Name: Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Lernen Sie die Intravitalmikroskopie der Leistenlymphknoten bei Mäusen für die Untersuchung der Mikrozirkulation in vivo. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Visualisierung von Gefäßreaktionen und Zelltrafficking.

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Diese Arbeit wird von der Canadian Institutes of Health Research, Canadian Foundation for Innovation, University of British Columbia Centre for Blood Research und der University of Northern BC finanziert.

1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Reagenzien im gesamten Experiment verwendet werden, sollten vor Beginn der chirurgischen Protokoll vorbereitet werden. Beachten Sie, dass alle Lösungen hergestellt wurden unter Verwendung steriler Technik. </li><li> Physiologische Kochsalzlösung (PSS) ist am besten in zwei Komponenten hergestellt: basische Salz-Lösung und Natriumhydrogencarbonatlösung. Sowohl Lösungen bei 20X Konzentration und lagern bei 4 ° C. Natriumbicarbonat bei 20X ist 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) und basische Salz-Lösung bei 20X Konzentration 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol) und 23,4 mm MgSO 4 • 7 H 2 O (246.48g/mol). Die Lösungen sollten in dH 2 O und Chemikalien vorbereitet werden sollte hinzugefügt werden einer nach dem anderen und gerührt, bis die Lösung klar ist vor der Zugabe des nächsten chemische </li><li> Bereiten 2L von PSS durch Verdünnen gleichen Volumina von Natriumbicarbonat und basische Salz-Lösung und Verdünnen auf 1X-Konzentration (für zwei 2L von PSS verdünnen 100mL jedes Natriumbicarbonat und basische Salz-Lösung in dH 2 O </li><li> Legen Sie 2L-Messkolben mit PSS und PSS in 37 ° C Wasserbad. Äquilibrieren Sie die Lösung mit 5% CO 2 / Balance Stickstoffgas für 1 Stunde vor der Operation beginnen. </li><li> Vasoaktive Substanzen (zB Phenylephrin, Acetylcholin, Nitroprussidnatrium) werden am besten bei 1M-Konzentration in dH2O hergestellt und gelagert in 100 &amp;mgr; l Aliquots bei -20 ° C. </li></ol> 2. Tierische Vorbereitung <ol><li> Bestimmen Sie das Gewicht der Maus und zu verwalten, die anfängliche Dosis von Natrium-Pentobarbital bei 90mg/kg durch intraperitoneale Injektion. Während des gesamten Verfahrens mit der Maus wird kontinuierlich für Anästhesie Flugzeug über Zehen klemmen und sorgfältige Prüfung der Atemfrequenz beobachtet. Weitere Injektionen von Natrium-Pentobarbital verabreicht als bei 20mg/kg auf die Anästhesie Flugzeug zu halten benötigt werden. Die chirurgische Ebene der Anästhesie ist in Einklang mit Bundes-und institutionelle Regelungen beibehalten, wie in der Tierpflege Protokoll, das von der Animal Care und Verwenden Committee (ACUC) der University of Northern BC genehmigt skizziert. </li><li> Entfernen Sie die Haare aus dem Bauch und Flanken / Hüftbereich durch Rasierer. Verbleibende lose Haare von Alkoholtupfer und klopfte auf den Bereich mit Klebeband. Dies ist