Die Verwendung eines Hanging-Gewicht-System für Leberischämie in Mäuse
7. August 2012
Wir gründeten eine neue Mausmodell der eine hängende Gewicht für Portal-Triade Okklusion. Diese Technik kann hilfreich sein für zukünftige Untersuchungen der Ischämie in Maus-Leber-Modelle.
Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Leberischämie zur Untersuchung von Reperfusionsschäden zu induzieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die Leberlappen freigelegt werden. Der nächste Schritt besteht darin, die linke Lebertrias freizulegen, zu der die Vene, die Leberarterie und der Gallengang gehören.
Nach der Isolierung wird eine Naht um die linke Triade genäht und ein hängendes Gewichtssystem angewendet, um eine Leberischämie zu induzieren. Zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Ischämie werden die Gewichte angehoben, um mit der Reperfusion zu beginnen. Letztendlich kann das Ausmaß der Leberschädigung nach Ischämie und Reperfusion durch Messung eines LT und eines ST im Blut und Durchführung einer Leberhistologie ermittelt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von Klemmen bei Leberischämie besteht darin, dass die Naht das Lebergewebe nicht verletzt und dass der Zeitpunkt der Ischämie präziser sein kann.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die genaue Platzierung der Naht der Schlüssel ist, um eine reproduzierbare Leberischämie zu erreichen, ohne das Gewebe zu schädigen. Beginnen Sie mit der Einrichtung des Operationsbereichs mit sterilisierten Instrumenten und allen anderen Materialien, die für die Operation erforderlich sind. Legen Sie zunächst eine betäubte Maus in Rückenlage auf einen beheizten Tisch mit kontrollierter Temperatur.
Befestigen Sie die oberen und unteren Extremitäten mit abnehmbarem Klebeband an der Liege, um das Lokalisieren der Triade und das Platzieren der Naht zu erleichtern. Positionieren Sie die Maus und den Heiztisch so, dass der Schwanz zum Chirurgen gerichtet ist. Führen Sie als Nächstes eine rektale Sonde ein, die an einem thermischen Feedback-Regler befestigt ist, um die Körpertemperatur zu halten.
Decken Sie den Inzisionsbereich mit Mineralöl ab, um das Einatmen von Maushaaren zu verhindern und die Exposition gegenüber Allergenen zu reduzieren. Sobald das Tier richtig vorbereitet wurde, bestätigen Sie die Narkosetiefe, bevor Sie eine Mittellinien-Laparotomie durchführen. Fahren Sie mit dem Schneiden des linearen Albas fort, bis die Leber leicht freigelegt werden kann.
Verwenden Sie anschließend ein feuchtes Wattestäbchen, um den Darm zu verdrängen und die Pfortaderdreiade freizulegen. Um eine bessere Sicht zu erhalten, verschiebt man den Medianus und den linken Lappen in Richtung Zwerchfell und den rechten Lappen in Richtung Darm. Halten Sie mit einer faden Pinzette den rechten Lappen nach unten und erhalten Sie eine klare Sicht auf das linke Portal.
Dreiklang und Höhle der Hohlvene unterlegen. Fädeln Sie vorsichtig eine Naht um die linke Portaldreiade. Dazu gehören die Leberarterie, die Lebervene und der Gallengang.
Fassen Siemit einer Pinzette die Spitze der Nadel von der rechten Seite und ziehen Sie die Naht vorsichtig durch, ohne die Leber zu beschädigen. Der Stich sollte etwas tiefer unter der Triade platziert werden, und er kann den Vena caver inferior verletzen. Sobald die Naht an Ort und Stelle ist, befestigen Sie an jedem Ende einen beschwerten Eend-Orph-Schlauch.
Wenn sie fertig sind, werden diese Gewichte über Nahthaltern platziert, die sich distal des Stichs befinden. Wie hier zu sehen, um eine Ischämie auszulösen, legen Sie beide Gewichte auf die Nahthalter. Die Trias wird sofort verschlossen, was zu einer Unterbrechung der Blutversorgung des linken und medianen Leberlappens führt.
Der erfolgreiche Verschluss wird durch die blasse Blanchierung des Median- und linken Leberlappens bestätigt. Dieses Modell der partiellen hepatischen Ischämie vermeidet eine mesenteriale Stauung, indem der Blutfluss zu den rechten Leberlappen erhalten bleibt. Wenn die vorgegebene ischämische Periode vorbei ist, heben Sie die Gewichte an, um die Spannung auf der Naht zu lösen.
