Name: Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie biolumineszente Bakterieninfektionen in lebenden Mäusen mit Luciferase und dem IVIS-System in Echtzeit visualisieren. Diese Methode ermöglicht die Lokalisierung von Pathogenen in Geweben und die Quantifizierung der mikrobiellen Last.

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Die Autoren danken der Cirillo Labor Mitglieder für wertvolle Diskussionen und Unterstützung in dieser Studie. Wir danken Dr. Joshua Hill und dem Labor von Dr. James Samuel um Hilfe bei bei den Dreharbeiten zu diesem Protokoll. Diese Arbeit wurde durch Grant 48523 von der Bill &amp; Melinda Gates Foundation und gewähren AI47866 von den National Institutes of Health gefördert.

1. Pulmonale Infektionen durch intratracheale Intubation <ol><li> Wiegen Mäusen und, optional, Markierungen können an den Ohren zur einfachen Identifizierung vorgenommen werden. </li><li> Anesthetize die Mäuse mit Ketamin (100 ug pro g Maus Gewicht) und Xylazin (10 ug pro g Maus Gewicht) durch intraperitoneale Impfung. </li><li> Legen Mäuse in Käfigen, bis sie vollständig betäubt. Drücken Sie die Pads von den Füßen in die Pedale treten Reflex zu überprüfen. Mäuse sollte reduziert oder Display keine Reflex-Reaktion. </li><li> Legen Sie die Maus auf die Intubation stehen Liegen auf dem Rücken. </li><li> Fix ein Gummiband um eine Intubation zu stehen und sie dann unter die oberen Schneidezähne der Maus. Verwenden Sie Klebeband um Arme und Beine auf die Intubation stehen fix. </li><li> Bewegen Sie tougue aus dem Mund mit einer Pinzette. </li><li> Legen Sie speculum mit octoscope Innere des Mundes und schauen Sie in Oropharynx bis Kehlkopf Öffnung sichtbar ist. </li><li> Advance-Führungsdraht mit cathether in Luftröhre abgedeckt, bis catether Hub ist bei den Schneidezähnen. Entfernen Führungsdraht. Put Luft in cathether zur Brust Expansion zu beobachten und zu bestätigen korrekte Intubation. </li><li> Inject 50 ul bakterielle (in den Abbildungen verwendeten wir Bacillus Calmette Guerin (BCG) zum Ausdruck klicken Käfer rot Luciferase (CBRLuc), in unserem Labor aufgebaut, sondern alle lumineszierenden Bakterienstamm verwendet werden kann) Lösung durch cathether mit einer 1 ml-Spritze. </li><li> Bewegen Sie die Maus in einen Käfig und beobachte sie während aus der Narkose. </li></ol> 2. Tierische Betäubung und Vorbereitung für die Biolumineszenz Imaging Mäuse sind mit Isofluran mit der XGI-8 Gas Aneshesia System. <ol><li> Vor der Inbetriebnahme des XGI-8 Anästhesie-System, wiegen jeweils Aktivkohlefilter Kanister und schreiben das Gewicht und das Datum drauf. Wenn das Gewicht von 50 Gramm mehr als der ursprüngliche Gewicht, ersetzen Sie ihn durch einen neuen Behälter. </li><li> Überprüfen Sie die Isofluran-Ebene in den Verdampfer und füllen Sie ihn, wenn nötig. </li><li> Schalten Sie den Evakuierungspumpe in der Vorderseite des XGI-8 Anästhesie-System und auf 8 lpm (Liter pro minuite). </li><li> Schalten Sie die Sauerstoffzufuhr aus dem Hochdruck-Zylinder und setzen Sie ihn auf 55 psig. </li><li> Schalten Sie den Sauerstoff toggle (grün) auf der Vorderseite der XGI-8 Anästhesie-System. </li><li> Schalten Sie den Gasstrom auf die Bildgebung Kammer auf das Niveau der Gasfluss eingestellt. Set auf 0,25 lpm und schalten Sie dann den Gasstrom. </li><li> Schalten Sie den Gasstrom auf die Narkose Kammer auf das Niveau der Gasfluss eingestellt. Set bis 1,5 lpm und schalten Sie dann Gasstrom. </li><li> Schalten Sie die Isofluran mit dem Verdampfer und setzen auf 2-2,5 Prozent. Die Isofluran Ebene kann je nach der Anzahl der Tiere verwendet und Gewicht sein. </li><li> Legen Sie die Mäuse in der Induktion Kammer und den Deckel schließen. Schalten Sie den Gasstrom auf die Induktion Kammer. Legen Mäuse in der Kammer für 5 bis 10 minuites, bis sie vollständig zu betäuben. </li><li> Bewerben optische Salbe auf die Augen, um die Maus Augen während der Bildgebung zu schützen und setzen die Mäuse in der Imaging-Kammer in eine der Bugspitze über die Betäubung vielfältig. Verwenden Sie leichte Trennwand zwischen Mäusen, um die Reflexion von Licht auf benachbarte Tier Themen zu verhindern. </li><li> Inject Luciferin (150 pg / g Körpergewicht) durch intraperitoneale Impfung. </li></ol> 3. Biolumineszenz-Bildgebung <ol><li> Starten Sie das Leben Imaging