ausreichend, da diese experimentelle Vorgehensweise ist Klemme. </li><li> Legen Sie die Maus auf eine klare OP-board in Rückenlage und legen Sie die Maus auf dem Brett durch Abkleben jeder Pfote an den Vorstand. Die Körpertemperatur ist über einen externen Wärmelampe gewartet und überwacht über Rektalthermometer um sicherzustellen, dass Hypothermie nicht als Folge der Narkose auftreten. </li></ol> 3. Surgical Procedure <ol><li> Während des gesamten chirurgischen Eingriffs zu gewährleisten freiliegende Gewebe immer gehalten superfundiert mit äquilibriert erwärmt PSS-Lösung. Es ist auch wichtig, nie den Kontakt mit den Gefäßen des Interesses mit chirurgischen Instrumenten oder zu verletzen die Gefäße, indem zu viel Kraft auf sie durch Manipulation Fettgewebe und Bindegewebe um sie herum. </li><li> Platzieren Sie die Maus unter dem Binokular. Machen Sie eine Mittellinienschnitt entlang der ventralen Oberfläche der Bauchhöhle und Einfahren der Haut gegenüber der Maus Wirbelsäule. </li><li> Sobald die Haut eingezogen ist, so dass die LN gut sichtbar ist, Pin die Haut auf einem Sockel aus transparentem Sylgard 184. </li><li> Entfernen Sie die dünne Schicht von Bindegewebe Überlagerung der Bereich um die LN </li><li> Deaktivieren Sie das Fettgewebe überlagert und umgeben den Lymphknoten, bis der mikrovaskulären Bett ausgesetzt ist. Die wichtigsten arteriellen Segment legt neben dem LN und wird allgemein durch die venule überlagert. Die gesamte Operation dauert etwa 30 Minuten. </li></ol> 4. Imaging und Gefäßanalyse <ol><li> Sobald das Schiff Segment von Interesse unter der Binokular ausgesetzt ist, sichern Sie die Vorbereitung auf die intravitale Mikroskop. Beachten Sie, dass Tiere auf dem klaren chirurgischen Bord bleibt, während auf der Intravitalmikroskopie Mikroskop während der gesamten Dauer des Experiments. Die Körpertemperatur wird über Wärmelampe gewartet und gemessen über rektale Thermometer während des chirurgischen Abschnitt beschrieben. Die Anästhesie-Ebene ist auch während des ganzen Experiments überwachen, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. </li><li> Richten Sie die Superfusion und Saugleitungen. Superfusion von PSS erfolgt durch Schwerkraft aus einem Reservoir, in den Wassermantel beheizten Behälter (der Wassermantel umgewälzt und durch die zirkulierende Wasserbad erhitzt) wird von 5% CO 2 symmetrische Stickstoff durchströmt, und unten einen Tropf line mit einer Rate von 10 ml / min. Eine Saugleitung sollte verwendet werden, um weiterhin zu ziehen superfundiert PSS weg von der Vorbereitung. Beachten Sie, dass vor dem Experiment die Saugleitungen und Wassermantel gründlich gereinigt und gelagert nach jedem Experiment. Dies gewährleistet die Sterilität vor dem nächsten Versuch. </li><li> Prüfen Sie die Temperatur des superfusing PSS. Stellen Sie die Temperatur deszirkulierenden Wasserbad und / oder die Rate der PSS Superfusion auf eine Temperatur von ~ 37 ° C über die Vorbereitung zu