Eine sich verändernde Farbe sollte sichtbar sein, wenn die Leber wieder durchblutet wird. Setzen Sie den Darm wieder in die Bauchhöhle ein und halten Sie Leber und Darm mit einem feuchten, mit warmem Wasser getränkten Tupfer warm. Nach der Reperfusionsphase können Blut und Lebergewebe entnommen werden, um das Ausmaß der Leberschädigung nach hepatischer Ischämie zu beurteilen.
Das Ausmaß der Leberschädigung kann durch Färben des Gewebes mit Hämatin und Eoin bestimmt werden. Das gesunde Gewebe, das hier zu sehen ist, enthält im Vergleich zur ischämischen Leber weniger Hepatozyten, Ablagerungen und Schwellungen. Die Leberenzyme Alanin und die Minor-Transferase A LT und die Minor-Transferase A ST sind hier häufige Marker für Leberschäden.
Die Spiegel sowohl einer LT als auch einer A ST stiegen an, wenn die ischämische Zeitspanne verlängert wurde. Ein Meister. Diese Technik kann innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Andere Methoden wie die ischämische Präkonditionierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen in Bezug auf Leberschäden aufgrund von Ischämie zu beantworten.
Übersicht
Diese Studie stellt ein neuartiges murines Modell vor, das ein hängendes Gewichtssystem zur Okklusion der Pfortadertriade nutzt, um Leberischämie zu untersuchen. Die Technik ermöglicht eine präzise Kontrolle über die Dauer der Ischämie, ohne das Lebergewebe zu verletzen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- hepatische Ischämie
- Reperfusionsschaden
Hintergrund
- Ischämie und Reperfusionsschaden sind zentrale Forschungsgebiete in der Leberforschung.
- Bestehende Methoden verursachen häufig zusätzlichen Gewebeschaden.
- Es besteht ein Bedarf an verbesserten Techniken, die die Schädigung minimieren und gleichzeitig eine präzise Steuerung der Ischämiedauer ermöglichen.
- Diese Studie stellt eine Methode vor, die diese Herausforderungen adressiert.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines murinen Modells zur Untersuchung der Leberischemie.
- Beurteilung der Auswirkungen von Ischämie und anschließender Reperfusion auf die Leberschädigung.
- Visuelle Demonstration der Technik zur Sicherstellung der Reproduzierbarkeit.
Verwendete Methoden
- Isolierung der linken Lebertrias (Pfortader, Arteria hepatica, Gallengang).
- Anwendung eines hängenden Gewichtssystems zur Induktion der Ischämie.
- Bestimmung der Leberschädigung mittels Blutenzymwerten und histologischer Analyse.
- Visuelle Bestätigung der Ischämie anhand von Farbveränderungen der Leber.
Hauptergebnisse
- Das hängende Gewichtssystem unterband effektiv den Blutfluss zu den Leberlappen.
- Ein erfolgrecher Ischämiezustand wurde durch sichtbare Blässe der Leberlappen bestätigt.
- Die Reperfusion führte zu Farbveränderungen in der Leber, was auf die Wiederherstellung des Blutflusses hinwies.
- Erhöhte Leberenzymwerte korrelierten mit längeren ischämischen Phasen.
Schlussfolgerungen
- Diese neuartige Technik bietet eine zuverlässige Methode zur Induktion einer Leberischämie.
- Sie verursacht im Vergleich zu herkömmlichen Methoden weniger Gewebeschäden.
- Das Modell kann weitere Forschungsarbeiten zur Leberischämie und zum Ischämie-Reperfusionsschaden erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mit diesem Hängewicht-System lässt sich eine präzise und reproduzierbare Induktion einer hepatischen Ischämie bei Mäusen ohne Gewebeschädigung durch Klemmung erzielen und es unterstützt damit mechanistische Untersuchungen zur Ischämie-Reperfusionsschädigung. Das Modell ermöglicht die Validierung von Zielstrukturen und die Entdeckung von Biomarkern in der präklinischen Leberforschung, indem es quantifizierbare Schädigungsparameter über die Serumspiegel von ALT und AST bereitstellt. Seine Eignung für Präkonditionierungsstudien erlaubt die Bewertung zytoprotektiver Interventionen vor der Screening-Phase von Leitverbindungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in Ischämie-Reperfusion-Wegen durch kontrollierte, zeitlich begrenzte Okklusion des hepatischen Blutflusses.