Software. </li><li> Wenn das System nicht initialisiert wird, initialisieren Sie die IVIS Imaging Systems. </li><li> Stellen Sie die Parameter für die Bildgebung, indem Reihenfolge Setup in IVIS Erwerb Bedienfeld. Wählen Lumineszenz und fotografieren in Imaging-Modus. Wenn die Option zur Durchführung DLIT 3D-Rekonstruktion erwünscht ist, wählen Sie Foto-, Lumineszenz-und Struktur-Licht Bilder als Teil der Bildsequenz. Set Belichtungszeit von 0,5 sec bis 10 Minuten. Set Binning und F / Stop auf der Grundlage erwarteter Helligkeit der Probe. Set Anregungsfilter zu blockieren und Emissionsfilter zu öffnen, es sei denn, der Planung, dass nur bestimmte Wellenlängen des Lichts zu erwerben. Im Falle von DLIT 3D Verfassung, setzen mehrere Emissions-Filter verschiedener Wellenlängen, um genaue Lokalisierung der Quelle ermöglichen. Set FOV von A bis D in Abhängigkeit von der Anzahl der Mäuse oder Region Tier abgebildet werden. Wählen Sie A und B für 1 Maus, C für 2-3 Mäuse und D für 4-5 Mäuse. </li><li> Klicken Sie auf Hinzufügen in der Image-Assistenten in der Übernahme der Systemsteuerung, um die Reihenfolge Setup hinzuzufügen. </li><li> Starten Bildgebungssequenz indem erwerben. Im Falle von DLIT 3D-Konstruktion, wird lumineszierenden Bilder für mehrere Emissionsfilter bei verschiedenen Wellenlängen erworben werden. Fotografische und strukturiertem Licht Bilder auch erworben werden. </li><li> Bei der Aufnahme des Bildes und bearbeiten Bildebenen Panels sichtbar sein wird. Füllen Sie so detailliert wie möglich für jedes Experiment in Bild ändern, um die einfache Verfolgung von Bildern zu späteren Zeitpunkten zu gewährleisten, und speichern Sie Ihre Bilder. </li><li> ReRemove die Mäuse aus IVIS Bildgebung Kammer und bringt sie in ihre Käfige. Beachten Sie Genesung von einerESTHESIA Mäusen sicher nicht signifikant von den Verfahren betroffen. Die Tiere sollten ständig überwacht werden, bis sie aus der Narkose (in der Regel 1-2 min) vollständig erholen. </li></ol> 4. Ex vivo Imaging und CFU-Analyse für die Quantifizierung von Bakterien in der Lunge <ol><li> Inject Mäuse mit Luciferin intraperitoneal in der gleichen Weise wie für die Bildgebung, kurz vor der Euthanasie. </li><li> Euthanize die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 100 mg / kg pentobarbitol 5 min nach dem Luciferin Injektion. </li><li> Explantation der Lunge von Mäusen und in sterile Petrischalen mit einer sterilen Pinzette und Schere. </li><li> Legen Sie Petrischale mit explantierten Organ in der Bildgebung Kammer und erwerben Biolumineszenz Bilder in der gleichen Weise wie für die ganze Maus. </li><li> Nach der Belichtung, entfernen explantierten Orgel aus Petrischale mit einer sterilen Pinzette und homogenisieren in 1 ml PBS. </li><li> Machen Verdünnungen und Platte Gewebe auf den entsprechenden selektiven Medien. Homogenisierte Gewebe -80 ° C für re-Beschichtung gelagert werden sollte es notwendig sein. Alternativ können homogenisiert Gewebe für RNA oder DNA-Extraktion der bakteriellen Zahlen, die durch qPCR Quantifizierung verwendet werden. </li></ol> 5. Die Analyse der Lumineszenz Imaging <ol><li> Starten Sie "Living Imaging Software" und durchsuchen Sie die Image-Dateien. </li><li> Verwenden Sie "Tool-Palette", um Bilder einzustellen. Klickt auf das Bild anpassen, um Korrektur / Filter-Einstellungen und min / max für einzelne Farbskalen ändern. </li><li> Verwenden Sie ROI-Tools in Pulldown-Liste für die Quantifizierung der Lichtintensität. Wählen ROI Form, Anzahl und Größe. Drag ROI Frame region of interest auf das Bild. Sicherstellen, dass alle ROI haben die gleiche Größe und Form. Klicken Sie auf ROI-Messung und speichern, kopieren und / oder Export quantitative Daten. </li><li> Im Falle von DLIT 3D-Rekonstruktionen, laden Bildsequenz einschließlich der mit strukturiertem Licht Bild. Klicken Sie auf Oberflächentopographie in der Tool-Platte. In Pull-Down-Liste, klicken Sie rekonstruieren Registerkarte, um die Topographie zu erzeugen. Eine Oberfläche Durcheinander wird dann in dem Fenster angezeigt werden. </li><li> Wählen DLIT 3D-Rekonstruktion in der Tool-Platte. In Pull-Down-Liste, klicken Sie auf die Registerkarte Eigenschaften, um Gewebe Eigenschaften und Source-Spektrum gesetzt. Der Muskel ist in den meisten Fällen empfohlen. Im Pulldown-Liste, klicken Sie auf die Registerkarte Analysieren der Wellenlänge für die Analyse auszuwählen. Klicken Sie auf die Registerkarte Parameter und bestätigen Sie die Standardwerte oder passen DLIT Parameter, wenn nötig. Klicken Sie rekonstruieren Registerkarte 3D-Analyse zu starten. </li><li> Als 3D-Rekonstruktion abgeschlossen ist, wird die 3D-Ansicht zeigt die Ergebnisse der 3D-Rekonstruktion. Klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse der Analyse von Daten für Photonen-Dichte, Voxel und DLIT Algorithmus Parameter zu sehen. </li><li> Speichern und / oder exportieren Sie die Ergebnisse der 3D-Rekonstruktion Analysen in Zahlen und Daten. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Die Biolumineszenz Bilder von Mäusen mit Biolumineszenz Bakterien zusammen mit einem nicht infizierten Maus-Steuerung infiziert sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Mäuse Lungen mit Biolumineszenz-Bakterien infiziert produzieren signifikantes Signal aus der Lunge (Abbildung 1). Lumineszenzintensität ist als Gesamt-Lichtstrom innerhalb einer ROI (Region of interessiert) (Abbildung 2) quantifiziert. Die quantitativen Daten für die Lichtintensität ist für Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) von Bakterien von der Lunge erhalten, um zu bestätigen, dass das Signal von der Biolumineszenz Bakterien produziert und können zu negativen Kontrolle verglichen werden normalisiert. Die Lage und Intensität des Signals kann durch DLIT 3D-Rekonstruktion der Lumineszenz Quelle-Tomographie der Maus Fläche 11 analysiert werden. Diese Analysen erlauben die Quantifizierung und Lokalisierung der Biolumineszenz-Signal erzeugt. Die Ergebnisse der 3D-Rekonstruktion eines lumineszierenden Quelle in infizierten Mäusen zeigt, dass Licht von Lungen der Maus (Abbildung 3) hergestellt wird. Die ex vivo Bilder des resultierenden Mauslungen bestätigen, dass Lumineszenz wird von den Lungen abgegeben, sondern als einige andere eng nebeneinanderliegenden Gewebe oder Organ (Abbildung 2C). <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Lumineszenzbildgebung der pulmonalen infizierten Mäuse mit Biolumineszenz Bakterien mit CBRluc getaggt. Infizierte Kontroll-Maus ist auf der linken und zwei infizierte Mäuse sind auf der rechten Seite. Die Mäuse wurden mit Bakterien exprimiert CBRluc (n = 2) infiziert über die intratracheale Route. Dorsal, ventral, links und rechts: 10 Minuten nach dem Luciferin Injektion wurden Lumineszenz Bilder für 10 min bei 4 Positionen erworben. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Die quantitative Lichtintensität von Mäusen, die mit Bakterien exprimiert CBRluc infiziert. (A, B) Lumineszenz Bilder von ROI-Analyse und der Quantifizierung insgesamt Lichtstrom von ROI in dorsalen und ventralen Positionen jeweils. Nicht infizierte Mäuse sind auf der linken und zwei infizierte Mäuse sind auf der rechten Seite. Lumineszenz Bilder wurden von der Lunge o erworbenf Mäusen infizierten und infizierten mit CBRlux (n = 2). Die Lichtintensität rund Lunge wurde durch ROI-Analyse quantifiziert. C) ex vivo Bilder der Lunge aus nicht infizierten (oben) und infizierten (unten zwei Sätze von Lunge) Mäusen. Luciferin war 5 miniuts injiziert, bevor der Euthanasie und Bilder dann erworben wurden. Die quantifizierten Werte sind CFU normalisiert. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Die 3D-Rekonstruktion von Biolumineszenz Quelle (n) aus einer pulmonalen Infektion der Maus. Die Maus wurde mit Bakterien exprimiert CBRluc durch intratracheale Injektion infiziert. Die Bildsequenz wurde aufgenommen mit verschiedenen Emissions-Filter von seriellen Wellenlängen von 540 nm bis 700 nm. Ein Bild-Sequenz wurde für die 3D-Rekonstitution für Lumineszenz-Quelle in der Tier-Themen, die eine strukturierte imag enthalten sind, verwendet. A) Die Tomographie für die Maus ist in verschiedenen Positionen dargestellt: vorne, hinten, links und rechts. Lichtquellen werden als Voxel (rote Kästchen in 3D-Maus), die in Lunge befinden, werden als durch Rekonstruktion bestimmt gezeigt. B) Photon densiy Karte von gemessenen und simulierten Daten. Vergleicht man die gemessenen und simulierten Photonendichte Kurven stellen die Informationen der Qualität der Rekonstruktion. Gute Qualität Rekonstruktionen Ergebnis in ähnlicher gemessenen und simulierten Photonendichten.