erreichen. </li><li> Lassen Sie die Gefäße mit PSS für mindestens 60 Minuten ausgleichen und Quantifizierung der Gefäßdurchmesser mit der Video-Bremssattel. In der Regel sollte Gefäßdurchmesser an mehreren Punkten bestimmt werden (z. B. bei 40, 50 und 60 Minuten), um sicherzustellen, das Schiff stabilisiert hat. </li><li> Beurteilen Sie die Gesundheit des Schiffes mit einem glatten Muskulatur spezifischen Agonisten (zB Phenylephrin, PE) und einer Endothel spezifischen Agonisten (zB Acetylcholin, ACh). Die Konzentration des Agonisten sollte je nach Agonisten eingestellt werden, sondern auch für PE und Ach das Schiff sollte bei jeder Konzentration von kumulativen Addition (10-5M bis 10-9M), um die Superfusat ausgewertet werden. Jeder Agonist Anwendung sollte durch eine Wäsche-Phase (in der Regel 30 Minuten) mit PSS, bis das Schiff wieder in Ruhe Durchmesser getrennt werden. </li><li> Nach der Auswertung des Schiffes Gesundheit, anschließender vasoaktive Medikamente, Fluoreszenzmarkierung und Zelle Tracing Experimente durchgeführt werden können. </li><li> Nach dem Ende des Experiments wird das Tier eine Überdosis von Natrium-Pentobarbital gegeben. Das Tier wird dann überwacht, um sicherzustellen, dass es keine Antwort auf Zehen klemmen und fehlende Atembewegung oder Herzschlag. Zu diesem Zeitpunkt ist dies durch Genickbruch folgte. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Nach der Equilibrierung Zeit der Vorbereitung sollte Ausbeute ein klares Bild, dass für die Identifizierung der beiden Arteriole und venule, dass die Leiste Lymphknoten liefert ermöglicht. Es sollte minimal Fettzellen um die Gefäße für Wände der Arteriolen und Venen, klar für die Video-Messschieber bis überlagert Gefäßdurchmesser berechnen beobachten zu ermöglichen. Die integrale Punkt für eine erfolgreiche Vorbereitung ist der Arteriole hat eine reiche Blutversorgung bewegt durch das Lumen und dass es ein hohes Maß an Gefäßtonus (dh die Arteriole hat die Fähigkeit, vasoconstrict und vasodilate zu Muskel-und Endothelzellen spezifische Agonisten bzw. glatt) . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Intravital Mikroskopie Bild inguinal Lymphknoten Feed Arteriole (roter Pfeil) Fütterung der Lymphknoten äquilibriert mit physiologischer Kochsalzlösung und läuft an der Seite der Haupt-venule (grüner Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Normale vasoaktiven Reaktion auf superfundiert Phenylephrin (PE) durch kumulative neben physiologischer Kochsalzlösung aus den Konzentrationen 10 -9 M bis 10 -5 M. Die Anwesenheit eines robusten Vasokonstriktion ist suggestive der normalen glatten Muskulatur Funktion in der Arteriole. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Normale vasoaktiven Reaktion auf superfundiert Acetylcholin (ACh) durch kumulative neben physiologischer Kochsalzlösung aus Konzentrationen 10 -9 M bis 10 -5 M. Die Anwesenheit eines robusten Vasodilatation ist suggestive der normalen Endothelfunktion in der Arteriole.

