Die Beurteilung Signaling Eigenschaften von ektodermale Epithel Während Craniofacial Entwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, chimäre Embryonen zu erzeugen, indem Ektoderm von Spenderembryonen in den sich entwickelnden Oberkiefer von Hühnerembryonen transplantiert wird. Dies wird erreicht, indem zunächst die Spenderhaut für die Transplantation entnommen wird. Dann wird die Wirtsstelle für die Transplantation vorbereitet.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Spendergewebe auf der Wirtsstelle zu platzieren und das Transplantat in Position zu bringen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine ausschließliche Transplantation des Spenderektoderms zeigen, und durch molekulare und morphologische Analyse kann die Funktion des Spender-Recodderms bestimmt werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung der Rolle verschiedener Gewebe während der Morphogenese.

Das Verfahren wird von Dr. Diane demonstriert, einer leitenden Prüfärztin aus unserem Labor. Bevor Sie mit diesem Vorgang beginnen, bereiten Sie das Medium vor und stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen Lösungen zugänglich sind und die richtige Temperatur haben. Ziehen Sie dann unter angemessenem Augenschutz Mikrokapillarröhrchen zu einer feinen Spitze über eine Alkoholflamme.

Um Glasnadeln herzustellen, schärfen Sie Wolframnadeln, indem Sie sie in die Flamme eines Propanbrenners halten. Beginnen Sie mit der Entnahme des Spenderembryos aus der Schale, indem Sie ein Stück Klebeband über das Ende der Eizelle legen. Schale dann mit der Spitze einer Seziernadel ein kleines Loch in der Mitte des Bandes erzeugen.

Führen Sie eine 10-Milliliter-Spritze und eine 18-Gauge-Injektionsnadel in das Loch ein und entfernen Sie einen Milliliter Albumin aus dem Ei. Stechen Sie dann mit einer Seziernadel ein kleines Loch in die Oberseite der Schale. Lege ein zweites Stück Klebeband an, um dieses Loch abzudecken.

Schneide mit zwei Pinzetten eine kreisförmige Öffnung in das Ei. Fassen Sie den Embryo und legen Sie ihn zum Waschen in eine Schüssel mit eiskaltem PBS. Nachdem der Kopf des Embryos entfernt wurde, legen Sie ihn in eine Gewebekulturschale mit serumfreiem DMEM bei Raumtemperatur.

Stellen Sie die Schale unter das Präpariermikroskop, während Sie den Kopf mit einer Pinzette festhalten. Verwenden Sie eine Federschere, um den Oberkiefer und den Lagon grob vom Rest des Kopfes zu trennen. Schneiden Sie dann mit einem Klingenhalter mit einer scharfen Rasierklinge den vorderen Nasenfortsatz vom Oberkiefer ab.

Verwenden Sie eine Pipette, um den Fronton-Nasenfortsatz in eine 30-Millimeter-Petrischale zu übertragen, die ein ausreichendes Volumen an Diss in PBS enthält, und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang auf Eis. Nach Ablauf der Inkubationszeit die Dispa-Lösung aspirieren, ohne das Gewebe zu stören. Decken Sie dann das Taschentuch vollständig mit DMEM ab, das 1%BSA enthält.

Um die Verdauung zu stoppen, geben Sie das Gewebe in eine neue Kulturschale. Dann unter dem Präpariermikroskop arbeiten. Halten Sie das Taschentuch mit einer ungeschärften Wolframnadel mit einer geschärften Wolframnadel fest.

Trennen Sie das Ektoderm, indem Sie es von den anderen Geweben abziehen. Lagern Sie das Transplantatgewebe nach der Vorbereitung in DMEM mit BSA auf Eis, bis der Wirt für die Transplantation bereit ist. Erstellen Sie mit der zuvor gezeigten Methode ein Fenster im Hühnerei.

Legen Sie die Eizelle, mit der sich der Embryo befindet, mit zwei Pinzettenpaaren unter das Präpariermikroskop. Fassen Sie die IGN-Membran und das Amnion und reißen Sie sie vorsichtig auf, um ein Loch zu machen und den Wirtsembryo freizulegen. Drehen Sie den Kopf, indem Sie eine Pinzette auf das rechte Auge legen und Druck ausüben, während Sie den Kopf ruhig halten.

Verwenden Sie eine Zunge und eine Nadel, um die Wirtshaut zu entfernen, um das Transplantat aufzunehmen. Geben Sie zwei Mikroliter Neutralrot in die Petrischale, die die vorbereiteten Transplantate enthält. Verwenden Sie eine Glaspipette, um das Transplantat auf den Wirt zu übertragen.

Platzieren Sie das Transplantat so, dass es das entfernte Ektoderm ersetzt. Führen Sie in jede Ecke des transplantierten Gewebes einen Glasstift ein, um das Transplantat nach der Transplantation an Ort und Stelle zu halten. Verschließen Sie das Fenster fest mit Klebeband.

Bringen Sie den Embryo bis zum erforderlichen Entwicklungsstadium für die Analyse in den Inkubator zurück. Dieses Bild zeigt Gewebe eines Wachtelkükens URA, das mit anti-Q-C-P-N-A-Wachtel-spezifischen Antikörpern gefärbt wurde. Das transplantierte Gewebe befindet sich zwischen den beiden Pfeilen. Es gibt keine Hinweise auf eine QCPN-Färbung in dem meen-artigen Gewebe von einem Mausküken-Glockenspielspiegel. Auch hier befindet sich das transplantierte Gewebe zwischen den beiden Pfeilen in C zwei Hybridisierung mit genehmigter spezifisch für das Zeichen B zwei repetitive Sequenz.

Bei der Spiegelung von Genen der ersten Klasse zeigt sich, dass die Expression des Zeichens B zwei auf das Ome beschränkt ist, das das hier gezeigte Transplantat umfasst, als ein Bild eines Wachtelküken-Glockenspiegels, der trichromgefärbt wurde; trichrome Färbung macht Kollagen und Knochen blau. Die Duplikation des Oberkieferskeletts ist durch den Pfeil angedeutet zu sehen. Dieses Bild zeigt einen Mausküken-Glockenspielspiegel, der wieder dreifarbig gebeizt wurde.

Es ist eine Duplikation des Oberkieferskeletts zu sehen. Dieses Bild zeigt die Radioaktivität in C zwei Hybridisierung der normalen BMP 7-Expression in der Mechy eines geflößten Hühnerembryos, hier gezeigt ist Gewebe aus einem Maus-Küken-Glockenspielspiegel. Es ist zu erkennen, dass die BMP 7-Expression in der Mechy neben dem Transplantat induziert wird, wie durch den Pfeil angezeigt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hühnerembryonen manipuliert, um Mechanismen zu beurteilen, die die Entwicklung des Vorder- und Nasenfortsatzes regulieren.