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</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Texas A &amp; M University setzen durchgeführt.

Obwohl die folgenden Protokolle werden in der Regel in qualitativ hochwertige Bilder, ist es wichtig, ein paar wichtige Fragen zu erörtern, um genaue und konsistente Daten aus bildgebenden Verfahren zu erhalten. Lumineszenz Bilder sollten erworben, die haben zählt von 600 bis 60.000, um sicherzustellen, dass das Signal über dem Hintergrund liegt und die Kamera ist nicht gesättigt werden. Wenn das Signal erhalten weniger als 600 der Expositionsbedingungen sollte so eingestellt zählt zu erhöhen. Wenn das Signal erhalten w...

<table><tbody><tr><td>Isofluran</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>MP Biomedicals</td><td>158307</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>GMT</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal-plus-Lösung</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Katheter (22G x 1&amp;#8221;)</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>Führungsdraht</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3491</td><td></td></tr><tr><td>Octocope mit Spekulum</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3748</td><td></td></tr><tr><td>Xenogen IVIS-System</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-Gas-Anästhesiesystem</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging Software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transparente Nasenkegel</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtbaffel-Trennwand</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mit luciferase to image bakterielle infektionen bei mäusen

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging ist eine wertvolle Technik, die verwendet werden, um biologische Prozesse zu überwachen. Insbesondere kann das Vorhandensein von Krebs, Stammzellen, bestimmte Zelltypen, virale Krankheitserreger, Parasiten und Bakterien in Echtzeit innerhalb von lebenden Tieren 1-2 folgen. Die Anwendung des Biolumineszenz-Bildgebung zur Erforschung der Krankheitserreger hat Vorteile gegenüber herkömmlichen Strategien zur Analyse von Infektionen in Tiermodellen 3-4 verglichen. Infektionen können innerhalb der einzelnen Tiere visualisiert im Laufe der Zeit, ohne dass Euthanasie auf die Lage und Menge des Erregers zu bestimmen. Die optische Bildgebung ermöglicht eine umfassende Untersuchung aller Gewebe und Organe, anstatt Probenahme von Seiten bisher bekannten infiziert zu sein. Darüber hinaus kann die Genauigkeit der Impfung in bestimmten Geweben direkt bestimmt werden vor der Durchführung vor Tieren, die erfolglos während des gesamten Experiments wurden geimpft. Variabilität zwischen den Tieren kann kontrolliert werden, da Bildgebung ermöglicht jedes Tier einzeln verfolgt werden. Imaging hat das Potenzial, deutlich reduzieren Tierzahlen notwendig, weil der Fähigkeit, Daten aus zahlreichen Zeitpunkten ohne Probe Gewebe Erreger Last bestimmt 3-4 erhalten. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um Infektionen in lebenden Tieren mit Biolumineszenz-Bildgebung für die rekombinante Bakterienstämme, die Luciferase zu visualisieren. Der Klick Käfer (CBRLuc) und Glühwürmchen-Luciferase (FFluc) nutzen Luciferin als Substrat 5-6. Das Licht von beiden CBRluc und FFluc hervorgebracht hat einen breiten Wellenlängenbereich von 500 nm bis 700 nm, so dass diese Luciferasen ausgezeichnete Reporter für die optische Bildgebung im lebenden Tier-Modellen 7-9. Dies ist vor allem, weil Wellenlängen des Lichts größer als 600 nm erforderlich sind, um die Absorption von Hämoglobin zu vermeiden und damit reisen durch Säugetiergewebe effizient. Luciferase ist genetisch in die Bakterien eingeführt werden, um Licht-Signal 10 zu produzieren. Mäuse sind pulmonale mit Biolumineszenz Bakterien intratracheal zur Überwachung von Infektionen in Echtzeit ermöglichen geimpft. Nach Luciferin Injektion, werden die Bilder aufgenommen mit der IVIS Imaging System. Während der Aufnahme werden die Mäuse mit Isofluran mit einem XGI-8 Gas Anethesia System. Bilder können analysiert zu lokalisieren und zu quantifizieren, die Signalquelle, die die bakterielle Infektion Website (s) und die Zahl repräsentiert, bzw. werden. Nach der Bebilderung wird CFU Bestimmung an homogenisiert Gewebe durchgeführt, um das Vorhandensein von Bakterien zu bestätigen. Mehrere Dosen von Bakterien benutzt, um bakterielle Zahlen mit Lumineszenz korreliert. Imaging können genutzt werden um der Pathogenese und Beurteilung der Wirksamkeit von antimikrobiellen Verbindungen und Impfstoffe studieren.