<ol><li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li>
<li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li>
<li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li>
<li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li>
<li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li>
<li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li>
</ol>

Intravitalmikroskopie der Leistengegend Lymphknoten hier vorgestellten bietet die Möglichkeit, Bild Mikrovaskulatur der Lymphknoten in-vivo. So erlaubt es die Mittel der direkten Echtzeit-Beobachtung. Imaging der LN Mikrovaskulatur ist ein einzigartiger Ort, dass man die Schnittstelle zwischen der Immunantwort und das Gefäßsystem untersucht werden können. Mit dieser Vorbereitung kann konzentrieren sich speziell auf die Immunantwort, Veränderungen in den Blutgefäßen, oder Interaktion zwischen den beiden geleitet werden. Wie bei allen experimentellen Ansätzen, hat Standard Intravitalmikroskopie sowohl Vor-und Nachteile. Standard IVM, wie die Vorbereitung hier beschrieben, kann leicht geändert werden, und wurde bereits von den Autoren gezeigt, dass Epifluoreszenzmikroskopie über die Einführung von fluoreszierenden Tracer Farbstoffe oder etikettiert Zellpopulationen ermöglichen. Obwohl Standard IVM nicht gibt die Möglichkeit der dreidimensionalen Bildgebung und Tracing, wie sie durch Zwei-Photonen-Mikroskopie oder Angiographie gegeben werden, wird die Zelle Tracking noch in zwei Dimensionen erreicht so Zell-Zell-und Zell-zu-Gefäßsystem Interaktion zu sein beobachtet und quantifiziert und in Verbindung mit in-vivo-Applikation und anschließender Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern verwendet, um Daten über Protein / Marker Ausdruck in Echtzeit geben. Bemerkenswert ist, benötigen alternative bildgebende Verfahren einer statischen Umgebung für Bilder; Klemmung der OP-Bereich oder die Zugabe von einem Deckglas auf einem flachen Vorbereitung wird häufig benötigt werden. Dies begrenzt, wenn nicht eliminiert, die Fähigkeit zur aktiven perfuse vaskulären oder anderen Vermittlern über die Vorbereitung auf die vaskuläre Integrität und Physiologie etc. oder die Verwendung anderer Techniken wie durchgeführt Vasodilatation Experimente innerhalb der IVM Vorbereitung zu bewerten. Darüber hinaus hat Standard IVM nicht erforderlich, eine völlig ebene Vorbereitung und wird nicht durch Bewegung, wie sie durch die Atmung des Tieres erzeugt betroffen. Dies ermöglicht es Standard IVM in mehr chirurgischen Bereichen mit höherer Reproduzierbarkeit verwendet werden. Dies wird durch die Leisten-Lymphknoten-Vorbereitung hier beschriebene Beispiel. Angesichts der Größe und Form der Lymphknoten, kann das Präparat nicht flach gemacht werden ohne Verletzung des Gewebes und die Lage des Knotens führt zu erheblichen Bewegung durch tierische Atmung. Solche Fragen schwierig sein würde, durch andere Methoden zu überwinden, sind aber leicht mit der Verwendung der Standard-IVM Vorbereitung beschrieben behandelt. Zusammenfassend kann die Herstellung oben beschrieben mit einer beliebigen Anzahl von kombiniert werden andere biochemische-, Gefäß-und / oder immunologischen Techniken wie dem Transfer von Teilmengen aktiviert oder markierten Zellen, die Induktion von Hypoxie und Überexpression von Erschöpfung der vaskulären Mediatoren. Allerdings sind zusätzliche Anwendungen abhängig von der Gesundheit der anfänglichen Vorbereitung. Daher ist es wichtig, immer testen, die Gesundheit der Gefäße wird abgebildet und ausgewertet. Wichtige Punkte zum Erreichen eines Gesundheits-Vorbereitung sind die Gewährleistung der Vorbereitung ständig mit äquilibriert PSS bei Körpertemperatur perfundiert und Minimierung des Kontakts und Stress auf den OP-Bereich während der Operation gelegt.

<a href="https://app.jove.com/t/6652">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/2551">10.3791/2551</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/2551">Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node</a>. The Authors&#160;and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th></tr><tr><td> Natriumbikarbonat </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Kalziumchlorid Dihydrat </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Nitroprussidnatrium </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Phenylephrin </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Acetylcholin </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Magnesium-Chlorid-Heptahydrat </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Sodium Pentobarbitol </td><td></td></tr></tbody></table>