- Operativer Wert: Bietet einen standardisierten chirurgischen Ansatz, der die Variabilität bei der Induktion der Ischämie zwischen experimentellen Gruppen verringert.
- Prädiktiver Wert: Korreliert die Dauer der Ischämie mit dem Anstieg der serumgebundenen ALT/AST und liefert damit eine quantitative Metrik zur Risikominimierung von Wegen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Eignung: Erzeugt konsistente Leberschädigungsphänotypen, die zur Validierung von Biomarker-Assays oder pharmakologischen Interventionen geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Die nahtbasierte Okklusionsmethode gewährleistet einen einheitlichen ischämischen Insult und unterstützt die Reproduzierbarkeit im Hochdurchsatz-Screening.
- Skalierbarkeit: Die kurze Dauer des Eingriffs (<10 Minuten) und der geringe Ausrüstungsbedarf erleichtern die Anpassung an Studiendesigns mit mehreren Gruppen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert klinische Szenarien wie hepatische Resektion oder Transplantation, bei denen Ischämie-Reperfusionsschäden zum Transplantatversagen beitragen.
- Translationale Kontinuität: Die Messung der Serum-ALT/AST-Werte entspricht klinischen Biomarkern für Leberschädigungen und ermöglicht die Übertragung der Ergebnisse auf andere Spezies.
- Mechanistische Risikominimierung: Ermöglicht die Bewertung zytoprotektiver Wirkstoffe oder genetischer Modifikatoren, bevor man zu umfangreicheren Säugetiermodellen übergeht.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Testung von Zielhypothesen bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsbewertung ein, insbesondere für lebergerichtete Therapeutika, bei denen Ischämie-Reperfusion ein potenzielles Risiko darstellt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die funktionelle Validierung von Genen oder Proteinen, die an hypoxischen Stressantworten beteiligt sind, mithilfe induzierbarer, lappenspezifischer Ischämie.
- Screening: Ermöglicht die Herstellung standardisierter ischämischer Leberproben für ex-vivo-Wirksamkeitstests gegenüber Wirkstoffen oder Metabolitenprofilerstellungen.
- Analytik: Liefert quantitative serumbasierte Enzymwerte (ALT/AST) und histologische Endpunkte, um das Ausmaß der Schädigung unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Die Übereinstimmung von Biomarkern mit klinischen Leberschädigungsmarkern unterstützt Entscheidungen über die Weiterentwicklung in der präklinischen Phase.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare chirurgische Plattform für die iterative Prüfung von ischämiemodulierenden Substanzen oder genetischen Eingriffen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert störende Gewebeschäden durch Klemmen und verbessert so die Spezifität von Untersuchungen zu Mechanismen der Ischämie-Reperfusion.
- Operativer Wert: Macht den Einsatz spezialisierter vaskulärer Klemmen überflüssig, wodurch der Verfahrensaufwand und die Gerätewirtschaftskosten gesenkt werden.
- Strategischer Wert: Ermöglicht eine präzise Steuerung der Ischämiedauer für Präkonditionierungsstudien und verbessert dadurch die Effizienz bei der Bewertung zytoprotektiver Substanzen.
- Portfolio-Wirkung: Erzeugt zuverlässige Schadensdaten, um die risikoadjustierte Priorisierung von lebertargetierten Wirkstoffkandidaten zu unterstützen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert mikrochirurgische Expertise bei der Isolierung von Gefäßen und Platzierung von Nähten, ohne angrenzende Strukturen zu beschädigen.
- Setzt einen sterilen chirurgischen Aufbau, Temperaturregulation und Materialien zur Blutstillung voraus.
- Erfordert standardisierte Protokolle für Ischämie/Reperfusion-Zeitabläufe über verschiedene Operateure hinweg, um die Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten.
- Auf die linke Lobe beschränkt; die Perfusion der rechten Lobe muss bestätigt werden, um verfälschende systemische Effekte auszuschließen.
- Basiert auf Serum-ALT/AST als primäre Endpunkte der Schädigung; eine ergänzende Histologie wird für eine tiefere Aufklärung der Mechanismen empfohlen.