Methoden für die Biolumineszenz-Bildgebung von bakteriellen Infektionen in lebenden Tieren beschrieben. Krankheitserreger werden geändert, um auszudrücken Luciferase ermöglicht optische Ganzkörperbildgebungssysteme von Infektionen in lebenden Tieren. Tiermodelle können mit Luciferase exprimierenden Krankheitserreger infiziert werden und die daraus resultierende Verlauf der Erkrankung visualisiert in Echtzeit durch Biolumineszenz-Bildgebung.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Die Bildgebung ist eine wertvolle Technik, die zur Überwachung biologischer Prozesse eingesetzt werden kann. Insbesondere das Vorhandensein von Krebszellen, Stammzellen, spezifischen ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ein quantitatives Bild einer Infektion in lebenden Tieren zu erhalten, das die Lokalisierung des infizierenden Organismus innerhalb der Gewebe und Organe des Wirts ermöglicht. Anästhetisierte Mäuse werden zunächst intratracheal mit biolumineszenten Bakterien infiziert. Anschließend erhalten die infizierten Mäuse eine Injektion mit Luciferin, wodurch eine Live-Bildgebung im IVIS-System durchgeführt werden kann.Nachdem Ganzkörperaufnahmen gewonnen wurden, werden die infizierten Lungen entnommen. Die Abbildung der isolierten Organe kann durchgeführt werden, um die tatsächliche Lokalisation des Erregers darzustellen. Nach der Bildgebung werden die Lungen homogenisiert und zur Quantifizierung der mikrobiellen Belastung auf einem bakteriellen Nährmedium ausplattiert. Letztlich werden Ergebnisse erzielt, die in Echtzeit die Lokalisation und Anzahl von Krankheitserregern innerhalb des Wirts zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass Krankheitserreger in lebenden Tieren mittels Echtzeit-Bildgebung sichtbar gemacht und überwacht werden können, wodurch Einblicke in die räumliche Dynamik mikrobieller Infektionen gewonnen werden. Diese Methode wird von Dr. Mihi Chang, einer Postdoktorandin in meinem Labor, und SWAT Cillo, einem Forscher in meinem Labor, demonstriert.Beginnen Sie mit einer intraperitonealen Injektion von sechs bis zwölf Wochen alten Valve-C-Mäusen mit einer vorgemischten anästhetischen Lösung, die 100 Mikrogramm Ketamin und 10 Mikrogramm Xylazin pro Gramm Körpergewicht der Maus enthält. Stellen Sie die Mäuse nach der Injektion zurück in ihre Käfige, bis die Anästhesie einsetzt. Um zu überprüfen, ob die Anästhesie vollständig ist, drücken Sie auf die Fußsohle jeder Maus und stellen Sie sicher, dass keine Pedalreflexreaktion auftritt.Sobald die Tiere vollständig anästhesiert sind, nehmen Sie eine Maus und platzieren Sie sie auf der Intubationsvorrichtung. Legen Sie sie auf den Rücken. Befestigen Sie die Beine und Arme der Maus mit Klebeband an der Vorrichtung.Befestigen Sie ein Gummiband an der Intubationshalterung. Legen Sie es dann unter die oberen Schneidezähne der Maus. Sobald die Maus fixiert ist, ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Zunge aus dem Mund.Danach vorsichtig das Spekulum mit dem Otoskop im Mund des M&auses einf&uuml;hren und die Larynx&ouml;ffnung lokalisieren, die sich vor der Speiser&ouml;hre an der ventralen Seite des Oropharynx befindet. Sobald die Larynx&ouml;ffnung identifiziert wurde, einen 22-Gauge-ein-Zoll-Katheter, der einen F&uuml;hrungsdraht enth&auml;lt, in die Trachea einf&uuml;hren, bis