intravitalmikroskopie der leistenbruch lymph node

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymphknoten (LN ist), im ganzen Körper befinden, sind ein integraler Bestandteil des Immunsystems. Sie dienen als Ort für die Induktion der adaptiven Immunantwort und damit die Entwicklung von Effektorzellen. Als solche sind LNs Schlüssel zur Bekämpfung von eindringenden Krankheitserregern und Erhaltung der Gesundheit. Die Wahl des LN zur Studie wird von Zugänglichkeit und das gewünschte Modell diktiert, die inguinalen Lymphknoten ist gut gelegen und leicht unterstützt Studien von biologisch relevanten Modelle von Haut-und Schleimhaut-genitale Infektion. Die inguinalen LN, wie alle LNS, verfügt über ein umfangreiches Netzwerk mikrovaskuläre Versorgung mit Blut. In der Regel enthält diese mikrovaskulären Netzwerk der wichtigsten Futtermittel Arteriole der LN, die später Zweige und hohe Venolen (HEV) speist. HEVs sind zur Erleichterung des Handels von Immunzellen in der LN während der beiden Homöostase und Infektionen spezialisiert. Wie HEVs regulieren Menschenhandel in die LN im Rahmen dieser beiden Umstände ist ein Gebiet intensiver Forschung. Die LN-Feeds Arteriole, hat einen direkten Einfluss auf die vorgelagerten HEVs und ist der wichtigste Nährstoff-und Zell-reiches Blut in den LN. Darüber hinaus werden Änderungen im Futter Arteriole bei der Erleichterung Induktion der adaptiven Immunantwort beteiligt. Die LN Mikrovaskulatur hat offensichtliche Bedeutung in der Aufrechterhaltung einer optimalen Durchblutung der LN und Regulierung von Immunzellen Einstrom in die LN, die entscheidenden Elemente in der richtigen Funktion LN und anschließend Immunantwort sind. Die Fähigkeit, die LN Mikrovaskulatur in-vivo-Studie ist der Schlüssel zur Aufklärung, wie das Immunsystem und die Mikrovaskulatur und interagieren beeinflussen sich gegenseitig innerhalb der LN. Hier präsentieren wir eine Methode zur in-vivo-Bildgebung des inguinal Lymphknoten. Wir konzentrieren uns auf die Abbildung der Mikrovaskulatur der LN, wobei besonderes Augenmerk auf Methoden, die die Studie mit gesunden Gefäßen, die Fähigkeit zur Bildgebung von lebensfähigen Schiffe über mehrere Stunden halten und die Quantifizierung des Schiffes Größenordnung zu gewährleisten. Methoden für die Durchblutung der Mikrovaskulatur mit vasoaktiven Medikamenten sowie das Potenzial, zu verfolgen und zu quantifizieren zelluläre Verkehr werden ebenfalls vorgestellt. Intravitalmikroskopie der Leistengegend LN erlaubt die direkte Auswertung der mikrovaskulären Funktion und Echtzeit-Schnittstelle der direkte Schnittstelle zwischen Immunzellen, die LN und die Mikrozirkulation. Diese Technik Potenzial, mit vielen immunologischen Techniken und fluoreszierende Markierung von Zellen als auch manipuliert werden, um Gefäßsystem anderer LNs Studie kombiniert werden.

Eine Technik für die Durchführung Intravitalmikroskopie der Leistengegend Lymphknoten (LN) wird skizziert. Solche Technik ermöglicht in Echtzeit,<em&gt; In vivo</em&gt; Studium der Lymphknoten Mikrovaskulatur und Struktur sowohl während der Homöostase und Infektionen. Diese Technik kann die Zelle des Menschenhandels Studien und andere Lymphknotenstationen angepasst werden.

