entfernen Sie zwei- bis dreimal den Katheter und setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig, damit sie sich von der Narkose erholen kann. Bevor Sie die Biolumineszenz-Bildgebung durchführen, betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran. Sobald die Mäuse vollständig betäubt sind, nehmen Sie sie aus der Induktionskammer und tragen Sie vorsichtig optische Salbe auf, um die Augen des Tieres zu schützen.

Während der Bildgebung legen Sie die Mäuse in die Bildgebungskammer und jeweils einen der Nasenkegel auf dem Anästhesieverteiler. Verwenden Sie eine Lichtblende zwischen den Mäusen, um die Reflexion des Lichts zwischen benachbarten Tiermotiven zu verhindern. Zum Schluss injizieren Sie jeder Maus intraperitoneal 150 Mikrogramm pro Gramm Körpergewicht Luzifer.

Lassen Sie den Luzifer 10 Minuten lang im Körper des Tieres verteilen. Beginnen Sie dann mit der Bildgebung. Starten Sie die Live-Imaging-Software und initialisieren Sie das IVIS-Imaging-System.

Um zuerst die Parameter einzustellen, klicken Sie auf Sequenz einrichten. Wählen Sie dann den Lumineszenz- und Fotoaufnahmemodus aus. Wählen Sie fotografische Lumineszenz- und Strukturlichtbilder als Teil der Bildsequenz aus, um die DLIT-3D-Rekonstruktion zu ermöglichen.

Stellen Sie anschließend die Belichtungszeit auf eine Minute ein. Stellen Sie dann das Binning auf mittel und die Blende auf eins ein. Stellen Sie den Anregungsfilter auf "Block" und die Emissionsfilter auf "Öffnen" für die 3D-Rekonstruktion ein, um mehrere Filter mit unterschiedlichen Wellenlängen zu aktivieren.

Um eine genaue Lokalisierung der Signalquelle zu ermöglichen, wählen Sie das FOV aus, das der Anzahl der zu visualisierenden Mäuse entspricht. Nachdem Sie alle Einstellungen definiert haben, klicken Sie im Bildassistenten im Bedienfeld für die Aufnahme auf Hinzufügen, um die Sequenzeinrichtung hinzuzufügen, und klicken Sie auf Erfassen, um die Bildgebungssequenz während der Aufnahme zu starten. Notieren Sie experimentelle Details und Bedingungen im Fenster "Bild bearbeiten" und speichern Sie die Bilder.

Nehmen Sie abschließend die Mäuse aus der Bildgebungskammer und bringen Sie sie in ihre Käfige zurück. Überwachen Sie die Tiere ständig, bis sie sich von der Narkose erholen. Für die Gewebebildgebung werden die Mäuse human eingeschläfert.

Zu diesem Zeitpunkt entnehmen Sie aseptisch die Lungen jeder Maus und übertragen die Organe in eine sterile Petrischale. Platzieren Sie die Petrischale mit den infizierten Lungen in der Bildgebungskammer und nehmen Sie Biolumineszenzbilder auf die gleiche Weise auf, wie zuvor in diesem Video beschrieben. Sobald die Bilder aufgenommen wurden, nehmen Sie die Petrischale aus der Bildgebungskammer und übertragen Sie die Lunge mit einer sterilen Pinzette in ein Röhrchen mit einem Milliliter sterilem PBS, wobei Sie die Lunge zwei bis fünf Minuten lang homogenisieren.

Bereiten Sie die serielle Verdünnung der Lungenhomogenate in sterilem PBS vor. Dann werden 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf Petrischalen mit selektivem Medium aufgetragen. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius, bis Bakterienkolonien deutlich sichtbar sind.

Zählen Sie dann die KBE, um das Ausmaß der Infektion zu beurteilen. Starten Sie die Lebendbild-Software und öffnen Sie die gewünschten Bilddateien aus dem Dateibrowser. In der Werkzeugpalette.

Klicken Sie auf Bild anpassen, um die Korrektur- und Filtereinstellungen sowie die Schwellenwerte für die Farbskala zu ändern. Um die Lumineszenzintensität zu quantifizieren, verwenden Sie die Werkzeuge "Region of Interest" oder "ROI" aus der Pulldown-Liste, wählen Sie "ROI-Formnummer" und "ROI-Größe" aus. Klicken Sie dann auf ROI-Messung und speichern Sie die Ausgabe der quantitativen Daten, um 3D-Bilder zu rekonstruieren.

Laden Sie zunächst die Bildsequenz einschließlich der Bilder mit strukturiertem Licht. Klicken Sie in der Werkzeugpalette auf Oberflächentopographie. Wählen Sie dann in der Pulldown-Liste die Registerkarte Rekonstruieren aus, um eine Oberflächentopografie zu generieren.

Wählen Sie als Nächstes die DILT-3D-Rekonstruktion aus der Werkzeugpalette aus. Klicken Sie in der Pulldown-Liste auf die Registerkarte Eigenschaften und stellen Sie die Gewebeeigenschaften und das Quellenspektrum auf Muskeln ein. Klicken Sie auf die Registerkarte "Analysieren" und wählen Sie die Wellenlänge für die Analyse aus.

Klicken Sie dann auf Start. Wenn Sie alle Einstellungen angepasst haben, klicken Sie auf Rekonstruieren, um die 3D-Analyse zu starten. Wenn die 3D-Rekonstruktion abgeschlossen ist, wählen Sie 3D-Ansicht, um die Ergebnisse anzuzeigen, indem Sie auf die Registerkarte "Ergebnisse" klicken. Photonendichte, Datenvoxel und Algorithmusparameter können angezeigt werden, speichern Sie die Ergebnisse und exportieren Sie die Daten und Bilder zur weiteren Analyse.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, erzeugen die beiden Mäuse rechts, die intratracheal mit 10 bis sechs KBE biolumineszierender Bakterien infiziert waren, ein starkes Signal aus dem Lungenbereich, während die nicht infizierte Maus links dies nicht tut. Eine ähnliche Analyse, bei der nur präparierte Lungen von infizierten Mäusen verwendet wurden, bestätigt, dass die Lumineszenz von der Lunge ausgeht und nicht von einem anderen, eng nebeneinander liegenden Gewebe. Das von der Probe ausgehende Signal kann leicht als Gesamtfluss innerhalb eines interessierenden Bereichs quantifiziert werden.

Eine Tomographie-Analyse bestätigt, dass die Position der Lumineszenz, die in diesen Bildern als rote Kästchen dargestellt wird, in den Bereich fällt, der die Lungen der Maus enthält, wie durch 3D-Rekonstruktion bestimmt. Schließlich zeugt die Ähnlichkeit zwischen der gemessenen Photonendichtekurve auf der linken Seite und der simulierten Photonendichtekurve auf der rechten Seite von der guten Qualität der Rekonstruktion. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Tiere, die mit Präzedenzfällen infiziert sind, abbildet und die Bilder zur Lokalisierung und Quantifizierung der Erinnerung analysiert.