die Katheterh&uuml;lse die Schneidez&auml;hne erreicht. Den F&uuml;hrungsdraht entfernen und den Katheter mit der Plastikpumpe verbinden.Danach Luft in den Katheter einführen. Die Brust der Maus wird sich aufblähen, wenn die Intubation korrekt durchgeführt wurde. Sobald die korrekte Position des Katheters bestätigt ist, pipettieren Sie 50 µL einer biolumineszenten Bakterienlösung in der gewünschten Konzentration in den Katheter und setzen eine 1-mL-Spritze mit 50 µL Luft auf, um die Lösung in die Lunge der Maus zu befördern.Zweimal oder dreimal entfernen Sie den Katheter und stellen die Maus zurück in ihren Käfig, damit sie sich von der Anästhesie erholen kann. Vor der Biolumineszenzbildgebung anesthetisieren Sie die Mäuse mit Isofluran. Sobald die Mäuse vollständig anästhesiert sind, nehmen Sie sie aus der Induktionskammer und tragen vorsichtig einen Augenschutz auf, um die Augen des Tieres zu schützen.Während der Bildgebung bringen Sie die Mäuse einzeln in die Bildgebungskammer und setzen jeweils eine Nasenkappe am Anästhesieverteiler auf. Verwenden Sie eine Lichtblende zwischen den Mäusen, um Lichtreflexionen zwischen benachbarten Versuchstieren zu verhindern. Schließlich injizieren Sie jeder Maus intraperitoneal 150 Mikrogramm pro Gramm Körpergewicht von Luciferin.Lassen Sie das Luciferin 10 Minuten lang im Körper der Tiere verteilen. Beginnen Sie dann mit der Bildaufnahme. Starten Sie die Software für die Lebendbildgebung und initialisieren Sie das IVIS-Bildgebungssystem.Um zunächst die Parameter festzulegen, klicken Sie auf „Sequenzeinrichtung“. Wählen Sie dann den Lumineszenz- und Fotografie-Bildmodus aus. Wählen Sie fotografische lumineszente und Auflichtbilder als Teil der Bildsequenz aus, um die DLIT-3D-Rekonstruktion zu aktivieren.Als Nächstes stellen Sie die Belichtungszeit auf eine Minute ein. Danach stellen Sie den Binning auf mittel und die Blende auf 1 ein. Stellen Sie den Anregungsfilter auf blockieren und die Emissionsfilter auf offen, um bei der 3D-Rekonstruktion mehrere Filter mit verschiedenen Wellenlängen zu ermöglichen.Um eine genaue Lokalisierung der Signalquelle zu ermöglichen, wählen Sie das Sichtfeld (FOV), das der Anzahl der dargestellten Mäuse entspricht. Sobald alle Einstellungen festgelegt sind, klicken Sie im Bild-Assistenten des Erfassungssteuerfelds auf „Hinzufügen“, um die Sequenzeinstellung hinzuzufügen, und klicken Sie auf „Erfassen“, um die Bildaufnahmesequenz während der Erfassung zu starten. Notieren Sie die experimentellen Details und Bedingungen im Fenster „Bild bearbeiten“ und speichern Sie die Bilder.Entfernen Sie die Mäuse abschließend aus der Bildgebungskammer und bringen Sie sie in ihre Käfige zurück. Überwachen Sie die Tiere kontinuierlich, bis sie sich von der Anästhesie erholt haben. Für die Gewebebildgebung euthanasieren Sie die Mäuse auf humane Weise.Zu diesem Zeitpunkt die Lungen jeder Maus aseptisch entnehmen und die Organe in eine sterile Petrischale überführen. Die Petrischale mit den infizierten Lungen in die Bildgebungskammer stellen und Biolumineszenzbilder auf die gleiche Weise wie zuvor in diesem Video beschrieben aufnehmen. Sobald die Bilder gewonnen wurden, die Petrischale aus der Bildgebungskammer entfernen und mithilfe steriler Pinzette die Lungen in ein Reagenzglas mit einem Milliliter