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Lymphknoten (LN), die im gesamten Körper verteilt sind, bilden eine wesentliche Komponente des Immunsystems. Sie dienen als Ort für die Induktion der adaptiven Immunantwort ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die arterielle Versorgung des Leistenlymphknotens in vivo zu visualisieren und zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Hautlappen durch sorgfältige Dissektion der Haut im Leistenbereich der Maus angelegt wird, wodurch der Leistenlymphknoten freigelegt wird. Anschließend wird das überliegende Bindegewebe des Lymphknotengebiets abgelöst. Anschließend muss das umgebende Fettgewebe entfernt werden, um die versorgenden arteriellen Blutgefäße des Lymphknotens freizulegen. Schließlich werden Veränderungen in der Lymphknotengefäßerung mittels intravitale Mikroskopie P visualisiert und bewertet. Obwohl die hier gezeigte Präparation die Mikrozirkulation des inguinalen Lymphknotens betrifft, können die chirurgischen Techniken ebenfalls für andere Präparationen, wie beispielsweise Skelettmuskel sowie Gehirn, verwendet werden.Im Allgemeinen haben neue Anwender bei dieser Technik aus zwei Hauptgründen Schwierigkeiten. Erstens, weil man mit einem lebenden Tier arbeitet, und zweitens, weil man an einem sehr kleinen Bereich operiert, sodass jegliche Störungen des Gefäßes selbst oder des umgebenden Bereichs negative Auswirkungen haben können, die dem Experiment, das man durchführen möchte, schaden würden. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend für den Erfolg.Es gibt eine Reihe komplexer Schritte, die beteiligt sind und sich nicht sehr gut aus dem Text in die praktische Durchführung der Technik übertragen lassen. Um sie korrekt durchzuführen, ist es wichtig, sie gesehen zu haben. Mit großem Erfolg.Das Maus wird zunächst anästhesiert und der Operationsbereich rasiert. Einzelheiten finden Sie im Textmanuskript. Anschließend kann die Maus in Rückenlage auf ein durchsichtiges Operationsbrett platziert werden.Befestigen Sie die Maus an der Platte, indem Sie jede Fußsohle mit Klebeband fixieren. Am Tag vor dem Experiment mischen Sie dass guard 180 4 gemäß den Herstelleranweisungen. Gießen Sie die Mischung dann unter Verwendung einer standardmäßigen Einweg-Petrischale als Form auf eine Tiefe von etwa einem Viertel Zoll und lassen Sie sie über Nacht aushärten. Entfernen Sie dass guard aus der Petrischale und platzieren Sie es auf der Operationsplatte.Platzieren Sie die rasierte, anästhetisierte Maus unter dem Dissektionsmikroskop. Führen Sie mit Hilfe von chirurgischen Pinzetten Größe 5 aus rostfreiem Stahl und einer Schere mit geraden Klingen einen medianen Schnitt entlang der Bauchseite durch. Setzen Sie dann den medianen Schnitt diagonal in Richtung der Gliedmaßen fort und klappen Sie die Haut in Richtung des massiven Wirbelsäulenknochens zurück.Sobald der ln leicht sichtbar ist, fixieren Sie die zurückgezogene Haut mit Edelstahl-Insektennadeln und Inox-Epoxidharz-beschichteten Pinzetten auf dem Cigar 180 4 Pedestal. Geben Sie physiologische Kochsalzlösung oder PSS in den Bereich.Entfernen Sie anschließend die dünne Schicht des Bindegewebes, das den Bereich um den LK bedeckt. Heben Sie mit einer Pinzette vorsichtig kleine Stücke des Bindegewebes an und dissezieren Sie sie vom LK ab. Entfernen Sie dann mit einer Scherenpinzette das Fettgewebe, das den LK überlagert und umgibt, bis das mikrovaskuläre Bett freigelegt ist.Für diesen Schritt ist es wichtig, sorgfältig darauf zu achten, niemals mit den chirurgischen Instrumenten die Gefäße von Interesse zu berühren oder die Gefäße durch zu starken Druck beim Bearbeiten des umgebenden Gewebes zu verletzen. Das Fett wird am besten vom Lymphknoten (ln) entfernt, indem man das Bindegewebe löst, das Fettgewebe mit einer Pinzette zusammenhält und anschließend vorsichtig das Fettgewebe entfernt, bis das Sichtfeld frei ist. Sobald das Bindegewebe und das Fettgewebe entfernt wurden, können das angrenzende Hauptarteriensegment neben dem Lymphknoten und die darüber