Die Beurteilung Signaling Eigenschaften von ektodermale Epithel Während Craniofacial Entwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, chimäre Embryonen zu erzeugen, indem Ektoderm von Donorembrionen in den sich entwickelnden Oberkiefer von Hühnerembryonen transplantiert wird. Dies wird erreicht, indem zunächst das zu transplantierende Donorderm entfernt wird. Anschließend wird die Wirtsstelle für die Einpflanzung vorbereitet.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Spendergewebe auf die Empfängerstelle zu setzen und das Transplantat in Position zu fixieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine ausschließliche Einheilung des Spenderectoderms zeigen, und durch molekulare sowie morphologische Analysen kann die Funktion des Spenderectoderms bestimmt werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung der Rolle verschiedener Gewebe während der Morphogenese.

Den Versuch wird Dr. Diane durchführen, eine leitende Wissenschaftlerin aus unserem Labor. Bevor Sie mit dem Versuch beginnen, bereiten Sie das Medium vor und stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen Lösungen verfügbar sind und die richtige Temperatur aufweisen. Ziehen Sie anschließend unter Verwendung eines geeigneten Augenschutzes Mikrokaptillröhrchen über einer Alkoholflamme zu einer feinen Spitze.

Um Glasnadeln herzustellen, halten Sie Wolframnadeln in die Flamme einer Propanbrennerflamme, um sie zu spitzen. Beginnen Sie die Entnahme des Donorembryos aus der Eischale, indem Sie ein Stück Klebeband über das Ende des Eies legen. Schlagen Sie dann mit der Spitze einer Präpariernadel ein kleines Loch in die Mitte des Klebebands.

Fügen Sie eine 10-Milliliter-Spritze und eine Hohlnadel mit 18 Gauge in das Loch ein und entnehmen Sie ein Milliliter Albumin aus dem Ei. Anschließend machen Sie mit einer Präpariernadel ein kleines Loch an der Oberseite der Schale. Bringen Sie ein zweites Stück Klebeband an, um dieses Loch abzudecken.

Schneiden Sie mit zwei Pinzetten eine kreisförmige Öffnung in das Ei. Greifen Sie den Embryo und legen Sie ihn zur Wäsche in eine Schale mit eiskalter PBS. Nachdem der Kopf des Embryos entfernt wurde, legen Sie ihn in eine Zellkulturschale, die DMEM ohne Serum bei Raumtemperatur enthält.

Platzieren Sie die Schale unter dem Stereomikroskop, während Sie den Kopf mit einer Pinzette halten. Verwenden Sie Feder-Scheren, um den Oberkiefer und das Lagon grob vom restlichen Kopf zu trennen. Anschließend schneiden Sie mithilfe eines Klingenhalters mit scharfer Rasierklinge den frontalen Nasenfortsatz vom Oberkiefer ab.

Überführen Sie den frontonasalen Fortsatz mit einer Pipette in eine 30 Millimeter große Petrischale, die ein ausreichendes Volumen an Diss in PBS enthält, und inkubieren Sie die Probe 20 Minuten auf Eis. Nach Ablauf der Inkubationszeit aspirieren Sie die Dispa-Lösung, ohne das Gewebe zu stören. Anschließend bedecken Sie das Gewebe vollständig mit DMEM, das 1 % BSA enthält.

Um die Verdauung zu stoppen, überführen Sie das Gewebe in eine neue Kulturschale. Arbeiten Sie dann unter einem Stereomikroskop. Halten Sie das Gewebe mit einer ungeschärften Wolframeißel, indem Sie eine geschärfte Wolframeißel verwenden.

Trennen Sie das Ektoderm ab, indem Sie es von den anderen Geweben ablösen. Bewahren Sie das Transplantat nach der Vorbereitung in DMEM mit BSA auf Eis auf, bis der Wirt für die Transplantation bereit ist. Erstellen Sie mit der zuvor demonstrierten Methode ein Fenster im Hühnerei.

Platzieren Sie das Ei mit dem Embryo unter dem Stereomikroskop mit Hilfe von zwei Pinzettenpaaren. Greifen Sie die IGN-Membran und das Amnion und reißen Sie vorsichtig, um ein Loch zu erzeugen und den Wirtsembryo freizulegen. Drehen Sie den Kopf, indem Sie eine Pinzette auf das rechte Auge setzen und Druck ausüben, während Sie den Kopf stabil halten.

Verwenden Sie eine Zange und eine Nadel, um die Wirtshaut zu entfernen, um Platz für die Transplantation zu schaffen. Geben Sie zwei Mikroliter Neutralrot in die Petrischale, die die vorbereiteten Transplantate enthält. Überführen Sie das Transplantat mit einer Glaspipette auf den Wirt.

Platzieren Sie die Transplantat, um das entfernte Ektoderm zu ersetzen. Führen Sie eine Glasnadel in jede Ecke des Transplantats ein, um das Transplantat nach der Transplantation an Ort und Stelle zu fixieren. Schließen Sie das Fenster mit Klebeband fest.

Bringen Sie das Embryo in den Inkubator zurück, bis der für die Analyse erforderliche Entwicklungsstadium erreicht ist. Dieses Bild zeigt Gewebe von einem Wachtel-Embryo aus einer URA, das mit einem gegen Q-C-P-N-A gerichteten, wachtelspezifischen Antikörper gefärbt wurde. Das transplantierte Gewebe befindet sich zwischen den beiden Pfeilen. Es gibt keine Nachweise für QCPN-Färbung im mittleren Keimblattgewebe eines Maus-Wachtel-Chimären-Embryos, das hier gezeigt wird. Auch hier befindet sich das transplantierte Gewebe zwischen den beiden Pfeilen. In C erfolgte die Hybridisierung mit einem gegen die Signatur B zwei repetitive Sequenz gerichteten Sonden.

Die Spiegelung von Klasse-eins-Genen zeigt, dass die Expression von Signatur B zwei auf das Ome beschränkt ist, das das hier als Bild eines Wachtel-Huhn-Chimären-Spiegels dargestellte Transplantat umfasst, das trichrom gefärbt wurde. Die Trichrom-Färbung färbt Kollagen und Knochen blau. Eine Verdopplung des Oberkiefer-Skeletts ist wie durch den Pfeil angezeigt zu erkennen. Dieses Bild zeigt erneut einen maus-Huhn-Chimären-Spiegel, der trichrom gefärbt wurde.

Es ist eine Verdopplung des Oberkiefer-Skeletts zu sehen. Dieses Bild zeigt die radioaktive In-situ-Hybridisierung der normalen BMP7-Expression in der Mesenchymsubstanz eines chimären Hühnerembryos. Das dargestellte Gewebe stammt von einer Maus-Huhn-Chimäre. Man erkennt, dass die BMP7-Expression im Mesenchym benachbart zur Transplantation, wie durch den Pfeil angezeigt, induziert wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Hühnerembryonen manipuliert werden können, um Mechanismen zu untersuchen, die die Entwicklung des Frontal- und Nasenbereichs regulieren.