steriler PBS überführen; anschließend die Lungen mit einem Homogenisator zwei bis fünf Minuten lang homogenisieren.Stellen Sie eine serielle Verdünnung der Lungenhomogenate in steriler PBS her. Anschließend 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf Petrischalen mit selektivem Medium auftragen. Die Kulturen bei 37 Grad Celsius inkubieren, bis bakterielle Kolonien deutlich sichtbar sind.Danach die Koloniebildende Einheiten (CFU) zählen, um den Infektionsgrad zu beurteilen. Die Software für Lebendbilder starten und die gewünschten Bilddateien über den Dateibrowser öffnen. In der Werkzeugpalette.Klicken Sie auf „Bildanpassung“, um die Einstellungen für Korrektur und Filterung sowie die Schwellenwerte der Farbskala zu ändern. Um die Lumineszenzintensität zu quantifizieren, verwenden Sie die Werkzeuge für den interessierenden Bereich (ROI) aus der Dropdown-Liste, wählen Sie die ROI-Form, Nummer und Größe aus. Klicken Sie anschließend auf „ROI-Messung“ und speichern Sie die quantitativen Daten, um 3D-Bilder neu zu erstellen.Laden Sie zuerst die Bildsequenz einschließlich der Strukturierten-Licht-Bilder. Klicken Sie in der Werkzeugpalette auf Oberflächentopographie. Wählen Sie dann in der Dropdown-Liste den Reiter „Rekonstruktion“, um eine Oberflächentopographie zu erzeugen.Wählen Sie anschließend die DILT-3D-Rekonstruktion aus der Werkzeugpalette aus. Klicken Sie auf den Reiter „Eigenschaften“ in der Dropdown-Liste und stellen Sie die Gewebeeigenschaften und die Quellenspektren auf Muskel ein. Wechseln Sie zum Reiter „Analysieren“ und wählen Sie die Wellenlänge für die Analyse aus.Klicken Sie dann auf „Start“. Sobald alle Einstellungen angepasst wurden, klicken Sie auf „Rekonstruieren“, um die 3D-Analyse zu starten. Wenn die 3D-Rekonstruktion abgeschlossen ist, wählen Sie die 3D-Ansicht aus, um die Ergebnisse anzuzeigen, indem Sie auf den Ergebnis-Tab klicken. Die Photondichte, Daten-Voxel und Algorithmus-Parameter können eingesehen werden; speichern Sie die Ergebnisse und exportieren Sie die Daten und Bilder zur weiteren Analyse.Wie in dieser Abbildung gezeigt, erzeugen die beiden Mäuse rechts, die intratracheal mit 106 KBE biolumineszenter Bakterien infiziert wurden, ein starkes Signal aus dem pulmonalen Bereich, während die nicht infizierte Maus links kein Signal zeigt. Eine ähnliche Analyse an entnommenen Lungen allein von infizierten Mäusen bestätigt, dass die Lumineszenz von den Lungen und nicht von einem benachbarten Gewebe ausgeht. Das von der Probe ausgehende Signal kann einfach als Gesamtfluss innerhalb eines interessierenden Bereichs quantifiziert werden.Eine Tomographie-Analyse bestätigt, dass die Position der Lumineszenz, die in diesen Bildern als rote Boxen dargestellt ist, innerhalb des Bereichs liegt, der aufgrund der 3D-Rekonstruktion als Lunge der Maus identifiziert wurde. Schließlich belegt die Ähnlichkeit zwischen der gemessenen Photonen-Dichtekurve auf der linken Seite und der simulierten Photonen-Dichtekurve auf der rechten Seite die hohe Qualität der Rekonstruktion. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Tiere abbildet, die mit Precedent infiziert sind, und die Bilder zur Lokalisierung und Quantifizierung der Reminiscenz analysiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieser Artikel beschreibt die Verwaltung...