verlaufende Begleitvene sichtbar gemacht werden.Nachdem das gewünschte Gefäßsegment unter dem Dissektionsmikroskop freigelegt wurde, befestigen Sie die Präparation am intravitalem Mikroskop. Richten Sie die Überleitungs- und Absaugungsleitungen ein. Während dieses Teils des Verfahrens ist es entscheidend, dass das exponierte Gewebe stets mit der äquilibrierten PSS-Lösung überleitet wird.Die Überperfusion mit PSS erfolgt durch Schwerkraft. Die Zufuhr erfolgt von einem Ausgangsreservoir in ein mit Wasser beheiztes Reservoir, das mit 5 % Kohlendioxid in Stickstoff durchströmt wird, und dann über eine Tropfleitung mit einer Rate von 10 Milliliter pro Minute. Eine Absaugleitung sollte verwendet werden, um die überperfundierte PSS kontinuierlich aus der Präparation herauszuziehen, indem sie am unteren Ende des Hautlappens platziert wird. Anschließend sollten die Temperatur des zirkulierenden Wasserbades und die Rate der PSS-Überperfusion überprüft und so eingestellt werden, dass eine optimale Temperatur von etwa 36 Grad Celsius erreicht wird.Während der Vorbereitung die Gefäße mindestens 60 Minuten lang mit PSS equilibrieren lassen. Sicherstellen, dass das Tier mittels eines Rektalthermometers keine Hypothermie entwickelt, und eine externe Wärmelampe bereitstellen. Während das PSS equilibriert, den Gefäßdurchmesser quantifizieren.Verwenden Sie die Video-Calliper zu mehreren Zeitpunkten, um sicherzustellen, dass sich das Gefäß stabilisiert hat; Stabilisierung wird definiert als konstante Durchmesserausdehnung innerhalb von fünf Mikrometern über einen Zeitraum von 20 Minuten. Die Durchmesser-Messungen werden mithilfe der Chart-Lab-Software auf einem Computer aufgezeichnet. Nach der Equilibrierungsphase bewerten Sie die Gesundheit des Gefäßes unter Verwendung eines glattmuskelspezifischen Agonisten wie Phenylephrin, wie hier mit Phenylephrin gezeigt.Fügen Sie den Agonisten dem Suse hinzu. Acht Agonisten sollten bei jedem dekadischen Anstieg der kumulativen Agonistenkonzentration evaluiert werden, während dieser zwischen den Applikationen jedes Agonisten dem SUP-Schicksal hinzugefügt wird. Eine Waschphase unter Verwendung von PSS sollte 30 Minuten lang durchgeführt werden oder bis das Gefäß wieder den Ruhe-Durchmesser erreicht hat.Hier sind repräsentative Ergebnisse eines inguinalen LK nach der Equilibrationphase. Die Perfusion der Arteria mit physiologischer Kochsalzlösung ergibt ein klares Bild, das die Identifizierung sowohl der hier durch den roten Pfeil gekennzeichneten Zufuhrarterie als auch der durch den grünen Pfeil gekennzeichneten Vene ermöglicht, die den inguinalen Lymphknoten versorgen. Der Graph zeigt eine typische vasomotorische Reaktion einer inguinalen LK-Arterie auf die kumulative Zugabe von SUP-fusiertem Phenylephrin zur physiologischen Kochsalzlösung.Im Konzentrationsbereich von 10 hoch minus neun Mol pro Liter bis 10 hoch minus fünf Mol pro Liter deutet das Vorhandensein einer starken Vasokonstriktion auf eine normale glatte Muskelaktivität in der Arterie hin. In diesem Diagramm ist eine typische vasomotorische Reaktion auf sukzessive hinzugefügtes Acetylcholin in physiologischer Kochsalzlösung dargestellt. Der Konzentrationsbereich von 10 hoch minus neun Mol pro Liter bis 10 hoch minus fünf Mol pro Liter wird gezeigt.Das Vorhandensein einer starken Vasodilatation deutet auf eine normale endotheliale Funktion in der Arterie hin. Bei der Durchführung dieser Vorbereitung ist es wichtig, Störungen des Gefäßes und des umgebenden Bereichs so gering wie möglich zu halten, um den Erfolg zu maximieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden eingeführt werden, wie beispielsweise die Fluoreszenz, um weitere zelluläre Funktionen wie den Zellverkehr zu untersuchen.Nach der Entwicklung dieser Technik hat sie den Weg geebnet, um die Bereiche der Immunologie und der Gefäßbiologie zu einem neuen Fachgebiet der vaskulären Immunologie zu verbinden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Jüngste Fortschritte in der 2-Photonen-Mikroskopie sind in Echtzeit...

