Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die arterielle Versorgung des Leistenlymphknotens in vivo zu visualisieren und zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Hautlappen durch sorgfältige Dissektion der Haut im Leistenbereich der Maus angelegt wird, wodurch der Leistenlymphknoten freigelegt wird. Anschließend wird das überliegende Bindegewebe des Lymphknotengebiets abgelöst.

Anschließend muss das umgebende Fettgewebe entfernt werden, um die versorgenden arteriellen Blutgefäße des Lymphknotens freizulegen. Schließlich werden Veränderungen in der Lymphknotengefäßerung mittels intravitale Mikroskopie P visualisiert und bewertet. Obwohl die hier gezeigte Präparation die Mikrozirkulation des inguinalen Lymphknotens betrifft, können die chirurgischen Techniken ebenfalls für andere Präparationen, wie beispielsweise Skelettmuskel sowie Gehirn, verwendet werden.

Im Allgemeinen haben neue Anwender bei dieser Technik aus zwei Hauptgründen Schwierigkeiten. Erstens, weil man mit einem lebenden Tier arbeitet, und zweitens, weil man an einem sehr kleinen Bereich operiert, sodass jegliche Störungen des Gefäßes selbst oder des umgebenden Bereichs negative Auswirkungen haben können, die dem Experiment, das man durchführen möchte, schaden würden. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend für den Erfolg.

Es gibt eine Reihe komplexer Schritte, die beteiligt sind und sich nicht sehr gut aus dem Text in die praktische Durchführung der Technik übertragen lassen. Um sie korrekt durchzuführen, ist es wichtig, sie gesehen zu haben. Mit großem Erfolg.

Das Maus wird zunächst anästhesiert und der Operationsbereich rasiert. Einzelheiten finden Sie im Textmanuskript. Anschließend kann die Maus in Rückenlage auf ein durchsichtiges Operationsbrett platziert werden.

Befestigen Sie die Maus an der Platte, indem Sie jede Fußsohle mit Klebeband fixieren. Am Tag vor dem Experiment mischen Sie dass guard 180 4 gemäß den Herstelleranweisungen. Gießen Sie die Mischung dann unter Verwendung einer standardmäßigen Einweg-Petrischale als Form auf eine Tiefe von etwa einem Viertel Zoll und lassen Sie sie über Nacht aushärten. Entfernen Sie dass guard aus der Petrischale und platzieren Sie es auf der Operationsplatte.

Platzieren Sie die rasierte, anästhetisierte Maus unter dem Dissektionsmikroskop. Führen Sie mit Hilfe von chirurgischen Pinzetten Größe 5 aus rostfreiem Stahl und einer Schere mit geraden Klingen einen medianen Schnitt entlang der Bauchseite durch. Setzen Sie dann den medianen Schnitt diagonal in Richtung der Gliedmaßen fort und klappen Sie die Haut in Richtung des massiven Wirbelsäulenknochens zurück.

Sobald der ln leicht sichtbar ist, fixieren Sie die zurückgezogene Haut mit Edelstahl-Insektennadeln und Inox-Epoxidharz-beschichteten Pinzetten auf dem Cigar 180 4 Pedestal. Geben Sie physiologische Kochsalzlösung oder PSS in den Bereich.

Entfernen Sie anschließend die dünne Schicht des Bindegewebes, das den Bereich um den LK bedeckt. Heben Sie mit einer Pinzette vorsichtig kleine Stücke des Bindegewebes an und dissezieren Sie sie vom LK ab. Entfernen Sie dann mit einer Scherenpinzette das Fettgewebe, das den LK überlagert und umgibt, bis das mikrovaskuläre Bett freigelegt ist.

Für diesen Schritt ist es wichtig, sorgfältig darauf zu achten, niemals mit den chirurgischen Instrumenten die Gefäße von Interesse zu berühren oder die Gefäße durch zu starken Druck beim Bearbeiten des umgebenden Gewebes zu verletzen. Das Fett wird am besten vom Lymphknoten (ln) entfernt, indem man das Bindegewebe löst, das Fettgewebe mit einer Pinzette zusammenhält und anschließend vorsichtig das Fettgewebe entfernt, bis das Sichtfeld frei ist. Sobald das Bindegewebe und das Fettgewebe entfernt wurden, können das angrenzende Hauptarteriensegment neben dem Lymphknoten und die darüber verlaufende Begleitvene sichtbar gemacht werden.