Bioluminescent Bakterielle Imaging<em&gt; In Vivo</em

Quelle: Valentine, M. E., et al. Generierung von In-Frame-Gendeletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Test auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Verwendung von Biolumineszenz, um das in vivo-Verhalten von virulenten und abgeschwächten Bakterienstämmen bei Mäusen zu visualisieren und zu vergleichen. Es beschreibt die Herstellung von biolumineszierenden Bakteriensuspensionen und deren intraperitoneale...

Verfolgung der bakteriellen Infektionsdynamik in einer Maus mit Hilfe von Biolumineszenz

Quelle: de Vries, C. R., et al., Ein verzögertes Impfungsmodell der chronischen Wundinfektion von Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert eine biolumineszente Bildgebungstechnik zur Überwachung des Verlaufs bakterieller Infektionen in einem lebenden Mausmodell. Pathogene Bakterien, die mit dem luxABCDE-Reportersystem konstruiert wurden, senden Licht an der Infektionsstelle aus, was die Visualisierung metabolisch aktiver Bakterien ermöglicht. Durch die Abbildung...

Biolumineszenzbildgebung bakterieller Infektionen bei Mäusen

Quelle: Valentine, M. E. et al., Erzeugung von In-Frame-Gen-Deletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Anwendung eines biolumineszenzbasierten Bildgebungsansatzes zur Überwachung bakterieller Infektionen in einem Live-Mausmodell. Sequentielle biolumineszente und Röntgenbildgebung ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung und anatomische Lokalisierung der Infektion, die...

Echtzeitbildgebung bakterieller Infektionen in einem Mausmodell mittels Biolumineszenz

Quelle: Luyts, N., et al. Longitudinale Nachbeobachtung von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenzbildgebung. J. Vis. Exp. (2021).Dieses Video demonstriert die Induktion und Verfolgung einer Harnwegsinfektion in einem Mausmodell unter Verwendung biolumineszenter E. coli, die in die Blase injiziert wird, wo bakterielle Adhäsion, Invasion und intrazelluläre Replikation stattfinden. Das vom biolumineszente Operon ausgesendetes Licht dient als Echtzeit-Marker für...

Visualisierung der Harnwegsinfektion in einem Mausmodell mittels Biolumineszenz

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Verfolgung von Virusinfektionen in Mausmodellen mit einem rekombinanten Luciferase- und Fluoreszenzprotein-exprimierenden bi-Reporter-Influenza-A-Virus. Diese Methode ermöglicht sowohl in vivo- als auch ex vivo-Studien, die es den Forschern ermöglichen, Einblicke in die virale Dynamik und die Auswirkungen von Interventionen zu gewinnen.

Ein Luziferase-fluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Verfolgung von Virusinfektionen

Multi-Bildgebung ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung bakterieller Besiedlung in kleinen Tiermodellen. Dieses Protokoll beschreibt Infektion von Mäusen mit...

4D Imaging von Multimodalität<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektionen bei Mäusen

Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger schwerer ambulant erworbener Pneumonie und für mehr als 2 Millionen Todesfälle weltweit verantwortlich. Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren in Fitness-oder Virulenz beteiligt können in Echtzeit in einer akuten Lungenentzündung oder Bakteriämie Maus-Modell mit Biolumineszenz-Bakterien beobachtet werden.

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Wir beschreiben die optische Bildgebung von Mäusen mit Mycobacterium Tuberculosis (Mycobacterium Tuberculosis) mit Reporter Enzym Fluoreszenz (REF) infiziert. Dieses Protokoll ermöglicht den sensitiver und spezifischen Nachweis von Mycobacterium Tuberculosis in präklinischen Tiermodellen für die Pathogenese, Therapie und Impfstoff-Forschung.

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Influenza-A-Viren (IAVs) sind ansteckende Atemwegserreger, die jährliche Epidemien und gelegentliche Pandemien verursachen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Verfolgung viraler Infektionen in vivo mit einer neuartigen rekombinanten Luziferase und fluoreszenz-exzierenden Bi-Reporter IAV (BIRFLU). Dieser Ansatz bietet Forschern ein ausgezeichnetes Werkzeug, um IAV in vivo zu studieren.

Ein luziferasefluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen

Dieses Manuskript beschreibt die intravesikale Verabreichung  von uropathogenen Bakterien mit einem Lux-Operon zur Induktion einer Harnwegsinfektion bei Mäusen und die anschließende longitudinale In-vivo-Analyse der Bakterienbelastung mittels Biolumineszenzbildgebung.

Longitudinale Nachsorge von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenz-Bildgebung

Erfahren Sie, wie Sie biolumineszente Bakterieninfektionen in lebenden Mäusen mit Luciferase und dem IVIS-System in Echtzeit visualisieren. Diese Methode ermöglicht die Lokalisierung von Pathogenen in Geweben und die Quantifizierung der mikrobiellen Last.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

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