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Kürzlich entwickelte Bildgebungsverfahren mittels Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) kann helfen erläutern die Rolle spielt das Lymphsystem in Krebsmetastasen, Immunantwort, Wundheilung und anderen lymphatischen-assoziierten Krankheiten.

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

In diesem Video demonstrieren wir die Technik zur Abbildung des Leistenlymphknotens in einem Mausmodell mit Hilfe von Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung. Dieses nicht-invasive bildgebende Verfahren ermöglicht die Überwachung der Veränderung des Lymphknotenvolumens beim Tier im Laufe der Zeit.

Analyse des Leistenlymphknotenvolumens der Maus: Ein ultrahochfrequentes Ultraschallbildgebungsverfahren zur Bestimmung des Volumens des Leistenlymphknotens im Mausmodell

Dieses Video zeigt die Visualisierung von γδ intraepithelialen Lymphozyten (IELs) in transgenen Mäusen mittels konfokaler Mikroskopie. Der chirurgische Eingriff besteht darin, eine Perforationslinie zu schaffen und einen Längsschnitt zu machen, um die Darmschleimhaut und die Zotten freizulegen. Die transgenen Mäuse exprimieren Reporterproteine ausschließlich in γδ IELs, was ihre Verfolgung ermöglicht. Die intravitale Bildgebung erfasst die dynamische Bewegung von grün fluoreszenzmarkierten γδ...

Intravitale Visualisierung von intraepithelialen Gamma-Delta-Lymphozyten

Dieses Video zeigt das chirurgische Isolierungsverfahren des leistendrainierenden Lymphknotens aus einem Mausmodell. Der Schnitt in der Bauchregion ermöglicht den Zugang zum Leistenlymphknoten, der operativ entnommen wird. Der entnommene durchscheinende leistende Lymphknoten kann für immunologische Untersuchungen verwendet werden.

Entnahme eines inguinalen drainierenden Lymphknotens aus einem Mausmodell

Hochauflösende intravitalen Bildgebung mit Kontrastverstärkung von bis zu 120 &amp;mgr; m Tiefe in Lymphknoten von erwachsenen Mäusen durch räumliches Modulieren des Erregungsmusters einer multifokalen Zwei-Photonen-Mikroskop erreicht. In 100 um Tiefe gemessen wir Auflösungen von 487 nm (lateral) und 551 nm (axial) und damit umgehen, Streuung und Beugung Grenzen.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um verschiedene Zellpopulationen in entwässernden Lymphknoten ohne Veränderungen in der Organstruktur abzubilden.

Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Wir beschreiben eine Methode zur Visualisierung von GFP-markierten IELs mit intravitaler Bildgebung des murinen Dünndarms durch invertierte Konfokalmikroskopie der Spinnscheibe. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung von lebenden Zellen innerhalb der Schleimhaut für bis zu 4 h und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von darmen immun-epitheliale Wechselwirkungen zu untersuchen.

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm

Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.

Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie

Melanom ist eine sehr aggressive Krankheit, die sich schnell auf andere Organe ausbreitet. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung in Verbindung mit 3D-Rendering zur Überwachung des Volumens der Leistenlymphknoten im Braf/Pten-Mausmodell des metastasierenden Melanoms.

Analyse des Lymphknotenvolumens mittels Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung im gentechnisch veränderten Mausmodell des Melanoms von Braf/Pten

Lernen Sie die Intravitalmikroskopie der Leistenlymphknoten bei Mäusen für die Untersuchung der Mikrozirkulation in vivo. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Visualisierung von Gefäßreaktionen und Zelltrafficking.

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

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