Nachdem das gewünschte Gefäßsegment unter dem Dissektionsmikroskop freigelegt wurde, befestigen Sie die Präparation am intravitalem Mikroskop. Richten Sie die Überleitungs- und Absaugungsleitungen ein. Während dieses Teils des Verfahrens ist es entscheidend, dass das exponierte Gewebe stets mit der äquilibrierten PSS-Lösung überleitet wird.

Die Überperfusion mit PSS erfolgt durch Schwerkraft. Die Zufuhr erfolgt von einem Ausgangsreservoir in ein mit Wasser beheiztes Reservoir, das mit 5 % Kohlendioxid in Stickstoff durchströmt wird, und dann über eine Tropfleitung mit einer Rate von 10 Milliliter pro Minute. Eine Absaugleitung sollte verwendet werden, um die überperfundierte PSS kontinuierlich aus der Präparation herauszuziehen, indem sie am unteren Ende des Hautlappens platziert wird. Anschließend sollten die Temperatur des zirkulierenden Wasserbades und die Rate der PSS-Überperfusion überprüft und so eingestellt werden, dass eine optimale Temperatur von etwa 36 Grad Celsius erreicht wird.

Während der Vorbereitung die Gefäße mindestens 60 Minuten lang mit PSS equilibrieren lassen. Sicherstellen, dass das Tier mittels eines Rektalthermometers keine Hypothermie entwickelt, und eine externe Wärmelampe bereitstellen. Während das PSS equilibriert, den Gefäßdurchmesser quantifizieren.

Verwenden Sie die Video-Calliper zu mehreren Zeitpunkten, um sicherzustellen, dass sich das Gefäß stabilisiert hat; Stabilisierung wird definiert als konstante Durchmesserausdehnung innerhalb von fünf Mikrometern über einen Zeitraum von 20 Minuten. Die Durchmesser-Messungen werden mithilfe der Chart-Lab-Software auf einem Computer aufgezeichnet. Nach der Equilibrierungsphase bewerten Sie die Gesundheit des Gefäßes unter Verwendung eines glattmuskelspezifischen Agonisten wie Phenylephrin, wie hier mit Phenylephrin gezeigt.

Fügen Sie den Agonisten dem Suse hinzu. Acht Agonisten sollten bei jedem dekadischen Anstieg der kumulativen Agonistenkonzentration evaluiert werden, während dieser zwischen den Applikationen jedes Agonisten dem SUP-Schicksal hinzugefügt wird. Eine Waschphase unter Verwendung von PSS sollte 30 Minuten lang durchgeführt werden oder bis das Gefäß wieder den Ruhe-Durchmesser erreicht hat.

Hier sind repräsentative Ergebnisse eines inguinalen LK nach der Equilibrationphase. Die Perfusion der Arteria mit physiologischer Kochsalzlösung ergibt ein klares Bild, das die Identifizierung sowohl der hier durch den roten Pfeil gekennzeichneten Zufuhrarterie als auch der durch den grünen Pfeil gekennzeichneten Vene ermöglicht, die den inguinalen Lymphknoten versorgen. Der Graph zeigt eine typische vasomotorische Reaktion einer inguinalen LK-Arterie auf die kumulative Zugabe von SUP-fusiertem Phenylephrin zur physiologischen Kochsalzlösung.

Im Konzentrationsbereich von 10 hoch minus neun Mol pro Liter bis 10 hoch minus fünf Mol pro Liter deutet das Vorhandensein einer starken Vasokonstriktion auf eine normale glatte Muskelaktivität in der Arterie hin. In diesem Diagramm ist eine typische vasomotorische Reaktion auf sukzessive hinzugefügtes Acetylcholin in physiologischer Kochsalzlösung dargestellt. Der Konzentrationsbereich von 10 hoch minus neun Mol pro Liter bis 10 hoch minus fünf Mol pro Liter wird gezeigt.

Das Vorhandensein einer starken Vasodilatation deutet auf eine normale endotheliale Funktion in der Arterie hin. Bei der Durchführung dieser Vorbereitung ist es wichtig, Störungen des Gefäßes und des umgebenden Bereichs so gering wie möglich zu halten, um den Erfolg zu maximieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden eingeführt werden, wie beispielsweise die Fluoreszenz, um weitere zelluläre Funktionen wie den Zellverkehr zu untersuchen.

Nach der Entwicklung dieser Technik hat sie den Weg geebnet, um die Bereiche der Immunologie und der Gefäßbiologie zu einem neuen Fachgebiet der vaskulären Immunologie zu verbinden.